专利名称：制备流行性出血热疫苗的方法
技术领域：
本发明涉及用于预防接种的流行性出血热疫苗的制备方法，特别是应用长爪沙鼠肾细胞作培养基质制备单价、双价和多价流行性出血热疫苗的方法。
流行性出血热(Epidemic hemorrhagic fever,EHF)作为一种疾病名称，是中国的传统称谓。《中华人民共和国传染病防治法》即使用此名称。然而在各国各地区则有不同的名称。韩国和朝鲜称为朝鲜出血热(KHF)，在俄罗斯远东地区称为出血性肾病肾炎(HNN)，在欧洲称为流行性肾病(NE)。学术界建议规范命名为“肾综合症出血热”(Hemorrhagic fever with renal syndrome,EFRS)。
流行性出血热是一种以鼠为传播媒介的自然疫源性疾病，其病原体已确认为病毒，属布尼亚科的汉坦病毒属。汉坦(Hanta)病毒分为四型(亚属)Ⅰ型为汉滩型(Hantaan)，也称姬鼠型、野鼠型；Ⅱ型为汉城型(Seoul)，也称家鼠型；Ⅲ型为普马拉型(Puumala)；Ⅳ型为希望山型(Prospective hili)。在中国发生的主要是Ⅰ型和Ⅱ型。发病地区常常是以某一型别为主，两种型别同时存在的混合疫区。
流行性出血热对人的健康和生命危害极大。然而至今尚缺少特异的治疗手段。因此积极预防成为人类与流行性出血热作斗争的主要努力方向。而接种流行性出血热疫苗是最简便有效的预防措施。同时因为上述四个病毒型之间交叉免疫力十分微弱，一种病毒型制备的疫苗(称为单价疫苗)只能预防一种型别的流行性出血热，而在混合疫区还需要可以预防两种或三种型别流行性出血热的疫苗，即双价和多价疫苗。
国内外对流行性出血热疫苗的研制始于本世纪80年代初期。已经研制成功的有纯化鼠脑疫苗和细胞培养疫苗。国外有日本、朝鲜、韩国等报告了研制流行性出血热疫苗成功，但都是Ⅰ型(野鼠型)单价鼠脑灭活疫苗，且均没有报告接种人体后产生中和抗体的情况。中国在八十年代后期曾组织多个单位分别研制流行性出血热疫苗，但其性能质量还存在一些不能令人满意的地方。中国专利公报所载“CN1076865A制备肾综合症出血热疫苗的方法”和“CN 1109782A应用金黄地鼠肾原代细胞生产流行性出血热疫苗的方法”公开了两种使用不同病毒培养基质制备流行性出血热疫苗的方法。
本发明的目的在于提供一种制备流行性出血热疫苗的方法，特别是在病毒培养基质的选用上独具特点。这种方法应当便于操作，容易控制质量，所得到的疫苗抗原性强。这种方法不但适用于制备汉坦(Hanta)病毒属中任何一个型别(亚属)病毒的单价疫苗，也能用于制备双价和多价疫苗。
实现本发明目的的技术方案如下。
一．制备单价流行性出血热疫苗选10-20天龄长爪沙鼠，无菌取肾，剪碎，置装有玻璃珠的三角烧瓶中，用偏于碱性、含胰酶和卡那霉素的MEM液清洗，加肾重8-12倍量的胰酶溶液，置4℃左右进行消化。12-20小时后倒去胰酶，用MEM液洗涤。摇动三角瓶，使瓶内的玻璃珠撞击组织块，加MEM液，收集消化的细胞悬液。如此“摇动三角瓶-加MEM液-收集细胞悬液”重复进行2-4次。将收集的细胞悬液倒入PH7.0-PH7.4，含2-3％小牛血清的MEM生长液中，摇匀后分装于大玻璃瓶中，置37℃温室中旋转培养，2-3天后换一次生长液，再培养2-3天，瓶壁上生长成单层细胞。
取上述生长良好的细胞瓶，倒出培养液，加入含有汉坦(Hanta)病毒属中任何一种型别病毒的维持液，置35℃温室中旋转培养2-3天，倒去病毒液，用PH7.2的0.01MPBS液倒置冲洗，然后加入无牛血清的MEM液，置35℃温室中旋转培养4-6天，于超声波清洗槽中超声约10分钟，合并液体，取样测病毒滴度。
在病毒液中加入β-丙内酯和硫柳汞对病毒灭活。β-丙内酯的用量为收获病毒量的三千分之一至五千分之一。硫柳汞的用量为收获病毒量的万分之一至三万分之一。将灭活的病毒液摇匀后离心去除细胞碎片，取上清液即为疫苗原液。
在疫苗原液中按0.4mg-0.6mg/ml比例加入氢氧化铝，按0.05-0.2％比例加入血白蛋白，即为疫苗半成品。经无菌试验合格，进行分装，即为成品。
以上方法可用于汉坦病毒(Hanta)族中任何成员(亚属)病毒型制备相应的单价疫苗。
