菌株的无机盐液体培养基中加入丙酮-苯并芘母液，使苯并芘的终浓度达到5 mg/Lo在转速150 r/min、温度28 °C的条件下振荡培养12天，同时设不接菌对照。用紫外分光光度计分别在300 nm波长处测定其吸光度，在标准曲线上计算出样品中剩余的苯并芘含量。
[0015]四、并芘降解率的计算方法
利用标准曲线计算样品中剩余苯并芘的含量，再利用公式C=(a-b)/aX 计算降解率。其中c为降解率为空白样品中苯并芘的含量；b为处理后剩余苯并芘的含量。
[0016]2结果与分析
以苯并芘为唯一碳源从焦化厂周边耕地耕层土壤和废水中筛选出18株降解菌，命名为 Al- A18。
[0017]2.1苯并芘降解率测定
对Al- A18分别进行苯并芘降解率测定，其中A18的降解标准曲线如图1所示由图1可知，实验得到苯并芘浓度在1.0?3.0 mg/ L的范围内呈良好线形关系。对样品的吸光度值测定，样品的吸光度值为0.069，对照为0.135。用标准曲线的y = 0.4248x-0.1016计算得出对照的降解率(a)为0.557，样品的降解率(b)为0.307。利用公式C=Ca- b) /计算降解率(c)为44.8%。由此得出菌株A18在苯并芘浓度为5 mg/
L，转速150 r/min、温度28 °C的条件下，振荡培养12 d，苯并芘的降解率为44.8%，其余菌株降解率为O。
[0018]2.2苯并芘降解菌的筛选与鉴定
菌株A18在PDA培养基上为气生菌丝米黄色，比较疏松，棉絮状。大型分生孢子纺锤形或镰刀形，基部有明显的脚胞，顶端细胞均匀的逐渐狭细，平直或稍弯曲。小型分生孢子较少，为长矩圆形或椭圆形，分生孢子梗为短梗形。厚垣孢子顶生或间生，成结节状或成串。根据上述形态特征，参考Booth镰刀菌分类系统，鉴定该菌株为木贼镰刀菌(Fusariumequiseti )。
[0019]2.3经PCR扩增获得的A18号菌的18S rRNA序列(NCBI序列号为GQ505743.1)，与GenBank中已报道的镰孢霉属(Fusarium LK.ex Fr.)真菌的18S rRNA序列有98%的同源性。系统发育分析结果显示:A18与弯镰孢霉组(赤霉属Gibbosum/Gibberella)真菌的一些已鉴定菌株(序列号为AY147368及AY147363)同属于一个簇群。根据A18的形态学特征以及18S rRNA序列分析结果，参照镰孢霉属的分类学，将其鉴定为一种木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)。
[0020]实施例二
本实施例与实施例一的区别在于:富集培养基的原料具体配比为=(NH4)2SO4 0.5 g,NaNO3 0.5 g，CaCl2 0.02 g，KH2PO4 1.0 g，NaH2PO4 1.0 g，MgSO4 0.2 g，溶解苯并芘 10 mg于丙酮后加水至I L，pH值7.5 ;2216E培养基的原料具体配比为:蛋白胨8 g，酵母浸膏2g，磷酸高铁0.02 g，加水至11^，？!1值7.8。
[0021]实施例三
本实施例与实施例一的区别在于:富集培养基的原料的具体配比为=(NH4)2SO4 0.4 g,NaNO3 0.4 g, CaCl2 0.015g, KH2PO4 0.8 g, NaH2PO4 0.8 g, MgSO4 0.15 g，溶解苯并芘 8 mg于丙酮后加水至I L，pH值7.5 ;2216E培养基的原料具体配比为:蛋白胨6 g，酵母浸膏1.5g，磷酸高铁0.015 g，加水至lL，pH值7.7。
[0022]本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从那一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何变化，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
【主权项】
