一种检测肿囊腐霉的方法及专用试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种检测肿囊腐霉的方法及专用试剂盒。
【背景技术】
[0002] 玉米青枯病是我国玉米生产上最重要的病害之一。该病的发生引起玉米平 均减产5 %~20 %，严重发生区域可达100 %。玉米青枯病的发生可以引起玉米灌浆 困难、茎杆折断，进而引起玉米产量降低和影响玉米机械化收割，在连阴多雨的年份 表现尤为明显。在我国，玉米青枯病病原菌主要有：肿囊腐霉（Pythium inflatum)、 禾生腐霉（Ρ· graminicola)，禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum)和轮枝镰刀菌 (F. verticillioides)。在我国最大的玉米产区黄淮海玉米带，自1994年至今，肿囊腐霉一 直是引起玉米青枯病的优势病原菌。然而，至今未见对肿囊腐霉玉米青枯病有防治效果的 杀菌剂，这主要是由于该病原菌次年作为初侵染源的越冬孢子（卵孢子）具有约2μπι厚的 细胞壁。由于生产上缺乏抗病的品种，玉米青枯病一直是玉米生产上的主要问题，因此，开 发出一种高效快捷的肿囊腐霉检测方法，在玉米种植前，对土壤中的病菌进行动态监测，显 得尤为重要。
[0003] 肿囊腐霉所在的腐霉属包括140个确定的种。卵器、卵孢子、雄器和孢子囊的大小 和形状一度被科学家用来作为腐霉菌形态学鉴定的标准。然而，以形态学特征作为腐霉菌 的分类依据往往不准确，也费时费力，这是由于形态学特征在不同的培养条件下会产生变 化，或同一种也会产生表型差异；此外，一些腐霉菌之间存在形态相似性。特别地，肿囊腐霉 和近缘的禾生腐霉在形态上和生态型上都非常相似，因此，通过形态学特征对腐霉菌进行 种类划分往往无法进行下去。
[0004] 近年来，腐霉菌的核酸检测方法包括PCR、增强型PCR(booster PCR)、多重PCR、 实时PCR (real-time PCR)、PCR-限制性片段长度多态性、DNA寡核苷酸阵列和环等温介导 扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)等基于 PCR 的 DNA 扩增技术。 这些反应往往通过特异性的引物对核糖体DNA内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS)、细胞色素氧化酶II基因 、β -微管蛋白基因的靶片段进行扩增。现有的肿囊 腐霉检测方法主要基于booster PCR。这些检测手段是分析腐霉菌潜在侵染或早期侵染的 有效方法。然而，这些检测方法往往需要在实验室使用昂贵的仪器设备，耗费大量时间按照 固定的流程进行操作。此外，这些检测方法中设计的特异性引物并不能将肿囊腐霉与其近 缘种（如禾生腐霉）有效地区分开。
[0005] 除了 real-time PCR、booster PCR等可以用于定量检测腐霉菌等土壤病原菌。实 时焚光环介导等温扩增（real-time fluorescence LAMP, RealAmp)是一种可替代的用于检 测土壤病原菌的检测方法。
[0006] LAMP是2000年由日本的研宄人员Notomi等人发明的一种新型核酸扩增技术。该 技术主要是针对目标DNA的6个区域设计4条（特异性）引物，再利用一种链置换聚合酶 (Bst DNA聚合酶）在（恒温条件）下保温lh-2h，即可完成核酸扩增反应。在LAMP反应中， 不需要通过热变性将双链DNA变成单链。因为双链DNA在65°C左右处于动态平衡状态，任 何一条引物与双链DNA的互补部位进行碱基互补配对，在Bst DNA聚合酶的作用下延伸，另 一条链就会脱落变成单链。LAMP方法正是利用这一特点进行反应的。该方法克服了传统 PCR反复热变性的缺点，并大大节省了反应时间，从而实现在恒温条件下进行连续的快速扩 增，其灵敏度比PCR高出1~2个数量级。同时因为两对引物针对靶基因的6个区域，从而 使LAMP具有较好的特异性，该技术可以在30min到Ih内扩增出IO 9~10 1(1拷贝数。
[0007] LAMP反应结束后通过琼脂糖凝胶电泳，或伴随反应产生的焦磷酸酶沉淀，也可以 通过反应液中加入的染料在反应前后颜色的变化，通过测流装置检测反应中或反应完成后 整合到扩增产物中的特定标签进行检测，判断是否有靶标片段扩增。