二．制备双价或多价流行性出血热疫苗在制备各型单价疫苗的基础上，可以按任何组合制备双价和三价疫苗。其方法是分别量取两种型别的半成品疫苗，将其等量混合，进行分装，即为该两种型别的流行性出血热双价疫苗；将三种型别的半成品疫苗等量混合，进行分装，即为该三种型别的流行性出血热三价疫苗。
三．对疫苗进行纯化对在灭活离心工序中制备得到的疫苗原液，用10万分子量滤膜进行超滤浓缩50-200倍，浓缩液经Sepharose凝胶过滤和离子交换，将获得具有抗原活性的液体稀释至疫苗原液量的一半，进行残余牛血清含量测定、抗原含量测定和无菌试验，最后加入人血白蛋白和氢氧化铝，即为相应的单价或多价流行性出血热纯化疫苗。
本发明流行性出血热疫苗使用长爪沙鼠肾细胞作感染病毒的基质，较之使用金黄地鼠肾细胞，得到多项积极效果(1)细胞贴壁牢固，在去除牛血清时可以多次冲洗不出现细胞层脱落；(2)易于培养。使用2-3％小牛血清即可；(3)流行性出血热病毒不使细胞发生病变；(4)流行性出血热敏感，血凝抗原高。
以β-丙内酯作灭活剂的优点在于，不破坏流行性出血热病毒的血凝素抗原。血凝素抗原是病毒膜抗原的主要成分，而病毒膜抗原是重要的保护性抗原。保护性抗原刺激产生保护性抗体。而使用福尔马林作灭活剂是破坏病毒的血凝素抗原的。因此使用β-丙内酯作灭活剂所制备的疫苗，较之使用福尔马林作灭活剂所制备的疫苗，其抗原性要强得多。
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1制备Ⅰ型流行性出血热疫苗一．制备细胞单层选15天龄长爪沙鼠，剪断颈动脉放血致死，置0.2％新洁而灭消毒液中浸泡30分钟，无菌取肾，剪碎，置装有玻璃珠的三角烧瓶中，用PH8.0含0.125％胰酶和100单位/ml卡那霉素的MEM液(基础培养液)清洗一次，再加肾重10倍量的胰酶溶液，置4℃进行消化。16小时后倒去胰酶，用MEM液洗涤一次。摇动三角瓶20次，加MEM液，收集消化的细胞悬液；再摇动三角瓶20次，加MEM液，收集细胞悬液；……如此重复三次后，将收集的细胞悬液倒入PH7.2含3％小牛血清的MEM生长液中，摇匀后分装于15立升玻璃瓶中，每瓶约含15对肾的1500ml细胞悬液，置37℃温室中旋转培养，2天后换一次生长液，再培养3天，使细胞长成单层。
二．种毒培养病毒种选用浙江省卫生防疫站分离并保存的Ⅰ型流行性出血热病毒株，代号为Z10。保存病毒的维持液为含2％小牛血清、100单位/ml卡那霉素，PH7.2的MEM液。
取上述步骤一制备的生长良好的细胞瓶，倒出培养液，加入含有Z10Ⅰ型病毒的维持液1500ml，置35℃温室中旋转培养2天，倒去病毒液，用PH7.2的0.01MPBS液倒置冲洗，每瓶约冲液体2000ml，然后加入1500ml无牛血清的MEM液，35℃温室中旋转培养5天，于超声波清洗槽中超声10分钟，合并液体，取样测病毒滴度。
三．灭活离心在病毒液中加入β-丙内酯和硫柳汞对病毒灭活。β-丙内酯的用量为收获病毒量的四千分之一。硫柳汞的用量为收获病毒量的二万分之一。将灭活的病毒液摇匀后离心去除细胞碎片，取上清液即为疫苗原液。疫苗原液需进行无菌试验、抗原量测定、残余牛血清测定和安全试验。各项试验和测定均合格者，进入下一道工序。
四．加氢氧化铝和人血白蛋白疫苗原液中按0.5mg/ml比例加入氢氧化铝，按0.1％比例加人血白蛋白，即为疫苗半成品。经无菌试验合格，进行分装，每支1.1ml，即为成品。
成品疫苗液体需进行外观检查、无菌试验、PH值测定、效力测定、防腐剂试验、氢氧化铝含量测定、毒性试验、硫柳汞含量测定、吸附度试验。以上检测全部符和国家流行性出血热疫苗制、检规程要求，即为合格的流行性出血热Ⅰ型灭活疫苗。
实施例2制备Ⅱ型流行性出血热疫苗制备Ⅱ型流行性出血热疫苗，在种毒培养时，病毒种选用浙江省卫生防疫站分离并保存的Ⅱ型流行性出血热病毒株，代号为Z37。其余的工序步骤、所用材料、试验检测等均与实施例1“制备Ⅰ型流行性出血热疫苗”的方法相同。
实施例3制备Ⅲ型流行性出血热疫苗制备Ⅲ型流行性出血热疫苗，在种毒培养时，病毒种选用Puumala 1 Ⅲ型流行性出血热病毒株。其余的工序步骤、所用材料、试验检测等均与实施例1“制备Ⅰ型流行性出血热疫苗”的方法相同。
