] (1)包被抗原：用包被缓冲液将包被抗原稀释至适当的工作浓度(2μg/ml);加入到 酶标板中，每孔1〇化1，4°C过夜;然后弃去孔内的液体。
[0038] (2)封板:每孔加封板液20化1，37°C湿盒解育化，然后用洗涂缓冲液洗3次，每次 90s (简称洗涂，下同），拍干。
[0039] (3)加待测血清样品:将血清样品倍比稀释后加入酶标板中，每孔10化1;同时设空 白对照、阴性对照和阳性对照各巧U37°C解育0.化，洗涂、拍干。
[0040] (4)加酶标第二抗体:先用稀释液将酶标第二抗体稀释到适当的工作浓度，每孔加 入10化1，置37°C解育0.化;然后洗涂、拍干。
[0041 ] (5)加底物溶液:各孔加新鲜配置的底物A、底物液B各10化1，37 °C解育15min。
[0042] (6)终止反应:每孔加终止液50μ1。
[0043] (7)判定结果:测定0化5〇n"，W空白孔调零，若待测孔0D值大于或等于阴性对照孔的 2.1倍，即为阳性，运样可W得出血清的效价(结果见表2)。
[0044] 经第3次免疫后，测定小鼠血清中抗体的效价，效价最高达到1:4.2X105(表2)。
[0045] 表2免疫动物的血清效价
[0046]
[0047] 2、细胞融合
[004引（1)免疫细胞悬液的制备：
[0049] 取免疫效价高的BALB/c小鼠，融合前3天超免。处死小鼠，在75%酒精中浸泡消毒 5min。取出小鼠，移入超净工作台，小鼠腹部朝上固定在解剖版上，剪开腹部皮肤和腹膜，找 到脾脏。注意无菌操作。取出脾脏后，将脾脏上的结缔组织去除干净，置于包有120目尼龙纱 布的小烧杯，用少量DMM培养液湿润纱布和脾脏。剪碎脾脏，用摄子轻轻研磨，用少量DMEM 培养液冲洗，脾细胞被过滤到烧杯中。离屯、收集脾细胞。
[0050] (2)饲养细胞的制备：
[0051] 取小鼠，放血致死，收集血液，制备血清留作阴性血清备用。于75%的酒精中浸泡 消毒5min。在超净台中小鼠腹部朝上，固定在解剖板上，无菌操作剪开腹部皮肤，，露出腹 膜。用酒精棉球对腹膜进行消毒。小屯、提起腹膜，腹腔注射5mL4°C预冷的不完全DMEM培养 基，反复柔打腹部数次，再吸回注射器中，注入离屯、管。100化pm离屯、lOmin，弃上清。先用5ml HAT培养液将沉淀细胞悬浮并混匀，作细胞计数，然后根据细胞计数结果，补加 HAT培养基至 40血，充分混匀。按照将饲养细胞悬液加入4块96孔培养板，每孔0.1ml。置于37°C、5%C02培 养箱中培养。
[0052] (3)骨髓瘤细胞悬液的制备：
[0053] 融合前一周复苏SP2/0骨髓瘤细胞于完全DMEM培养液中。用20μg/ml的8-氮杂鸟嚷 岭来处理骨髓瘤细胞，使其对HAT呈均一的敏感性。选择呈对数生长的细胞，于融合前48~ 36h，将骨髓瘤细胞扩大培养于100ml细胞培养瓶中，每瓶加10ml培养液，置37 °C、5 %C〇2溫 箱内培养。融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50ml离屯、管内。10(K)rpm离 屯、5min，弃去上清。沉淀中加入30ml不完全培养液，同上离屯、洗涂一次。然后将细胞重悬至 10ml DMEM培养液中，混匀。取瘤细胞悬液，加台酪兰染液进行活细胞计数后备用。
[0054] (4)细胞融合：
[005引分别吸取含IX 108个脾细胞和2~3 X107个骨髓瘤细胞的悬液量，加入到一只50ml 离屯、管中，补加不完全培养液至30ml，充分混匀。用lOOOrpm离屯、7min，将上清尽量弃去。轻 轻弹击管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状。一手均匀转动离屯、管，另一手用1ml吸管吸取 50 %的PEG溶液1ml，并沿转动的管壁(尽量接近细胞处）加入，从加入到加完的时间控制在 60s左右，然后立即将细胞悬液全部吸入吸管(时间控制在30s左右），静置30s，再将其吹入 离屯、管内（时间也控制30s左右）。立即在5min内加入25ml不完全培养液，使PEG稀释而失去 促融作用。具体加法是第Imin加1ml，第2min加4ml (均应边加边轻轻转动离屯、管），随后的 3min内将剩余液体加完。所有操作过程保持在37 °C。用80化pm离屯、7min，弃去上清。加入 10ml HAT培养液，轻轻吹吸沉淀的细胞，使其悬浮并混匀。将细胞悬液加入已铺有饲养细胞 的96孔培养板中，每孔0.1ml (相当于2滴）。然后将培养板置37 °C，含5 % C02的培养箱内培 养。
