甘蔗种子、亲本资源和育种中间材料在生长早期是否含有甘蔗梢腐病原复合物，将有效推动甘蔗的科研、育种及生产，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0038]图1为本发明的甘蔗梢腐病原菌的电子显微图。
[0039]图2为本发明的甘蔗梢腐病原菌经等温PCR检测法鉴定后的电泳图。
【具体实施方式】
[0040]以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0041](I)病原菌的分离:
[0042]①将患有梢腐病的甘蔗植株A的发病叶片的表面用水清洗干净，然后从染病部位、健康部位、病健交界处分别切取0.5cm2大小的叶片组织，再分别用体积浓度为75%的酒精消毒10s、质量体积浓度为lg/L的升汞消毒5s，然后用无菌水冲洗3次，用灭菌滤纸吸干表面水分，得到组织切片；
[0043]②将步骤①所得组织切片接种于PDA培养基上，于28°C培养3?4d，所述PDA培养基的配方为:马铃薯100g，葡萄糖10g，琼脂8g，蒸馏水0.5L，当培养出的菌落直径多Icm时，挑取菌落边缘菌丝接种于新的PDA培养上，于28°C培养3?4d，重复上述操作彡3次，得到纯化菌种；
[0044]③将步骤②所得纯化菌种回接于健康的甘蔗植株B，如果甘蔗植株B的发病症状与甘蔗植株A的相同，前述纯化菌种即可作为分离后的病原菌，于4°C保存，待用；
[0045](2)病原菌的培养:将步骤(I)所得分离后的病原菌，接种于PDA培养基上，于28°C培养3?4d，即得培养后的病原菌；
[0046](3)病原菌的电子显微镜检测:取步骤(2)所得培养后的病原菌，置于电视相差显微镜检测，若呈下述症状，则可初步判定为甘蔗梢腐病的病原菌:呈串珠状，淡黄色，有时菌丝组合成孢梗束，小型分生孢子单细胞，长卵形，大小为6.5?11 μ mX 2.8?3.5 μ m，串生在分生孢子梗顶部；大型分生孢子镰刀形，具隔膜3?7个，大小为30?65 μ mX 3.5?4.2 μ m，生在气生菌丝上或分生孢子座中，如图1所示；
[0047](4)病原菌的等温PCR鉴定:将步骤(3)所得初步判定为甘蔗梢腐病的病原菌，进行PCR鉴定:
[0048]①引物序列为:正向引物为PBDl: 5’ -CTCTTGGTTCTGGCATCG-3’，反向引物为PBD2:5’ -GTTCAGCGGGTATTCCTA-3’，预期扩增产物长度为 545_546bp ；
[0049]②模板DNA的制备:
[0050]a、挑取菌丝至2.0mL离心管中；
[0051]b、加入现配的 50yL Buffer A，所述 Buffer A 是 100mmol/L NaOH 和 2% Tween20的混合溶液，混匀后，以800r/min的速度离心10s，得到上清液A ;
[0052]C、将上清液A于95°C放置1min后，立即置于冰块上放置3min ；
[0053]d、加入现配的 50 μ L Buffer B，所述 Buffer B 是 100mmol/L Tris-HCl 和 2mmol/L EDTA的混合溶液，混匀后，以800r/min的速度离心10s，得到上清液B ；
[0054]e、在上清液B中，加入等体积的氯仿-异戊醇溶液，所述所述氯仿-异戊醇溶液中氯仿和异戊醇的体积比为24:1，剧烈摇匀后，以12000r/min的速度离心llOmin，得到上清液C，轻轻吸取上清液C至另一新的离心管，制成模板，待用；
[0055]③等温PCR 扩增体系:含 20mmol/L Tris-HCl、10mmol/L(NH4)2S04、50mmol/L KCl,2mmol/L MgS04、0.1 % Tween20、25°C 的 pH为 8.8 的 I X Isothermal Amplificat1n Buffer2.5 μ L、ddH20 18.8 μ L、lOmmol/L 的 dNTPs Mixture 0.5 μ L、10 μ mol/L 的 PBDl I μ L、10 ymol/L 的 PBD21 μ L、5U/ μ L 的 Bst 2.0 DNA Polymerase0.2 μ L、模板 DNAl μ L ；
[0056]④等温PCR扩增程序:65°C等温45min，80°C失活20min，-20°C保持；
[0057]⑤取PCR扩增后的反应液5 μ L，用I %琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，在550bp处出现单一扩增条带的为甘蔗梢腐病原菌，不出现单一扩增条带的不是甘蔗梢腐病原菌，如图2所示。
