一种黄曲霉毒素b1的单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种黄曲霉毒素 B1的单克隆抗体及其应用。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素 B1主要存在于霉变的花生、谷物、果仁和大米中。因其对人、畜肝脏的 剧烈损害而名列毒性之首。它们常存在于各种动物饲料和人类食品中。用污染的饲料饲养 畜禽，会导致肉、乳及其制品的污染，所W必须注意检查特别容易受黄曲霉毒素污染的食品 原材料，W及用运些原材料加工的食品中的黄曲霉毒素，运些食品有花生、核桃、开屯、果、杏 仁、桃仁和李仁、挪丝、芝麻和各种粮食。人类食用被污染的食品会导致急性中毒，引起肝脏 坏死出血，慢性中毒可引起肝癌。同时用被污染的饲料饲养畜禽会使畜禽生产率降低，增重 减慢，造成重大经济损失。迄今为止，急性AFT中毒病例在世界上许多国家，尤其在发展中国 家报道较多。因此各国对食品及饲料AFTB1的限量进行了规定，欧盟等国在2002年对粮食、 花生及其产品中的AFTB1的限量进行了修订，再次提高上述农产品中的AFTB1的限量标准， 如供人类直接食用的花生AFTB1限量为< ^g/kg，作为食品原料进口的花生AFTB1限量为< 祉g/kg。我国也先后于1982、1992和1998年制定并实施了食品和饲料中AFTB1允许含量的强 制性国家标准，但限量要求仍低于国外。
[0003] 我国在食品中真菌毒素限量GB 2761-2005版和2011版中，分别规定了花生、玉米、 大米、植物油、豆类、发酵食品W及乳制品中黄曲霉毒素 B1、M1的限量值，在2011年的新版本 中并没有改变黄曲霉毒素 B1在上述食品中的最高限量值。欧盟在2010年的2月27日颁布了 化U)No 165/2010号法规中，规定了谷物，油巧，调味料和坚果中的黄曲霉毒素含量的最高 限量。该规则修订化C)No 1881/2006条例中关于食品中黄曲霉毒素的最大限量值。该条例 已于2010年3月6日起正式生效。
[0004] 近年来，关于AFTB1的检测方法研究较多，大致可分为薄层层析法(TLC)、液相色谱 法化PLC)和酶联免疫法化LISA)。薄层层析法虽为GB5009.22-2003《食品中黄曲霉毒素 B1的 测定方法》中的第一检测法，但是该方法不专一，容易使样品中的其他巧光物质对其测定 造成干扰。液相色谱法专一性较强，但实验过程繁琐，容易造成被测物质的损失，且所需仪 器设备昂贵，降低了其推广性。酶联免疫法是当今测定黄曲霉毒素 B1较常用的方法之一，该 方法推出前国标一直使用的化C法测定AFB1。用化C法测定AFB1，步骤多，耗时长，所用试剂 繁多，且只能实现半定量。在实验的操作过程中，实验员必须和毒素长时间直接接触，不适 合大批量样品的检测，也无法实现快速。而化ISA法灵敏度高，分析速度快，简化了提取和纯 化的步骤，整个实验仅需要化，且可W-次测定多个样品，正是ELISA独特的优点，使得其在 1998年就被写进当时的国家标准，作为第二法来辅助第一法(高效液相色谱法），在使用色 谱法之前先利用该法对样品进行初筛，有针对性的对样品进行定量检测。
[0005] 在实际的检测活动中化ISA酶联免疫法的使用较为普遍，因为化ISA法不需要专用 的大型设备、对操作人员要求也不高、成本也相对较低，所W化ISA法已经被很多企业和检 验检测机构所采用，作为阳性样品的初筛工具。但由于同类分子的相似性，AFB1的化ISA等 免疫检测方法容易对结构相似的其他黄曲霉毒素或化学物质产生一定的交叉反应性，影响 实验的准确度。
【发明内容】
[0006] 为获得一种灵敏度较高，特异性较强的，可适用于检测AFTB1的抗体及其应用，本 发明人对此经过大量的深入研究，在付出了充分的创造性劳动后，从而完成了本发明。
[0007] 一种可分泌AFTB1单克隆抗体的杂交瘤细胞4D5,保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中屯、，保藏号为CGMCC 11199,保藏日期为2015年9月23日，保藏地址为北 京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[000引上述杂交瘤细胞4D5在制备AFTB1检测试剂或者检测设备中的应用。
[0009] -种由所述杂交瘤细胞4D5分泌的抗AFTB1单克隆抗体。
[0010] 所述抗AFTB1单克隆抗体在制备AFTB1检测试剂或检测设备中的应用。
[0011] 本发明提供的杂交瘤细胞株制备过程，步骤为:将黄曲霉毒素 B1溶于0.5ml生理盐 水中，加入等体积佐剂制成乳化剂，免疫雌性BALB/c小鼠3次，第一次免疫剂量为第二Ξ次 的2倍，最后一次加强免疫用与第Ξ次一样免疫剂量无佐剂的AFTB1，免疫49天后进行细胞 融合。用间接化ISA法检测细胞培养上清液，选出阳性产抗黄曲霉毒素 B1抗体的单克隆孔， 挑出阳性高，阻断情况好的单克隆孔继续做亚克隆，直至最后一次克隆有细胞的孔都为阳 性产目的抗体。采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆。用间接化ISA法检测细胞培养上清 液，选出阳性产抗黄曲霉毒素 B1抗体的单克隆孔，挑出阳性高，阻断情况好的单克隆孔继续 做亚克隆，直至最后一次克隆有细胞的孔都为阳性产目的抗体。
