一种甘蔗梢腐病的病原菌的分离鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种甘蔗梢腐病(PBD)的病原菌的分离鉴定方法，属于植物病原菌分离技术领域。
【背景技术】
[0002]甘鹿(Saccharum.spp)是世界上主要的糖料作物，也是优良的能源作物之一。我国是世界甘蔗发源地之一，也是世界第三大甘蔗糖生产国。除了制糖，甘蔗还用于造纸及燃料乙醇生产。甘蔗糖业对农民增收、产业结构调整和国家能源安全的保障具有重要意义。
[0003]甘鹿梢腐病(Pokkah Boeng Disease，PBD)是甘鹿生长中一种发生较普遍的、世界性的甘蔗病害，1921年在印度尼西亚爪哇首次报道。目前，几乎所有甘蔗生产国和地区都有该病发生。我国甘蔗生产区也常有梢腐病发生，福建、台湾、广西、云南、广东以及海南都曾报道过，对我国甘蔗生产和糖业发展带来巨大损失。
[0004]甘蔗梢腐病(PBD)主要通过带病植株和气流传播，感病后甘蔗一般表现为梢部和幼叶基部缺绿黄化，叶片扭缠或短缩，有明显的褐色皱纹。发病最严重时形成梢腐，生长点周围组织变软、变褐，心叶坏死，使整株甘蔗枯死。受害蔗株株高比健株平均减少30?60cm，受害蔗田每亩平均减产I?2t，甘蔗糖分降低0.56 %左右，重力纯度降低3 %左右，造成甘蔗产量和品质下降以及品种种性退化。甘蔗生长最旺盛的7-9月是梢腐病的主要发生时期，高温高湿、干旱后充分灌水、施用氮肥过多或干旱后遇到降雨，都可引发梢腐病的大规模发生。
[0005]甘鹿梢腐病(PBD)的病原菌为Gibberella fujikuroi (Saw.) Wolle，是一种真菌性病害。在我国，甘蔗病害的基础性研宄比较薄弱.尤其在甘蔗抗病育种和病害的快速诊断技术上，与先进国家有较大差距。借鉴或引进国外先进病害检测技术和抗性鉴定技术，提高甘蔗抗病育种水平和病害诊断水平，是甘蔗梢腐病研宄的重点问题。
[0006]甘蔗梢腐病(PBD)的诊断技术经历了从内部症状观察一相差显微镜检查一免疫技术一PCR快速检测4个阶段。我国在这方面的研宄比较落后，诊断方法以内部症状观察和相差显微镜检查为主，应用免疫技术和PCR检测PBD还处于起步阶段。20世纪80年代初，免疫学技术在生物医学、动植物病原菌的检测、诊断与防治上得了广泛应用。1984年以来，国外不少学者将免疫技术应用于甘蔗PBD诊断，以广西主栽品种新台糖22 (ROC)为研宄对象，利用DNA杂交技术(Tissue blot DNA hybridizat1n和ITS序列分析检测甘鹿梢腐病病原细菌Gibberella fujikuroi (Saw.)Wolle，也获得了较理想的效果。PCR技术是20世纪80年代中期建立的一项体外迅速、大量扩增目的基因的技术，已广泛地应用于分子生物学、医学、农学等学科，用于基因的克隆遗传分析和疾病诊断等。由于PCR能够特异扩增某一 DNA片段，因此，在病原微生物的检测上，比传统方法有优势，如PCR技术检测生物体时不需要培养，具有极高的灵敏度、快速等。近10多年来，PCR技术在植物病害检测中得到了广泛应用，也有不少学者对甘蔗梢腐病(PBD)分子检测技术进行了研宄，如张玉娟利用甘蔗PBD病原细菌的18S-28S核糖体DNA的ITS区域设计了 I对特异引物(反向引物为 PBDl: 5’ -CTCTTGGTTCTGGCATCG-3’，反向引物为 PBD2:5’ -GTTCAGCGGGTATTCCTA-3’)进行PCR检测，检测了 14个PBD样本，获得了大小为545-546DNA特异扩增产物，ITS序列与镰刀菌同源性高达99%。
[0007]等温扩增技术(Isothermal Amplificat1n Technology)是核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。环介导核酸等温扩增技术(loop-mediated isothermalamplificat1n, LAMP)，就是等温PCR技术的一种，是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63°C左右)保温30?60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。
[0008]甘蔗梢腐病(PBD)的病原菌的体外分离培养，一方面可以使得我们自行利用免疫学技术获得抗体，使广泛用于生产上的检测成为可能，另一方面可以分离到纯净的甘蔗梢腐病(PBD)病原菌的DNA，促进了该病原菌以DNA为基础的检测方法的发展，也为今后对该病原菌开展遗传多样性等研宄奠定了必要的基础。但目前，尚未有甘蔗梢腐病(PBD)病原菌的体外分离和培养方法的相关报道。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是弥补现有技术的不足，提供一种甘蔗梢腐病(PBD)的病原菌的分离、培养和鉴定方法，本发明能实现甘蔗梢腐病(PBD)的病原菌的体外分离和培养，并能实现甘蔗梢腐病(PBD)的病原菌的鉴定。
[0010]本发明解决上述技术问题的技术方案如下:一种甘蔗梢腐病的病原菌的分离鉴定方法，包括如下步骤:
