一种长爪沙鼠的肝星状细胞的分离和培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及肝星状细胞的分离培养领域，具体涉及一种长爪沙鼠的肝星状细胞的分禺和培养方法。
【背景技术】
[0002]肝星状细胞(hepaticstellate cel I，HSC)，又称储脂细胞(Fat-store cell，FSC)、间质细胞，主要分布于肝细胞与肝窦内皮细胞之间的窦周隙内(Disse间隙)ASC在肝纤维化的发生发展中具有核心作用，是促进肝纤维化发展的主要因素。静息状态的HSC主要参与维生素A的代谢调节，当肝脏受到化学、物理及生物因素刺激而发生损伤后，HSC发生增殖并被活化，合成以胶原蛋白为主的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)及各类细胞因子如MMPs、TNF-a等，参与受损肝组织的修复。刺激持续发生时，HSC大量激活，引发ECM的合成与降解失衡，进而导致肝脏内结缔组织异常沉积，发生肝纤维化。
[0003]肝星状细胞是肝纤维化的主要效应细胞，在肝窦内，还有肝窦内皮细胞、kupffer细胞等。肝星状细胞占整个肝脏细胞的8.00?13.00%左右，被认为是肝脏中主要的贮存和代谢维生素A的细胞。肝星状细胞激活并转化为肌成纤维细胞样细胞，各种致纤维化因素均把HSC(肝星状细胞)作为最终靶细胞，正常情况下肝星状细胞处于静止状态。当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，肝星状细胞被激活，其表型由静止型转变为激活型。激活的肝星状细胞一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。
[0004]国内一些作者采用原位灌流法分离HSC，因肝脏在体灌注，灌注液不易回收，酶的用量较大，且难以掌握酶灌流时的温度，肝消化后摘取困难。目前针对大、小鼠分离培养HSC的方法已经较为成熟，但是国内尚无关于长爪沙鼠HSC的研究，而国外也尚未建立完善的培养体系，且长爪沙鼠HSC的研究不同于大、小鼠，彼此不能相互借鉴。
[0005]申请公布号为CN103805553A(申请号为201210455728.4)的中国发明专利申请公开了一种小鼠肝星状细胞的分离方法，通过插管固定、灌注消化、细胞分散、小鼠肝星状细胞分离等步骤完成对小鼠肝星状细胞的分离。用上述方法得到了需要的小鼠肝星状细胞，质量很好，比传统大鼠的分离质量好很多，而且在整个过程比较便捷，在普通实验室就能完成，很稳定，由于采用了小鼠，不用一些特殊的设备，降低了这种分离方法的成本，在得到高质量的小鼠肝星状细胞，为进一步深入研究小鼠肝星状细胞的生物学行为创造了条件。该技术方案采用原位灌流法分离HSC，因肝脏在体灌注，灌注液不易回收，酶的用量较大，且难以掌握酶灌流时的温度，肝消化后摘取困难。同时该技术方案不适合用于长爪沙鼠HSC。
【发明内容】
[0006]针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种长爪沙鼠的肝星状细胞的分离方法，能够提高肝星状细胞的产量和活率，可以保证HSCs纯度。
[0007]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0008]一种长爪沙鼠的肝星状细胞的分离方法，包括:
[0009]I)将长爪沙鼠的肝脏，先移入联合酶液中灌注消化，然后去除肝包膜和Glisson鞘，粉碎肝脏呈糊状，再移入混合酶液，搅拌消化，得到搅拌消化后的产物；
[0010]2)向搅拌消化后的产物中加入第一 Hank ’ s液，过滤，得肝组织;然后向肝组织中加第二Hank’ s液，初步离心，得沉淀；用第三Hank’ s液重悬沉淀，再向其加入Nycodenz液混勾，再次离心，得浑浊带，浑浊带即为分离得到的肝星状细胞。
[0011]本发明的分离方法，成功地分离了长爪沙鼠的肝星状细胞，简便可行，并为进一步研究HSC与肝纤维化的关系奠定了基础。同时，本发明方法能够提高肝星状细胞的产量和活率，可以保证HSCs纯度，为进一步研究肝星状细胞在肝损伤后细胞基质的沉积及纤维化的形成奠定了基础。
[0012]以下作为本发明的优选技术方案:
