体积比=10 : 100的比例，将一级种子接入灭 菌后装有二级种子培养基的发酵罐中，装量为体积比=70:100,在温度为29°C，通气量为 1 : 0.7vvm，压力为0.05Mpa的条件下进行不低于72小时的通气培养制成二级种子，以目 测液体培养基中有大量的菌丝体悬浮，以镜检菌丝体生长粗壮、均匀一致为二级种子培养 终点。
[0049] 所述的一级种子培养基和二级种子培养基采用如下质量份数的原料组成：
[0050] 葡萄糖1%，酵母膏0. 1%，硫酸铵0. 11%，磷酸二氢钾0. 15%，硫酸镁0.06%，尿 素0. 012%，微量元素溶液占种子培养基的体积比为0. 07%，余量为水，pH = 4. 5。
[0051] 所述的微量元素溶液采用如下方法配制：氯化钙100mg，硫酸亚铁100mg，硫酸锌 20mg，硫酸铜25mg，定容至1000ml。
[0052] 采用本实施例的方法所获得的发酵液采用常规方法进行固液分离，其中包括但不 局限于采用板框分离、离心机分离等。
[0053] 实施例2
[0054] 本实施例与实施例1的区别在于：
[0055] 发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：
[0056] 甘蔗渣2. 1%，麸皮0. 11%，豆饼粉0. 11%，葡萄糖0.5%，果糖0.7%，硫酸铵 0. 08%，磷酸二氢钾0. 17%，硫酸镁0. 04%，维生素&0. 00002%，愈创木酚0. 00013%，微 量元素溶液占无菌培养基的体积比为0. 09%，余量为无菌水，pH = 4. 5;
[0057]接种量为体积比=7 : 100,温度29°C，通气量1 : 0.9vvm，压力为0.03Mpa，培 养周期为不低于220小时。
[0058] 所述的斜面菌种的制备中培养温度为29°C，培养周期5天。
[0059] 所述的二级种子的制备中：
[0060] 装量为体积比=60:100,在温度为30°C，通气量为1 : 0? 5vvm，压力为0? 03Mpa的 条件下进行不低于72小时的通气培养制成二级种子。
[0061] 所述的一级种子培养基和二级种子培养基采用如下质量份数的原料组成：
[0062] 葡萄糖0.9%，酵母膏0. 11 %，硫酸铵0.09%，磷酸二氢钾0. 17%，硫酸镁0.05%， 尿素0. 013%，微量元素溶液占种子培养基的体积比为0. 08%，余量为水，pH = 4. 5。
[0063] 实施例3
[0064] 本实施例与实施例1的区别在于：
[0065] 发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：
[0066] 甘蔗渣2.3%，麸皮0. 10%，豆饼粉0. 13%，葡萄糖0.6%，果糖0.6%，硫酸铵 0. 11 %，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.06%，维生素&0. 00001%，愈创木酚0.00013%，微 量元素溶液占无菌培养基的体积比为0. 12%，余量为无菌水，pH = 4. 5 ;
[0067]接种量为体积比=6:100,温度30°C，通气量1 : 1.2vvm，压力为0.05Mpa，培 养周期为不低于220小时。
[0068]所述的斜面菌种的制备中培养温度为31°C，培养周期4. 5天。
[0069] 所述的二级液体种子的制备包括如下工艺步骤：
[0070] 按照一级种子的体积：二级种子培养基的体积比=10 : 100将一级种子接入灭 菌后的二级种子培养基，装量为体积比=65:100,在温度为28°C，通气量为1 : 0. 6vvm，压 力为0. 04Mpa的条件下进行不低于72小时的通气发酵制成二级液体种子。
[0071] 所述的一级种子培养基和二级种子培养基采用如下质量份数的原料组成：
[0072] 葡萄糖1. 1%，酵母膏0. 12%，硫酸铵0.08%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.04%， 尿素0. 015%，微量元素溶液占种子培养基的体积比为0. 12%，余量为水，pH = 4. 5。
[0073]申请人就上述实施例制备的变色栓菌发酵液制剂的添加量和降解黄曲霉毒素& 的能力分别进行毒素水溶液和玉米饲料解毒试验。试验过程及结果如下：
[0074] 1、试验过程
[0075] 取玉米饲料10%。（W:W)的变色栓菌发酵液制剂加入一定量水稀释后，再分别与含 97. 7 y g/kg黄曲霉毒素心的玉米饲料混勾，以玉米饲料表面湿润为好，密闭在37°C条件 下，保温48小时以上，按照GB/17480-2008饲料中黄曲霉毒素&的测定方法-酶联免疫吸 附法，测定降解后饲料中黄曲霉毒素&含量，并计算出降解率。
[0076] 2、试验结果
[0077] 解毒试验1
[0078] 利用实施例1-3的方法获得的变色栓菌发酵液制剂按质量百分比分别为2%。、 6%。、10%。比例添加到不同浓度黄曲霉毒素& (含量在5-120 y g/L)的水溶液中，充分混匀， 在37°C条件下保温48小时以上，用于降解黄曲霉毒素&毒性。降解毒素试验结果如表1。