[0058]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种甘蔗梢腐病的病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)病原菌的分离: ①将患有梢腐病的甘蔗植株A的发病叶片的表面用水清洗干净，然后从染病部位、健康部位、病健交界处分别切取叶片组织，再分别用酒精、升汞消毒，然后用无菌水冲洗，吸干表面水分，得到组织切片； ②将步骤①所得组织切片接种于PDA培养基上，于28°C培养3?4d，当培养出的菌落直径多Icm时，挑取菌落边缘菌丝接种于新的PDA培养上，于28°C培养3?4d，重复上述操作多3次，得到纯化菌种； ③将步骤②所得纯化菌种回接于健康的甘蔗植株B，如果甘蔗植株B的发病症状与甘蔗植株A的相同，前述纯化菌种即可作为分离后的病原菌，于4°C保存，待用； (2)病原菌的培养:将步骤(I)所得分离后的病原菌，接种于PDA培养基上，于28°C培养3?4d，即得培养后的病原菌； (3)病原菌的电子显微镜检测:取步骤(2)所得培养后的病原菌，置于电视相差显微镜检测，若呈下述症状，则可初步判定为甘蔗梢腐病的病原菌:呈串珠状，淡黄色，有时菌丝组合成孢梗束，小型分生孢子单细胞，长卵形，大小为6.5?11 μ mX 2.8?3.5 μ m，串生在分生孢子梗顶部；大型分生孢子镰刀形，具隔膜3?7个，大小为30?65 μ mX 3.5?4.2 μ m，生在气生菌丝上或分生孢子座中； (4)病原菌的等温PCR鉴定:将步骤(3)所得初步判定为甘蔗梢腐病的病原菌，进行PCR鉴定: ①引物序列为:正向引物为PBDl:5，-CTCTTGGTTCTGGCATCG-3’，反向引物为PBD2:5’ -GTTCAGCGGGTATTCCTA-3’，预期扩增产物长度为 545_546bp ； ②模板DNA的制备: a、挑取菌丝至2.0mL离心管中； b、加入现配的50yLBuffer A，混勾后，离心，得到上清液A ; C、将上清液A于95°C放置1min后，立即置于冰块上放置3min ； d、加入现配的50yLBuffer B，混勾后，离心，得到上清液B ; e、在上清液B中，加入等体积的氯仿-异戊醇溶液，剧烈摇匀后，离心，得到上清液C，轻轻吸取上清液C至另一新的离心管，制成模板，待用； ③等温PCR 扩增体系:含 20mmol/L Tris-HCl、10mmol/L(NH4)2S04、50mmol/L KCl,2mmol/L MgS04、0.1 % Tween20、25°C 的 pH为 8.8 的 I X Isothermal Amplificat1n Buffer2.5 μ L、ddH20 18.8 μ L、lOmmol/L 的 dNTPs Mixture 0.5 μ L、10 μ mol/L 的 PBDl I μ L、10 ymol/L 的 PBD21 μ L、5U/ μ L 的 Bst 2.0DNA Polymerase 0.2 μ L、模板 DNA I μ L ; ④等温PCR扩增程序:65°C等温45min，80°C失活20min，-20°C保持； ⑤取PCR扩增后的反应液5μ L，用I %琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，在550bp处出现单一扩增条带的为甘蔗梢腐病原菌，不出现单一扩增条带的不是甘蔗梢腐病原菌。
2.根据权利要求1所述的一种甘蔗梢腐病的病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤(I)①所述叶片组织的大小为0.5cm2，所述酒精的体积浓度为75%，所述酒精消毒的时间为10s，所述升汞的质量体积浓度为lg/L，所述升汞消毒的时间为5s，所述无菌水冲洗的次数为3次。
3.根据权利要求1所述的一种甘蔗梢腐病的病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤(I)②所述PDA培养基的配方为:马铃薯100g，葡萄糖10g，琼脂Sg，蒸馏水0.5L。
4.根据权利要求1所述的一种甘蔗梢腐病的病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤⑷②b所述Buffer A是100mmol/L NaOH和2% Tween 20的混合溶液，所述离心的速度为800r/min，时间为10s。
5.根据权利要求1所述的一种甘蔗梢腐病的病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤⑷②d所述Buffer B是100mmol/L Tris-HCl和2mmol/L EDTA的混合溶液，所述离心的速度为800r/min，时间为10s。
6.根据权利要求1所述的一种甘蔗梢腐病的病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤(4)②e所述氯仿-异戊醇溶液中氯仿和异戊醇的体积比为24:1，所述离心的速度为12000r/min，时间为 1min0
【专利摘要】本发明公开了一种甘蔗梢腐病的病原菌的分离鉴定方法，属于植物病原菌分离技术领域。其包括如下步骤：(1)病原菌的分离；(2)病原菌的培养；(3)病原菌的电子显微镜检测；(4)病原菌的等温PCR鉴定。本发明既实现了甘蔗梢腐病的病原菌的体外分离、培养，又实现了甘蔗梢腐病的病原菌的快速鉴定，且可以准确检测甘蔗种子、亲本资源和育种中间材料在生长早期是否含有甘蔗梢腐病原复合物，将有效推动甘蔗的科研、育种及生产，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】C12Q1-04, C12Q1-68, C12N1-14, C12R1-645
【公开号】CN104830698
【申请号】CN201510219693
【发明人】李鸣, 梁朝旭, 方位宽, 吴凯朝, 经艳, 谭芳, 何姗珊, 曾媛, 王冠玉, 王伦旺
【申请人】广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年4月30日