中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物发酵，特别是指一种变色栓菌发酵液的制备方法及变色栓菌发 酵液在降解黄曲霉毒素&中的应用。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素（Afiatoxin，AFT)是一类毒性极强的微生物代谢物质，对人类及动物 危害极大，尤以对人和动物肝脏组织的破坏为主，严重时可导致肝癌甚至死亡。黄曲霉毒素 主要产生于黄曲霉菌和寄生曲霉菌，此外一些曲霉、青霉、毛霉、镰孢霉、根霉、链霉菌和放 线菌等也能产生该毒素。黄曲霉毒素在自然界中分布很广，以花生、玉米、大豆、谷物粮食及 其制品中更为多见。黄曲霉毒素进入机体后，在肝脏中的量较其他组织器官中为高，说明肝 脏受黄曲霉毒素危害最大。新的研宄表明黄曲霉毒素对人和动物健康危害均与其抑制蛋 白质的合成有关。它干扰信息RNA和DNA的合成，进而干扰细胞蛋白质合成，导致动物全 身性损伤。进一步研宄表明黄曲霉毒素对人类的危害作用分为直接和间接两种，直接摄入 含黄曲霉毒素的粮食类食物对人的毒害为直接作用；黄曲霉毒素也可以食物链的方式转移 (肉、奶等）并在人体内积累，造成对身体健康的危害为间接作用。
[0003] 在若干种黄曲霉毒素中，黄曲霉毒素&的毒性最强，对人的危害最大。初期的临 床表现有胃部不适、食欲减退、恶心、呕吐、腹胀、肝区触痛等症状，严重者发生肝炎、水肿、 肝硬化、昏迷、以至抽搐死亡。黄曲霉毒素一旦进入人和动物体内，会集聚在各个器官（尤 其是肝脏）。它不能被分解，只能靠漫长时间排泄，因此，黄曲霉毒素在体内存留时间长且危 害大。其危害已引起了世界范围的重视。
[0004]目前对黄曲霉毒素防治措施和解毒方法，主要分为三大类，包括物理、化学和生物 脱毒和解毒法。物理法包括吸附、辐射处理、热处理、水洗液相抽提等方法；化学法主要为 强碱、强酸和强氧化剂处理；生物法为生物酶制剂降解作用。由于物理方法需要特定条件 和材料，劳动强度大，用料多，条件苛刻，有时对被处理物的营养成分有破坏和损失作用，脱 毒不完全，应用受到限制，难以实现大规模生产。化学法所用药品对处理材料有较大破坏作 用，要求条件剧烈，往往会产生化学残留，造成二次污染。生物脱毒法是一种高效、无危害的 的解毒方法，因其在温和条件下分解毒素且无残留，不破坏营养成分，不产生二次污染等原 因，目前受到人们广泛的重视同时也是研宄的主要方向。
[0005] 微生物降解黄曲霉毒素主要采用细菌和真菌，国外大量资料研宄显示，真菌多，细 菌报道较少。
[0006] 变色栓菌（俗称云芝菌）是最具药用价值的真菌之一，其发酵液中富含云芝多糖。 云芝多糖具有清热、解毒、抗癌和保肝之功效，是良好的肌体免疫调节剂。近年来，云芝多糖 已做成多种剂型药物和保健品流通于市场。云芝菌液体深层发酵还可产生多种酶制剂及蛋 白质，其中漆酶、蛋白酶、过氧化酶、淀粉酶等是主要酶。目前，漆酶降解黄曲霉毒素&研宄 已有报道，降解率较高，但尚未有产品投放市场。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供变色栓菌发酵液（云芝）的制备方法及变色栓菌（云芝） 发酵液在降解黄曲霉毒素中的应用。
[0008] 本发明的整体技术构思是：
[0009] 变色栓菌发酵液的制备方法，将变色栓菌PTrametes versicolor CICC14001接种 于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的无菌培养基中进行通气发酵制成发酵液；
[0010] 发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：
[0011] 甘蔗渣 1.9% -2. 3%，麸皮 0.1 % -0.12%，豆饼粉 0.1 % -0.13%，葡萄糖 0? 5% -0? 7%，果糖 0? 5%-0. 7%，硫酸铵 0? 08% -0? 11%，磷酸二氢钾 0? 15% -0? 2%，硫酸 镁0. 04% -0. 06 %，维生素&0. 00001% -0. 00003%，愈创木酚0. 00013%，微量元素溶液 占无菌培养基的体积比为0. 07% -0. 12%，余量为无菌水，pH = 4. 5 ;
[0012] 通气发酵的工艺条件如下：
[0013]接种量为体积比=6-8 : 100,温度29°C -31°C，通气量1 :0?7-1. 2vvm，压力为 0. 03Mpa-0. 05Mpa，培养周期为不低于220小时。
[0014] 发酵终点的控制除时间因素外，应结合722可见光分光光度计，采用考马斯亮蓝 法监测发酵液中蛋白质浓度3 2. 5mg/ml确定发酵终点。
[0015] 采用上述方法制备的变色栓菌发酵液在降解降解黄曲霉毒素&中的应用。
[0016] 本发明的具体技术构思还有：
[0017] 出于工业化生产的需要，优选的技术方案是，所述的变色栓菌菌种在接入无菌培 养基前经过扩大培养。
[0018] 更为优选的技术方案是，所述的扩大培养包括斜面菌种的制备、一级种子的制备 以及二级种子的制备。