1.用于培养苯并芘降解菌的培养基，其特征在于，包括富集培养基和2216E培养基，所述富集培养基的原料具体配比为:(NH4) 2S04 0.3-0.5 g，NaNO3 0.3-0.5 g，CaCl20.01-0.02 g，KH2PO4 0.5-1.0 g，NaH2PO4 0.5-1.0 g，MgSO4 0.1-0.2 g，溶解苯并芘 5-10mg于丙酮后加水至总体积为I L，pH值7.5 ;2216E培养基的原料具体配比为:蛋白胨5~8g，酵母浸膏I ~2g，磷酸高铁0.01-0.02 g，加水至总体积为1L，pH值7.6?7.8。2.根据权利要求1所述的用于培养苯并芘降解菌的培养基，其特征在于，所述富集培养基的原料的具体配比为=(NH4)2SO4 0.3 g，NaNO3 0.3 g，CaCl2 0.01 g，KH2PO4 0.5 g，NaH2PO4 0.5 g，MgSO4 0.1 g，溶解苯并芘5 mg于丙酮后加水至I L，pH值7.5 ；2216E培养基的原料具体配比为:蛋白胨5 g，酵母浸膏I g，磷酸高铁0.01 g，加水至1L，pH值7.6。3.根据权利要求1所述的用于培养苯并芘降解菌的培养基，其特征在于，所述富集培养基的原料具体配比为=(NH4)2SO4 0.5 g，NaNO3 0.5 g，CaCl2 0.02 g，KH2PO4 1.0 g，NaH2PO4 1.0 g, MgSO4 0.2 g，溶解苯并芘10 mg于丙酮后加水至I L，pH值7.5 ;2216E培养基的原料具体配比为:蛋白胨8 g，酵母浸膏2g，磷酸高铁0.02 g，加水至11^，口!1值7.8。4.根据权利要求1所述的用于培养苯并芘降解菌的培养基，其特征在于，所述富集培养基的原料的具体配比为=(NH4)2SO4 0.4 g，NaNO3 0.4 g，CaCl2 0.015g，KH2PO4 0.8 g，NaH2PO4 0.8 g，MgSO4 0.15 g，溶解苯并芘8 mg于丙酮后加水至I L，pH值7.5 ；2216E培养基的原料具体配比为:蛋白胨6 g，酵母浸膏1.5g，磷酸高铁0.015 g，加水至lL，pH值7.7。5.用于培养权利要求1所述的苯并芘降解菌的培养方法，其特征在于，具体操作步骤如下: 一、取被苯并花污染的土样和水样的混合物加入到90mL无菌水中，加入适量玻璃珠，振荡3 h ； 二、经30min静置后，取5 mL上清液到45 mL的无机盐培养基中，培养基中的苯并芘浓度为lmg/L，培养温度为28 °C，以频率150 r/min摇床避光培养； 三、每隔7天移取10mL菌液至灭菌的90 mL无机盐培养基中富集培养； 四、重复4次，将最后一次的培养液稀释不同的梯度并涂布于表面涂有苯并芘的选择性固体培养基平板上培养，在28°C的培养温度下培养2天； 五、分别挑取单菌落接种到2216E固体平板液体培养基中，反复划线分离，经28°C培养箱倒置培养2天，得到纯培养物，观察菌落形态并测量菌落大小，记录并保存菌株。
【专利摘要】本发明属于焦化厂污染物降解技术领域，具体涉及一种苯并芘降解菌的培养基及本降解菌的培育方法，本发明利用富集培养基和2216E培养基进行培养，所述富集培养基的原料包括（NH4）2SO4、NaNO3？、CaCl2、KH2PO4、NaH2PO4和MgSO4？的混合物，并溶解苯并芘5~10mg于丙酮后加水至总体积为1？L，pH值7.5，2216E培养基的原料具体配比为：蛋白胨、酵母浸膏和磷酸高铁的混合物，加水至总体积为1L，pH值7.6～7.8；本发明所得的苯降解菌菌株具有优良的降解苯并芘的能力，具有从环境介质中清除苯并芘的较好效果，在苯并芘污染的微生物修复上具有很高的应用价值。
【IPC分类】C12R1/77, C12N1/14
【公开号】CN105039169
【申请号】CN201510270404
【发明人】李军, 弓玉红, 白凤凤
【申请人】吕梁学院
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年5月26日