[0013]步骤I)中，所述的长爪沙鼠的肝脏的获得包括:对长爪沙鼠进行开腹，游离腹主动脉，向游离腹主动脉中灌注预灌注液，取下肝脏，即得到长爪沙鼠的肝脏。
[0014]所述的长爪沙鼠为生前体重400g左右(400g±50g)、营养状况良好的长爪沙鼠；体重较轻者，可预先用维生素A处理，即通过维生素A灌胃，确保肝星状细胞具有一定的浮力。
[0015]所述的预灌注液为4°C、含肝素25U/ml的Hank’s液。
[0016]所述预灌注液的用量为50ml/只。
[0017]所述的联合酶液，由以下体积百分数的组分组成:0.02%?0.08%的链酶蛋白酶和0.05%?0.2%的胶原酶以及余量的Hank’s液，进一步优选，由以下体积百分数的组分组成:0.05 %的链酶蛋白酶、0.1 %的胶原酶以及余量的Hank’ s液。
[0018]所述的灌注消化的条件为:35°C?39°C灌注消化5?20min;进一步优选，所述的灌注消化的条件为:37°C灌注消化lOmin。
[0019]所述的混合酶液，由以下体积百分数的组分组成:0.02%?0.08%的链酶蛋白酶、
0.05%?0.2%的胶原酶、0.0005%?0.003%的DNaseI以及余量的Hank’s液。进一步优选为，由以下体积百分数的组分组成:0.05%的链酶蛋白酶、0.1 %的胶原酶、0.001 %的DNaseI以及余量的Hank’s液。
[0020]所述的搅拌消化的条件为:35 °C?3 9 °C搅拌消化1?2 O m i η;进一步优选，所述的搅拌消化的条件为:3 7 °C搅拌消化1?15m i η。
[0021 ] 步骤2)中，第一Hank’s液、第二Hank’s液和第三Hank’s液均为Hank’s液，可采用现有技术。
[0022]所述的过滤采用80目?120目的钢丝筛，进一步优选，所述的过滤采用100目钢丝筛。
[0023]所述的初步离心的条件为:300g?400g、5min?20min，进一步优选，所述的初步离心的条件为:350g、10min。
[0024]所述的再次离心的条件为:2°C?6°C、1200g?1600g、13min?23min。进一步优选，所述的再次离心的条件为:4°C、1400g、18min。
[0025]所述的Nycodenz液可选用20%Nycodenz液，由体积百分比20%的Nycodenz分离液和体积百分比80%的Hank’s液，即20%Nycodenz液由体积比20%:80%的Nycodenz分离液和Hank’s液制成。
[0026]本发明还提供了一种长爪沙鼠的肝星状细胞的分离培养方法。
[0027]—种长爪沙鼠的肝星状细胞的分离培养方法，包括:所述的长爪沙鼠的肝星状细胞的分尚方法以及培养；
[0028]所述的培养包括:取分离得到的肝星状细胞，以IX 15-1 X 16个/ml接种密度进行原代培养;当细胞融合度为80 %?90 %时，进行传代培养。
[0029]优选地，所述的原代培养的培养基由体积百分数5%?15 %的胎牛血清和85 %?95 %的DMEM培养液组成;所述的原代培养和传代培养的条件为:在35 °C?39 °C、由体积百分数2 %?8 % 0)2和92 %?98 %空气组成的气氛中培养。进一步优选，所述的原代培养的培养基由体积百分数10%的胎牛血清和90%的DMEM培养液组成;所述的原代培养和传代培养的条件为:在37 0C、由体积百分数5 % 0)2和95 %空气组成的气氛中培养。空气可优选为潮湿空气，湿度50%?90 %。
[0030]本法采用离体胶原酶、链霉蛋白酶灌注法，每只雄性长爪沙鼠肝脏约获得星状细胞 1.5X107 个。
[0031]为提高细胞得率主要从以下方面进行改进:
[0032]1、一般选用体重400g左右、营养状况良好的雄性长爪沙鼠较为合适。体重较轻者，可预先用维生素A处理雄性长爪沙鼠，确保肝星状细胞具有一定的浮力，在密度梯度离心时较好地与其它细胞分离。
[0033]2、用4°C的预灌注液腹主动脉灌注，灌注液可以通过门静脉与肝动脉进入肝脏，肝内血细胞冲冼得相对较为干净，低温灌注可以减少肝热缺血对肝脏的损伤，取下肝脏后行门静脉插管固定再行灌注与肝表面清洗，尽可能的减少血细胞对消化酶的活性产生的不良影响。
[0034]3、肝脏消化是否适度，是影响细胞得