黄曲霉毒素g1酶联免疫检测试剂盒的制备及检测方法
【专利摘要】本发明是一种用于检测花生、谷物以及奶制品中黄曲霉毒素G1的酶联免疫检测试剂盒。本试剂盒是利用竞争ELISA方法，在酶标板微孔上预包被黄曲霉毒素G1抗原。检测时，加入标准品或样品溶液，黄曲霉毒素G1抗体及酶标记物，包被抗原和加入样本中的黄曲霉毒素G1竞争性地与黄曲霉毒素G1抗体结合，洗去未结合的抗原抗体，已结合的抗原-抗体复合物再与酶标记物结合，洗去未结合的抗原、抗体，经TMB底物显色；加入反应终止液，在450/630nm双波长酶标仪下进行检测，样品中的黄曲霉毒素G1浓度与吸收光强度成反比，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中黄曲霉毒素G1的含量。
【专利说明】黄曲霉毒素G1酶联免疫检测试剂盒的制备及检测方法
【技术领域】
[0001]一种检测黄曲霉毒素Gl的酶联免疫分析试剂盒及检测方法，属于生物及食品安全检测【技术领域】，可用于对花生、谷物、奶制品中黄曲霉毒素Gl (AFGl)含量的检测。
【背景技术】
[0002]黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是一种能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素(AFT)目前已发现20余种，其中黄曲霉毒素BI为毒性及致癌性最强的物质。黄曲霉毒素Gl的毒性仅次于黄曲霉毒素BI，是一种强致癌物质。有研究表明，它比AFBl具有更强的诱发肾脏肿瘤的潜力。它是我国太行山南部食管癌、肺癌高发区(如河北省磁县)居民饮食中的主要污染真菌毒素之一，其检出率和含量均相当高。
[0003]
【权利要求】
1.用于检测黄曲霉毒素Gl的酶联免疫试剂盒，是由96或48孔的包被板(I)，黄曲霉毒素Gl标准品(2)，AFG1-BSA (3)，抗黄曲霉毒素Gl的单克隆抗体(4)，酶标记的羊抗兔抗体(5)，洗涤液(6)，显色液A (7)，显色液B (8)和终止液(9)所组成。
2.所述的酶标记的羊抗兔抗体为辣根过氧化物酶标记的抗体冻干品，洗涤液为含有吐温的Tris-HCL缓冲液，显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，显色液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，终止液为2 M的硫酸溶液。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的包被板(I)包被固相抗原，用50mmol/LpH9.6Na2CO3-NaHCO3的缓冲液将AFGl-BSA稀释至10 mg/L作为包被液，96孔或48孔微孔板各加入100 μ L，37 °C下避光孵育2 h，弃去包被液，洗涤2次，加入150 μ L含3 %BSA的上述Na2CO3-NaHCO3缓冲液封闭，37 °C下避光孵育1.5 h，弃去封闭液，晾干，板条密封后置_20°C冷冻保存。
4.根据权利要求书I所述的试剂盒，其中的黄曲霉毒素Gl标准品(2)，从AFGl纯品中稀释得到，稀释液为甲醇:水体积比为4:6，共6瓶，AFGl浓度分别为O ng/mL，0.025 ng/mL,0.1 ng/mL,0.25 ng/mL,0.5 ng/mL,1.5 ng/mL。
5.根据权利要求书I所述的试剂盒检测黄曲霉毒素Gl的方法，其特征是取包被的有AFGl-BSA的微孔包被板，加入AFGl标准品和处理好的样品到各自的微孔中，加HRP-羊抗兔抗体，再加入AFGl抗体，轻轻振荡反应，洗涤液洗涤,加显色液A和显色液B，避光反应后加终止液，在酶标仪下测吸光值，对照标准曲线计算样品中的AFGl含量。
6.根据权利要求5所 述的测黄曲霉毒素Gl的方法，其操作为:取包被有AFGl-BSA的微孔包被板，加入50 μ L的AFGl标准品和处理好的样品到各自微孔中，加入50 μ L HRP-羊抗兔抗体，再加50 yL抗AFGl抗体，25 °C下避光反应30 min，洗滴液洗板5次，25 °〇下避光反应30 min，洗涤液洗板5次，加显色液A和显色液B，25 °C下避光反应15 min，加终止液，在450/630 nm双波长下测量吸光值，对照标准曲线计算样品中的AFGl含量。
7.根据权利要求5所述的检测黄曲霉毒素Gl的方法，其中的样品处理方法为(I)谷物:取5 g粉碎样品，加入25 mL样品提取液，充分振荡混匀5-10 min, 4000 r/min离心5min,或用定量分析滤纸过滤，取0.2 mL离心后的上清液或过滤后的滤液加入到I mL样品稀释液中进行稀释并充分混匀，取50 μ L稀释后的样品待测；(2)花生:取5 g粉碎的样品，加入20 mL石油醚或正己烷和25 mL样品提取液，充分振荡混匀5-10 min，离心或静置分层后去除上层液体，取0.2 mL下层液体加入到I mL样品稀释液中进行稀释并充分混匀，取50 μ L稀释后样品待测；(3)奶粉:取5 g奶粉于50 mL尚心管中，加入10 mL样品提取液，剧烈振荡5 min,过滤或4000 r/min离心5 min,取I mL上清,加入1.5 mL的去离子水和2.5 mL的石油醚或正己烧,振荡摇匀,4000 r/min离心5 min,将下层液体转移到另一洁净离心管中，用于检测
【文档编号】G01N33/577GK103792359SQ201210435492
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年11月5日 优先权日:2012年11月5日
【发明者】杜道林, 王永美 申请人:江苏维赛科技生物发展有限公司