[0008] 同样，也可以对LAMP反应的靶标进行实时定量监测：如对随着扩增的进行不断增 加的焦磷酸酶沉淀进行检测，从而达到对祀标进行定量的目的。而RealAmp通过ESE-Quant tube scanner (ESE Gmbh, Stockach, Germany)监测反应过程中检测焚光染料颜色的变化， 收集颜色变化的信号，通过仪器自带的程序对反应模板进行实时定量，是近年来新发展的 一种新型的实时定量LAMP检测方法。此外，也可以通过在反应前在反应管盖上加入SYBR Green I染料，通过反应前后染料颜色的变化，对扩增反应进行定性检测。RealAmp跟普 通LAMP相比，不需要借助昂贵的仪器和试剂，同时反应快捷、灵敏，由于ESE-Quant tube scanner自带电源，因此可以在田间进行操作。
[0009] 作为土壤传播的病原菌，肿囊腐霉在土壤中可以长期存活，玉米植株受该病菌侵 染后，无法进行有效的防治。因此，开发一种省时省力、能够对土壤中的存活的肿囊腐霉进 行灵敏、定量的检测方法对该病害的预防显得尤为必要。
【发明内容】
[0010] 本发明的第一个目的是提供一种检测肿囊腐霉的环介导等温扩增引物组。
[0011] 本发明所提供的检测肿囊腐霉的环介导等温扩增引物组，具体可为引物组A或引 物组B。
[0012] 所述引物组A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；所述引物组 B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；
[0013] 所述引物1(F3)、所述引物2(B3)、所述引物3$1朽、所述引物4出1朽、所述引物 5(L 〇〇F)和所述引物6(L〇〇B)的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列 4、序列5和序列6。
[0014] 本发明的第二个目的是检测肿囊腐霉的环介导等温扩增试剂。
[0015] 本发明所提供的检测肿囊腐霉的环介导等温扩增试剂，包括链置换型DNA聚合 酶、甜菜碱、dNTPs、Mg 2+和所述引物组。
[0016] 当所述引物组为所述引物组A时，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引 物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg 2+、所述链置换型DNA聚合酶和所述甜菜 喊在所述扩增试剂中的配比为 5pmol :5pmol :40pmol :40pmol :20pmol :20pmol :40nmol : 200nmol :8U :25 μ mol〇
[0017] 当所述引物组为所述引物组B时，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物 4、所述dNTPs、所述Mg 2+、所述链置换型DNA聚合酶和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比 为 5pmol :5pmol :40pmol :40pmol :40nmol :200nmol :8U :25ymol〇
[0018] 在本发明中，所述链置换型DNA聚合酶具体可为Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合 酶大片段。
[0019] 在本发明中，所述检测肿囊腐霉的环介导等温扩增试剂组成如下：每23-24 μ 1所 述试剂中含有各5pmol的所述引物1和所述引物2、各40pmol的所述引物3和所述引物 4、各 20pmol 的所述引物 5 和所述引物 6、40nmol 的 dNTP、200nmol 的 MgS04、8U 的 Bst DNA 聚合酶、25μπιο1 的甜菜碱、500nmol 的 Tris · HCl(pH 8.8)、250nmol 的 KCl、250nmol 的 (NH4)2S04、0. 025 μ 1 的 Tween 20,5nmol 的 SYTO-9 荧光染料；余量为水。
[0020] 本发明的第三个目的是提供一种检测肿囊腐霉的环介导等温扩增试剂盒。