实施例4制备“Ⅰ型+Ⅱ型”流行性出血热双价疫苗分别量取按实施例1制备的Ⅰ型半成品疫苗和按实施例2制得的Ⅱ型半成品疫苗，将其等量混合，进行分装，每支1.1ml，即为成品“Ⅰ型+Ⅱ型”流行性出血热双价疫苗。成品双价疫苗同样按实施例1所述成品疫苗的检测试验项目、方法进行检定，达到合格。
按本发明的方法制备的“Ⅰ型+Ⅱ型”双价疫苗经实际应用，Ⅰ型和Ⅱ型病毒抗体阳转率分别达到了90％和97％。
实施例5制备“Ⅰ型+Ⅲ型”流行性出血热双价疫苗分别量取按实施例1制备的Ⅰ型半成品疫苗和按实施例3制得的Ⅲ型半成品疫苗，将其等量混合，进行分装，每支1.1ml，即为成品“Ⅰ型+Ⅲ型”流行性出血热双价疫苗。成品双价疫苗同样按实施例1所述成品疫苗的检测试验项目、方法进行检定，达到合格。
实施例6制备“Ⅰ型+Ⅱ型+Ⅲ型”流行性出血热多价疫苗分别量取按实施例1制备的Ⅰ型半成品疫苗、按实施例2制得的Ⅱ型半成品疫苗、按实施例3制得的Ⅲ型半成品疫苗，将三种半成品疫苗等量混合，进行分装，每支1.1ml，即为成品“Ⅰ型+Ⅱ型+Ⅲ型”流行性出血热多价疫苗。成品多价疫苗同样按实施例1所述成品疫苗的检测试验项目、方法进行检定，达到合格。
实施例7制备纯化疫苗对上述实施例1-4在灭活离心工序中制备得到的疫苗原液，用10万分子量滤膜进行超滤浓缩100倍，浓缩液经Sepharose凝胶过滤和离子交换，将获得具有抗原活性的液体稀释至疫苗原液量的一半，进行残余牛血清含量测定、抗原含量测定和无菌试验，最后加入人血白蛋白和氢氧化铝，分装每支1.1ml，即为单价或多价流行性出血热纯化疫苗成品。成品纯化疫苗同样按实施例1所述成品疫苗的检测试验项目、方法进行检定，达到合格。
权利要求
1．一种制备流行性出血热疫苗的方法，其特征在于，采用长爪沙鼠的肾细胞作贴壁培养，选取汉坦(Hanta)病毒属中任何一种型别的病毒株感染长爪沙鼠肾细胞，经培养后加入β-丙内酯和硫柳汞对病毒灭活，离心去除细胞碎片，再加入氢氧化铝和人血白蛋白，成为单价流行性出血热疫苗。
2．根据权利要求1所述的制备流行性出血热疫苗的方法，其特征在于，将两种不同型别单价疫苗半成品等量混合，配制分装，成为双价流行性出血热疫苗。
3．根据权利要求1所述的制备流行性出血热疫苗的方法，其特征在于，将三种不同型别单价疫苗半成品等量混合，配制分装，成为多价流行性出血热疫苗。
4．根据权利要求1所述的制备流行性出血热疫苗的方法，其特征在于，在对长爪沙鼠的肾细胞作贴壁培养时使用PH7.0-PH7.4，含2-3％小牛血清的MEM生长液。
5．根据权利要求1所述的制备流行性出血热疫苗的方法，其特征在于，用于病毒灭活的β-丙内酯的用量为收获病毒量的三千分之一至五千分之一，硫柳汞的用量为收获病毒量的万分之一至三万分之一。
6．根据权利要求1所述的制备流行性出血热疫苗的方法。其特征在于。对在灭活离心工序中制备得到的疫苗原液，用10万分子量滤膜进行超滤浓缩50-200倍，浓缩液经Sepharose凝胶过滤和离子交换，将获得具有抗原活性的液体稀释至疫苗原液量的一半，进行残余牛血清含量测定、抗原含量测定和无菌试验，再加入人血白蛋白和氧氧化铝，成为纯化疫苗。
7．根据权利要求1所述的制备流行性出血热疫苗的方法，其特征在于，在疫苗原液中加入氢氧化铝的比例为0.4mg-0.6mg/ml，加入人血白蛋白的比例为0.05-0.2％。
全文摘要
一种采用长爪沙鼠的肾细胞作病毒培养基质制备流行性出血热疫苗的方法,适用于汉坦(Hanta)病毒属中任何一种型别的病毒株。培养后加入β－丙内酯和硫柳汞对病毒灭活,离心去除细胞碎片,再加入氢氧化铝和人血白蛋白,成为单价流行性出血热疫苗。将两种或者三种不同型别单价疫苗半成品等量混合,配制分装,成为双价或者多价流行性出血热疫苗。
文档编号A61K39/12GK1235847SQ9810186
公开日1999年11月24日 申请日期1998年5月20日 优先权日1998年5月20日
发明者朱智勇, 唐汉英, 李岩金, 陆群英, 翁景清, 李敏红, 姚苹苹, 傅桂明 申请人:杭州天元生物药业公司