[0056] (5)选择性培养融合后4~5d显微镜下观察杂交瘤细胞的生长情况，并作记录，如 发现污染，对有污染的孔采用高浓度抗生素清洗处理，融合后5~6d，取单克隆孔的培养上 清液，ELISA法检测其效价及阻断情况，融合后7~lOd，细胞集落约显微镜下~1/2视野 大小，更换为HT培养液，换液时，用消毒的8孔移液器和灭菌枪头每孔吸去0.1ml细胞上清 液，每个枪头只用于一个孔，随后用滴管吸取HAT培养液，每孔滴加两滴约0.1ml，封盖，37 °C，含5%C02的培养箱内培养。
[0057] (6)杂交瘤细胞株的筛选及扩大培养
[0058] 用间接化ISA法检测细胞培养上清液，选出阳性产抗黄曲霉毒素 B1抗体的单克隆 孔，挑出阳性高，阻断情况好的单克隆孔继续做亚克隆，直至最后一次克隆有细胞的孔都为 阳性产目的抗体。本实验采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆。
[0059] 有限稀释法可W弥补因细胞计数不准确带来的误差。按照前面的方法制备饲养细 胞悬液，取阳性较高，抗体敏感性好的孔，用弯头吸管吹打均匀，WHT培养基分别倍比稀释 至1个/孔或0.5个/孔，检测培养上清。挑选保持强阳性的孔继续进行亚克隆。为保证细胞生 长，每一次亚克隆制备饲养细胞滴加96孔板中，为保证饲养细胞沉降完全，一般融合前一日 制备。
[0060] 实施例2、单克隆抗体的大量制备及纯化
[0061] 1、单克隆抗体的大量制备
[0062] 采用小鼠体内诱生腹水的方法制备单克隆抗体。取健康BALB/c雌性小鼠，注入液 体石蜡0.5ml，l~2周后备用。将扩大培养的阳性克隆杂交瘤细胞用基础培养液制备成细胞 悬液，细胞计数后，将细胞数调至1〇6个/ml,注射小鼠腹腔ImL/只。7~10天后收集腹水，一 只小鼠可获5~lOmL腹水，3000rpm离屯、lOmin，弃脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，分装，- 70°C冻存。
[0063] 2、单克隆抗体的纯化
[0064] 腹水的预处理采用二氧化娃吸附法：取一定量的腹水，加等量己比妥缓冲盐水 (VBS)稀释。加适量二氧化娃粉末，室溫30min，不时摇动。2000g离屯、20min，即得澄清的腹 水。
[0065] 辛酸一硫酸锭沉淀法纯化IgG:向一份预处理过的腹水中加入两份0.06M、抑5.0的 乙酸缓冲液，用0.1N肥1调抑至4.8。于室溫揽拌下在30min内逐滴缓慢加入辛酸，每ml稀释 前的腹水加33μ1，4Γ静置化，15000g离屯、30min，弃沉淀。上清经砂屯、漏斗过滤，加入1/10体 积的0.1M PBS;用1N化0H调pH至7.4。于4°C冰浴下于30min内加入0.277g/ml的（NH4)2S04， 使其达到45%的饱和度；静置IhW上。4°C下lOOOOg离屯、30min，弃上清。沉淀溶于适量 抑7.4,含137mM化Cl，2.6mM KCl，0.2mM抓TA的PBS中，对50~100倍的PBS于4°C透析过夜。 4°C下lOOOOg离屯、30min，除去不溶性沉渣。
[0066] 亲和层析纯化IgG:
[0067] (1)柱子用结合buffer平衡10个柱体积(约10ml);
[0068] (2)样品用0.45皿的滤器过滤去除不溶物，与结合buffer按1:1(V:V)混合。用注射 器进样，然后依次用10个柱体积（约10ml)洗脱Buffer B1和Buffer B2洗脱，并分别加入 0.5ml和 1.3ml中和Buffer C;
[0069] (3川欠集Buffer B1洗脱液和Buffer B2洗脱液，对5mM PBS透析，浓缩备用。
[0070] 融合后第8天，采用化ISA法检测96孔细胞板中的融合细胞的培养液。黄曲霉毒素 B1杂交瘤细胞株中发现10个强阳性孔，选择强阳性克隆株进一步克隆化，经3次克隆，筛选 出6株强阳性单克隆细胞，分别为3F6、2C7、5G4、3F5、6C3、6A2。
[0071] 实施例3、单克隆抗体的鉴定
[0072] 1、抗体的类及亚型
[0073] 取阳性杂交瘤细胞的培养液，200化pm离屯、8min去除细胞及其碎片，按照使用说明 书用Immuno化re Monoclonal Antibody Isotyping Kit I测定Mabs的类和IgG亚类及轻 链的亚型，方法仍为前述间接法化ISA。
[0074] 采用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒进行鉴定，具体操作步骤如下：
[0075] (1)用无菌PBS W1:1000倍稀释各种亚类鉴定试剂，IgM、IgA、IgGl、IgG2a、IgG2b、 IgG3〇
[0076] (2)加入稀释的亚类鉴定试剂，0.1ml/孔。每种亚类试剂加2平行对照。
[0077] (3)37°C 反