一种人可溶性icosl elisa试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫分析技术领域，设及一种定量检测人可溶性IC0SL的化ISA试剂 盒，利用该试剂盒进行定量检测的方法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 目前已知的许多受体-配体相互作用都参与诱导、建立和调节抗原特异性免疫反 应，其中T细胞的活化需要双信号，抗原肤-MHC分子复合物与T细胞受体(TCR)的结合提供了 第一信号，而第二信号则来源于抗原呈递细胞（APC)和T细胞表面共刺激分子 (costimulato巧molecule)的相互作用，缺乏第二信号将导致T细胞失能或程序性死亡。由 此可见，共刺激信号是T细胞克隆扩增、分化和发挥生物效应所必不可少的。
[0004] 近年来，随着分子生物学技术被广泛应用于免疫学研究，共刺激分子被不断发现。 运些共刺激分子按其结构的不同可分为两类：一类是肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体 (TNF/TNFR)超家族，包括 CD40/CD40L、CD27/CD27L、CD30/CD30L、4-lBB/4-lBBL、0X40/ 0X40L、RANK/RANKL和化s/化sL等；另一类是免疫球蛋白（Ig)超家族，包括CD28/CTLA4-B7、 1^\尸1-1〔41-1/^41-2/1〔41-3、1〇)5-1〇)51^、〔02-口^4-3等。运些共刺激分子^受体和配体相 互作用的方式传导信号。受体和配体一般表达在不同的细胞表面，通常一个为持续性表达， 一个是诱导性表达。在免疫应答的不同阶段，运些分子W各自独特而又相关联的方式参与 信号传导，共同调控机体的免疫应答。
[000引可诱导共刺激分子（inducible costimulator，IC0S)是1999年由Hutloff等人发 现的CD28家族的新成员，IC0S是由两个亚单位构成的同源二聚体I型跨膜蛋白，属于免疫球 蛋白超家族。IC0S的胞浆区含有YMFM基序，能与PI3K激酶结合，胞外区含有一个V样Ig功能 区，其中的抑PPF基序是与相应配体ICO化结合的结构，IC0S主要表达于滤泡辅助性T细胞(T follicular helper，Tfh)、活化T细胞和效应/记忆性T细胞上。IC0S的配体IC0SU又称为 hB7RP-l，B7-H2，hLIC0S)是由309个氨基酸组成的I型跨膜糖蛋白，约63~72 kDa，胞外区包 含IgV、IgC区，胞内段则根据不同的生理环境及细胞自身的状态而剪接形成不同的异构体， 其中的4个半脫氨酸及igV区80位的酪氨酸都是保守位点，不仅是B7家族的标志性位点，而 且对于免疫球蛋白样结构的形成也十分重要。ICO化主要表达在B细胞(例如淋己结的皮质 区和淋己滤泡、脾的边缘带，此外在扁桃体B细胞的表面也有低水平表达）、单核细胞、部分 树突状细胞和巨隧细胞上，提示ICO化在B细胞参与的体液免疫应答中可能发挥着重要作 用。除在淋己组织表达W外，ICO化在肾、屯、、膀脫和脑等非淋己组织也有表达，表明该分子 可能具有多方面的功能。多种因素可调控ICO化的表达，外周血中未经刺激的B细胞、单核细 胞表面低水平表达ICO化，经IFN-丫、TNF-a、LPS刺激后，ICO化的表达迅速上调。
[0006] IC0S的生物学功能与经典共刺激分子CD28不尽相同。CD28是诱导初始T细胞增殖 活化的关键性分子，而IC0S则是活化后促进T细胞分化并发挥效应的主要共刺激分子。CD28 主要参与机体的初次免疫应答，而IC0S主要是在再次免疫应答W及免疫记忆中发挥重要作 用，对维持Τ细胞效应和记忆细胞活化、免疫球蛋白类型转换、调节化1/化2细胞极化等有重 要作用。另外，ICOS在体内实验中所扮演的重要角色之一就是维持Tfh的产生，因此无论对 于人类还是小鼠而言，ICOS缺陷都会导致T扣生成缺陷，影响生发中屯、（germinal center, GC)反应，并使抗体产生减少。此外，已有研究证明，抗原呈递细胞上的ICO化对于Τ扣细胞分 化和维持都有重要作用。清华大学祁海教授新近在化化re等杂志上发表文章指出，IC0S可 W在独立于共刺激信号之外，通过促进T细胞的随机运动能力来直接控制T细胞向淋己器官 滤泡区迁移，进而决定T细胞的分化方向，但旁观者B细胞表达ICO化是其必要条件。当旁观 者B细胞无法表达ICO化时，活化的辅助T细胞无法正常发育为Tfh，也不能引起最佳的GC反 应，运说明旁观者B细胞在促进T扣发育中起着至关重要的作用。