[0021] 本发明所提供的检测肿囊腐霉的环介导等温扩增试剂盒，含有所述引物组或所述 试剂。
[0022] 所述试剂盒中还包括荧光染料。
[0023] 所述荧光染料为SYTO-9荧光染料和/或SYBR Green I荧光染料。
[0024] 如下a)或b)的应用也属于本发明的保护范围：
[0025] a)所述引物组在制备所述试剂或所述试剂盒中的应用；
[0026] b)所述的引物组或所述试剂或所述试剂盒在检测肿囊腐霉或制备检测肿囊腐霉 的产品中的应用。
[0027] 本发明的第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中是否含有肿囊腐霉 的方法。
[0028] 本发明所提供的检测或辅助检测待测样品中是否含有肿囊腐霉的方法，具体可包 括如下（a)和（b)的步骤：
[0029] (a)以从待测样品中提取的基因组DNA为模板，用所述引物组进行环介导等温扩 增；
[0030] (b)根据步骤（a)的扩增结果，按照如下（bl)或（b2)的方法确定所述待测样品中 是否含有肿囊腐霉：
[0031] (bl)反应结束后，将所述待测样品的反应液进行琼脂糖凝胶电泳，若出现阶梯状 条带，则所述待测样品中含有或候选含有肿囊腐霉；反之，则所述待测样品不含或候选不含 有肿囊腐霉；
[0032] (b2)反应结束后，向所述待测样品的反应液中加入SYBR Green I荧光染料，然后 观察所述反应液的颜色变化；
[0033] 若所述待测样品反应液为绿色，则所述待测样品中含有或候选含有肿囊腐霉；若 所述待测样品反应液为橘黄色，则所述待测样品中不含有或候选不含有肿囊腐霉。
[0034] 在所述（b2)中，所述SYBR Green I荧光染料与所述待测样品的反应液的体积配 比具体可为1:25。
[0035] 其中，所述待测样品可源自于土壤或植物病残体等，既可含有肿囊腐霉，也可不含 肿囊腐霉。
[0036] 本发明的第五个目的是提供一种检测待测样品中肿囊腐霉含量的方法。
[0037] 本发明所提供的检测待测样品中肿囊腐霉含量的方法，具体可包括如下（C)和 (d)的步骤：
[0038] (c)以具有序列表中序列7的第406-688位所示核苷酸序列的DNA样品作为肿囊 腐霉标准品，将所述肿囊腐霉标准品进行梯度稀释，以所得系列浓度的所述肿囊腐霉标准 品的溶液分别作为模板，用所述引物组进行实时荧光环介导等温扩增，获得对应于各所述 肿囊腐霉标准品的溶液的反应时间阈值，以所述反应时间阈值为纵坐标，以所述肿囊腐霉 标准品的溶液中所述肿囊标准品的浓度为横坐标，得到标准曲线方程；
[0039] (d)以从待测样品中提取的基因组DNA为模板，用所述引物组进行实时荧光环介 导等温扩增，获得对应于所述待测样品的基因组DNA的反应时间阈值，然后根据所述标准 曲线方程计算得到所述待测样品中肿囊腐霉的含量。
[0040] 其中，进行所述实时荧光环介导等温扩增获得所述反应时间阈值具体为：在 ESE-Quant Tube Scanner 管内比色 / 焚光检测系统（Embedded Systems Engineering GmbH, Stockach, Germany)进行所述实时焚光环介导等温扩增，每间隔Imin采集1次焚光信 号，通过6-羧基荧光素通道（487nm激发，525nm检测）收集荧光数据，荧光达到阈值时的时 间点即为所述反应时间阈值。
[0041] 所述待测样品含肿囊腐霉，可源自于土壤或植物病残体等。
[0042] 在本发明中，所述环介导等温扩增反应具体为60_65°C (如65°C )条件下的恒温 反应 20-90min (如 60min)。
[0043] 在本发明中，进行所述环介导等温扩增时，所述引物1和所述引物2在反应体系中 的终浓度为0. 2 μ M，所述引物3和所述引物4在反应体系中的终浓度为1. 6 μ M，所述引物5 和所述引物6在反应体系中的终浓度为0. 8 μ Μ。所述反应体系（25 μ 1)具体可由1-2 μ 1 所述基因组DNA与23-24 μ 1所述试剂组成。
[0044] 本发明提供的方法是利用实时焚光环介导等温扩增（real-time fluorescence LAMP, RealAmp)特异性的对土壤和植物病残体中的肿囊腐霉（包括菌丝体和卵