[0079] 表1变色栓菌发酵液制剂降解水溶液中黄曲霉毒素&结果
[0080]
【主权项】
1. 变色栓菌发酵液的制备方法，其特征在于将变色栓菌PTrametes versicolor CICC14001接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的无菌培养基中进行通气发酵制成发 酵液； 发酵培养基由如下质量百分数的组分组成： 甘蔗渣1. 9 % -2. 3 %，麸皮0. 1 % -0. 12 %，豆饼粉0. 1 % -0. 13 %，葡萄糖 0· 5% -0· 7%，果糖 0· 5%-0· 7%，硫酸铵 0· 08% -0· 11%，磷酸二氢钾 0· 15% -0· 2%，硫酸 镁0. 04% -0. 06%，维生素 B1 0. 00001% -0. 00003%，愈创木酚0. 00013%，微量元素溶液 占无菌培养基的体积比为0. 07% -0. 12%，余量为无菌水，pH = 4. 5 ; 通气发酵的工艺条件如下： 接种量为体积比=6-8 : 100,温度29°C-31°C，通气量I : 0.7-L2VVm，压力为 0. 03Mpa-0. 05Mpa，培养周期为不低于220小时。
2. 根据权利要求1所述的变色栓菌发酵液的制备方法，其特征在于所述的变色栓菌菌 种在接入无菌培养基前经过扩大培养。
3. 根据权利要求2所述的变色栓菌发酵液的制备方法，其特征在于所述的扩大培养包 括斜面菌种的制备、一级种子的制备以及二级种子的制备。
4. 根据权利要求3所述的变色栓菌发酵液的制备方法，其特征在于所述的斜面菌种的 制备中培养基采用马铃薯培养基或葡萄糖培养基中的一种，温度为29°C-31°C，培养周期 4-5 天。
5. 根据权利要求3所述的变色栓菌发酵液的制备方法，其特征在于所述的一级种子的 制备包括如下工艺步骤： 将斜面菌种按每只斜面接3瓶的接种量接种到装有一级种子培养基三角瓶中，在30°C 条件下振荡培养不低于90小时制成一级种子，装量为1000ml的三角瓶装入200ml -级种 子培养基，以目测一级种子培养基中有一定量的菌丝体悬浮，以镜检菌丝体生长粗壮、均匀 一致为一级种子培养终点。
6. 根据权利要求3所述的变色栓菌发酵液的制备方法，其特征在于所述的二级种子的 制备包括如下工艺步骤： 按照一级种子与二级种子培养基的体积比=10 : 100的比例，将一级种子接入灭菌后 装有二级种子培养基的发酵罐中，装量为体积比=60-70:100,在温度为29 °C -31 °C，通气 量为1 : 0. 5-0. 7vvm，压力为0. 03Mpa-0. 05Mpa的条件下进行不低于72小时的通气培养制 成二级种子，以目测液体培养基中有大量的菌丝体悬浮，以镜检菌丝体生长粗壮、均匀一致 为二级种子培养终点。
7. 根据权利要求3所述的变色栓菌发酵液的制备方法，其特征在于所述的一级种子培 养基和二级种子培养基采用如下质量份数的原料组成： 葡萄糖0.9 % -L 1%，酵母膏0· 1% -0· 12%，硫酸铵0.08 % -0· 11%，磷酸二氢钾 0. 15% -0.2%，硫酸镁0.04% -0.06%，尿素0.012% -0.015%，微量元素溶液占种子培养 基的体积比为0. 07% -0. 12%，余量为水，pH = 4. 5。
8. 根据权利要求1或7所述的变色栓菌发酵液的制备方法，其特征在于所述的微量元 素溶液采用如下方法配制：氯化妈l〇〇mg，硫酸亚铁100mg，硫酸锌20mg，硫酸铜25mg，定容 至 1000 ml0
9.根据权利要求1所述的方法制备的变色栓菌发酵液在降解降解黄曲霉毒素 B i中的 应用。
【专利摘要】本发明涉及微生物发酵，特别是指变色栓菌发酵液的制备方法及变色栓菌发酵液在降解黄曲霉毒素B1中的应用。将变色栓菌PTrametes versicolor CICC 14001接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的无菌培养基中进行通气发酵制成发酵液，采用本发明的方法所制备的变色栓菌发酵液可应用于降解黄曲霉毒素B1。本发明解决了现有方法中需要特定条件和材料，劳动强度大，脱毒不完全，对处理材料有较大破坏作用，要求条件剧烈，往往会产生化学残留，造成二次污染等技术问题。具有工艺简便、安全性高，变色栓菌发酵液用于降解黄曲霉毒素B1，降解速度快，降解率高等优点。
【IPC分类】A62D3-02, C12R1-645, C12N1-14
【公开号】CN104830701
【申请号】CN201510262114
【发明人】王云鹏, 胡常英, 秦艳梅, 马清河, 胡科峰, 章淑艳, 李军, 李宾, 蔡建成, 刘丽娜, 韩韬, 罗同阳, 郑翔, 高庆华, 刘春卯, 李领颇, 吴芳彤
【申请人】河北省微生物研究所
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年5月21日