[0012] 本发明提供的抗黄曲霉毒素 B1单克隆抗体的制备方法，步骤如下:采用小鼠体内 诱生腹水的方法制备单克隆抗体。取健康BALB/c雌性小鼠，注入液体石蜡0.5ml，1~2周后 备用。将扩大培养的阳性克隆杂交瘤细胞用基础培养液制备成细胞悬液，细胞计数后，将细 胞数调至1〇6个/ml,注射小鼠腹腔ImL/只。7~10天后收集腹水，一只小鼠可获5~lOmL腹 水，300化pm离屯、lOmin，弃脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，分装，-70°C冻存。
[0013] 按上述方案，所述单克隆抗体的纯化步骤为：
[0014] ①腹水的预处理采用二氧化娃吸附法:取一定量的腹水，加等量己比妥缓冲盐水 (VBS)稀释。加适量二氧化娃粉末，室溫30min，不时摇动。2000g离屯、20min，即得澄清的腹 水。
[0015] ②辛酸一硫酸锭沉淀法纯化IgG:向一份预处理过的腹水中加入两份0.06M、抑5.0 的乙酸缓冲液，用0.1N肥1调抑至4.8。于室溫揽拌下在30min内逐滴缓慢加入辛酸，每ml稀 释前的腹水加33μ1，4Γ静置化，15000g离屯、30min，弃沉淀。上清经砂屯、漏斗过滤，加入1/10 体积的0.1M PBS;用1N化0H调pH至7.4。于4°C冰浴下于30min内加入0.277g/ml的（NH4) 2S04，使其达到45 %的饱和度;静置比W上。4°C下lOOOOg离屯、30min，弃上清。沉淀溶于适量 抑7.4,含137mM化Cl，2.6mM KCl，0.2mM抓TA的PBS中，对50~100倍的PBS于4°C透析过夜。 4°C下lOOOOg离屯、30min，除去不溶性沉渣。
[0016] ③亲和层析纯化IgG:
[0017] (1)柱子用结合buffer平衡10个柱体积(约10ml);
[0018] (2)样品用0.45皿的滤器过滤去除不溶物，与结合buffer按1:1(V:V)混合。用注射 器进样，然后依次用10个柱体积（约10ml)洗脱Buffer B1和Buffer B2洗脱，并分别加入 0.5ml和 1.3ml中和Buffer C;
[0019] (3川欠集Buffer B1洗脱液和Buffer B2洗脱液，对5mM PBS透析，浓缩备用。
[0020] 即得纯化好的抗黄曲霉毒素 B1单克隆抗体。
[0021] 本发明的有益效果在于：
[0022] 本发明提供的杂交瘤细胞株可W用于制备高效价抗黄曲霉毒素 B1单克隆抗体，抗 黄曲霉毒素 B1小鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析化LISA)法测得的效价可达1:100000,培养 液效价1:20000~1:100000之间。
[0023] 本发明提供的抗黄曲霉毒素 B1单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对黄曲霉毒素 B1 的亲合常数在1〇8~1〇>-1之间。
[0024] 本发明提供的抗黄曲霉毒素 B1单克隆抗体可应用于测定黄曲霉毒素 B1含量。
【附图说明】
[00巧]图1校准曲线图
【具体实施方式】
[0026] 下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但运些例举性实施方式的用途和 目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将 本发明的保护范围局限于此。
[0027] 实施例1、杂交瘤细胞株的筛选
[0028] 1、动物饲养及处理
[0029] 健康雌性BALB/c小鼠先饲养观察1周，无异样，断尾取血，W间接竞争化ISA分析血 清，阴性者用于制备抗体，阴性血清-20°C保存备用。
[0030] 1.1动物免疫
[0031] 将黄曲霉毒素 B1溶于0.5ml生理盐水中，加入等体积佐剂制成乳化剂，免疫雌性 BALB/c小鼠。第Ξ次免疫后7~lOd测定血清效价。免疫程序见表1。
[0032] 表1动物免疫程序
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[00巧]1.2血清效价的测定
[0036] 免疫后的BALB/c小鼠尾部采血0.1ml，3000巧m离屯、5min，收集血清，4°C保存。用 ELISA法测定血清效价。
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