[0019] 所述的斜面菌种的制备中培养基采用马铃薯培养基或葡萄糖培养基中的一种，温 度为29 °C -31°C，培养周期4-5天。
[0020] 所述的一级种子的制备包括如下工艺步骤：
[0021] 将斜面菌种按每只斜面接3瓶的接种量接种到装有一级种子培养基三角瓶中，在 30°C条件下振荡培养不低于90小时制成一级种子，装量为1000ml的三角瓶装入200ml - 级种子培养基，以目测一级种子培养基中有一定量的菌丝体悬浮，以镜检菌丝体生长粗壮、 均匀一致为一级种子培养终点。
[0022] 所述的二级种子的制备包括如下工艺步骤：
[0023] 按照一级种子与二级种子培养基的体积比=10 : 100的比例，将一级种子接入灭 菌后装有二级种子培养基的发酵罐中，装量为体积比=60-70:100,在温度为29°C -31°C， 通气量为1 : 〇. 5-0. 7vvm，压力为0. 03Mpa-0. 05Mpa的条件下进行不低于72小时的通气培 养制成二级种子，以目测液体培养基中有大量的菌丝体悬浮，以镜检菌丝体生长粗壮、均匀 一致为二级种子培养终点。
[0024] 所述的一级种子培养基和二级种子培养基采用如下质量份数的原料组成：
[0025]葡萄糖0.9%-L 1%，酵母膏0? 1%-0. 12%，硫酸铵0.08%-0. 11%，磷酸二氢钾 0. 15% -0.2%，硫酸镁0.04% -0.06%，尿素0.012% -0.015%，微量元素溶液占种子培养 基的体积比为0. 07% -o. 12%，余量为水，pH = 4. 5。
[0026] 所述的微量元素溶液采用如下方法配制：氯化钙100mg，硫酸亚铁100mg，硫酸锌 20mg，硫酸铜25mg，定容至1000ml。
[0027] 采用本发明的方法所获得的发酵液采用常规方法进行固液分离后得到的液体即 为变色栓菌发酵液制剂，固液分离的方法包括但不局限于采用板框分离、离心机分离等现 有技术，均不脱离本发明的技术实质。
[0028] 本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
[0029] 1、本发明工艺简便、成熟，只需深层发酵设备，固液分离后的液体即可用于解毒， 制备过程无三废污染。
[0030] 2、本发明中所使用的变色栓菌，不在致病菌种范围，安全可靠。
[0031] 3、本发明中培养基的主要原料为甘蔗渣和豆饼粉，具有安全、无毒、绿色的特点。
[0032] 4、该变色栓菌发酵液用于降解黄曲霉毒素&，降解速度快，降解率高，条件温和， 选择性好，性能稳定。用于降解自然条件下污染黄曲霉毒素&(含量< lOOyg/kg)的饲料， 降解率彡77%。
[0033]5、采用本发明制备的产品使用简单，不会造成二次危害。
【具体实施方式】
[0034] 以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不应理解为对本发明的限定，本发明 的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所作出的等效技术手段替换，均 不脱离本发明的保护范围。
[0035] 实施例1
[0036] 变色栓菌发酵液的制备方法，将变色栓菌PTrametes versicolor CICC14001接种 于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的无菌培养基中进行通气发酵制成发酵液；
[0037] 发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：
[0038] 甘蔗渣1.9%，麸皮0. 12%，豆饼粉0. 1%，葡萄糖0.7%，果糖0.5%，硫酸铵 0. 1%，磷酸二氢钾0. 15%，硫酸镁0.05%，维生素&0. 00003%，愈创木酚0.00013%，微 量元素溶液占无菌培养基的体积比为0. 07%，余量为无菌水，pH = 4. 5;
[0039] 通气发酵的工艺条件如下：
[0040] 接种量为体积比=8:100,温度31°C，通气量1 : 0.7vvm，压力为0.04Mpa，培 养周期为不低于220小时。
[0041] 发酵终点的控制除时间因素外，应结合722可见光分光光度计，采用考马斯亮蓝 法监测发酵液中蛋白质浓度3 2. 5mg/ml确定发酵终点。
[0042] 所述的变色栓菌菌种在接入无菌培养基前经过扩大培养。
[0043] 所述的扩大培养包括斜面菌种的制备、一级种子的制备以及二级种子的制备。
[0044] 所述的斜面菌种的制备中培养基采用马铃薯培养基或葡萄糖培养基中的一种，温 度为30°C，培养周期4天。
[0045] 所述的一级种子的制备包括如下工艺步骤：
[0046]将斜面菌种按每只斜面接3瓶的接种量接种到装有一级种子培养基三角瓶中，在 30°C条件下振荡培养90小时制成一级种子，装量为1000ml的三角瓶装入200ml-级种子 培养基，以目测一级种子培养基中有一定量的菌丝体悬浮，以镜检菌丝体生长粗壮、均匀一 致为一级种子培养终点。
[0047] 所述的二级种子的制备包括如下工艺步骤：
[0048] 按照一级种子与二级种子培养基的