[0011](I)病原菌的分离:
[0012]①将患有梢腐病的甘蔗植株A的发病叶片的表面用水清洗干净，然后从染病部位、健康部位、病健交界处分别切取叶片组织，再分别用酒精、升汞消毒，然后用无菌水冲洗，吸干表面水分，得到组织切片；
[0013]②将步骤①所得组织切片接种于PDA培养基上，于28°C培养3?4d，当培养出的菌落直径多Icm时，挑取菌落边缘菌丝接种于新的PDA培养上，于28°C培养3?4d，重复上述操作多3次，得到纯化菌种；
[0014]③将步骤②所得纯化菌种回接于健康的甘蔗植株B，如果甘蔗植株B的发病症状与甘蔗植株A的相同，前述纯化菌种即可作为分离后的病原菌，于4°C保存，待用；
[0015](2)病原菌的培养:将步骤(I)所得分离后的病原菌，接种于PDA培养基上，于28°C培养3?4d，即得培养后的病原菌；
[0016](3)病原菌的电子显微镜检测:取步骤(2)所得培养后的病原菌，置于电视相差显微镜检测，若呈下述症状，则可初步判定为甘蔗梢腐病的病原菌:呈串珠状，淡黄色，有时菌丝组合成孢梗束，小型分生孢子单细胞，长卵形，大小为6.5?11 μ mX 2.8?3.5 μ m，串生在分生孢子梗顶部；大型分生孢子镰刀形，具隔膜3?7个，大小为30?65 μ mX 3.5?4.2 μ m，生在气生菌丝上或分生抱子座中；
[0017](4)病原菌的等温PCR鉴定:将步骤(3)所得初步判定为甘蔗梢腐病的病原菌，进行等温PCR鉴定:
[0018]①引物序列为:正向引物为PBDl: 5’ -CTCTTGGTTCTGGCATCG-3’，反向引物为PBD2:5’ -GTTCAGCGGGTATTCCTA-3’，预期扩增产物长度为 545_546bp ；
[0019]②模板DNA的制备:
[0020]a、挑取菌丝至2.0mL离心管中；
[0021]b、加入现配的50yL Buffer A，混勾后，离心，得到上清液A ;
[0022]c、将上清液A于95°C放置1min后，立即置于冰块上放置3min ；
[0023]d、加入现配的50yL Buffer B，混勾后，离心，得到上清液B ;
[0024]e、在上清液B中，加入等体积的氯仿-异戊醇溶液，剧烈摇匀后，离心，得到上清液C，轻轻吸取上清液C至另一新的离心管，制成模板，待用；
[0025]③等温PCR 扩增体系:含 20mmol/L Tris-HCl、10mmol/L(NH4)2S04、50mmol/L KCl,2mmol/L MgS04、0.1 % Tween20、25°C 的 pH为 8.8 的 I X Isothermal Amplificat1n Buffer2.5 μ L、ddH20 18.8 μ L、lOmmol/L 的 dNTPs Mixture 0.5 μ L、10 μ mol/L 的 PBDl I μ L、10 μ mol/L 的 PBD2 I μ L、5U/ μ L 的 Bst 2.0 DNA Polymerase 0.2 μ L、模板 DNA I μ L ;
[0026]④等温PCR扩增程序:65°C等温45min，80°C失活20min，-20°C保持；
[0027]⑤取PCR扩增后的反应液5 μ L，用I %琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，在550bp处出现单一扩增条带的为甘蔗梢腐病原菌，不出现单一扩增条带的不是甘蔗梢腐病原菌。
[0028]在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0029]进一步，步骤(I)①所述叶片组织的大小为0.5cm2，所述酒精的体积浓度为75%，所述酒精消毒的时间为10s，所述升汞的质量体积浓度为lg/L，所述升汞消毒的时间为5s，所述无菌水冲洗的次数为3次。
[0030]进一步，步骤⑴②所述PDA培养基的配方为:马铃薯100g，葡萄糖10g，琼脂8g，蒸馏水0.5L。
[0031]进一步，步骤(4)②b 所述 Buffer A 是 10Ommol /T, NaOH 和 2% Tween 20 的混合溶液，所述离心的速度为800r/min，时间为10s。
[0032]进一步，步骤⑷②d 所述 Buffer B 是 100mmol/L Tris-HCl 和 2mmol/L EDTA 的混合溶液，所述离心的速度为800r/min，时间为10s。
[0033]进一步，步骤(4)②e所述氯仿-异戊醇溶液中氯仿和异戊醇的体积比为24:1，所述离心的速度为12000r/min，时间为lOmin。
[0034]本发明的有益效果是:
[0035](I)本发明实现了甘蔗梢腐病(PBD)的病原菌的体外分离和培养，促进了该病原菌以DNA为基础的检测方法的发展，也为今后对该病原菌开展遗传多样性等研宄奠定了必要的基础。
[0036](2)本发明实现了甘蔗梢腐病的病原菌的快速鉴定，具有操作简单、灵敏性高、特异性强等特点，且检测结果准确、客观、快捷，对提高甘蔗梢腐病的病原菌的检测效率及灵敏度具有重要意义。
[0037](3)本发明的方法可以准确检测