[0007] IC0S/IC0化信号通路的异常与多种自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、系统性 红斑狼疮、多发性硬化等)的发病密切相关。类风湿性关节炎是一种由多种因素导致的自身 免疫性疾病，在类风湿性关节炎患者及小鼠动物模型中均发现多种免疫学功能的异常，其 中最突出的就是产生致病性的自身抗体、T细胞/B细胞免疫功能的缺陷、自身抗体及免疫复 合物清除障碍等。类风湿性关节炎患者体内T细胞/B细胞相互作用时通过共刺激分子产生 的抗调亡信号促使自身反应性B细胞大量增殖，并产生高滴度的自身抗体，而运些自身抗体 的某些亚型及其免疫复合物介导了疾病的组织损伤。在多个独立实验中，采用抗体阻断 IC0S与其配体的相互作用，可W减少促炎症因子的产生及抗体的形成，并且显著减弱关节 炎的严重程度，还可W减少CIA模型小鼠的引流淋己结和脾的滤泡辅助T细胞和生发中屯、B 细胞的数量。由此可见，IC0S途径在类风湿性关节炎的免疫病理过程中发挥复杂而重要的 作用。
[0008] 大量研究表明，许多共刺激分子W细胞膜型和可溶性两种形式存在。其中，可溶性 分子大多通过膜型分子而形成，但也有某些可溶性分子由专一的缺失跨膜区的基因编码 (例如CTLA-4)。机体中可溶性分子和膜表面的分子一样具有相应的生物学功能:一方面，细 胞膜上的分子能够通过直接的受体/配体相互作用来介导共刺激信号；另一方面，可溶性蛋 白因子能够像细胞因子一样参与血液循环，并且在免疫应答中发挥重要的调节作用，其既 能够影响邻近细胞，又能够和远端细胞表面的受体相互结合，从而参与疾病的发生、发展， 其发挥作用的广度和深度远远超过细胞膜表面的分子。迄今为止，因缺乏有效的检测方法， 国内外尚未有对可溶性ICO化(sICO化)的研究报道。
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【发明内容】
[0010] 要解决的技术问题:针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种基于改 良双抗体夹屯屯LISA方法研制的人可溶性IC0SL ELISA试剂盒，并利用该试剂盒成功完成了 人sICO化的定量检测。
[00川技术方案： 一对用于制备抗人可溶性IC0SL单克隆抗体的杂交瘤细胞株： 杂交瘤细胞株2B4,其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、 (CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO: 11291，保藏日为2015年10月21日，保藏地址为北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所； 杂交瘤细胞株20B10,其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、 (CGMCC)，保藏编号为CGMCC Ν0:11187,保藏日为2015年8月10日，保藏地址为北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0012] 上述一对杂交瘤细胞株在制备人可溶性IC0SL ELISA试剂盒中的用途，其中杂交 瘤细胞株2B4用于产生检测抗体，杂交瘤细胞株20B10用于产生包被抗体。
[0013] 一对抗人可溶性ICO化单克隆抗体： 单克隆抗体2B4，其由上述杂交瘤细胞株2B4产生，其包括轻链和重链，其氨基酸序列分 别如序列表中SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示，其编码基因的核巧酸序列分别如序列表中 沈Q ID NO:3和沈Q ID NO:4所示； 单克隆抗体20B10,其由上述杂交瘤细胞株20B10产生，其包括轻链和重链，其氨基酸序 列分别如序列表中SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示，其编码基因的核巧酸序列分别如序列 表中沈Q ID NO:7和沈Q ID NO:8所示。
[0014] 上述一对抗人可溶性ICO化单克隆抗体在制备人可溶性ICOSL ELISA试剂盒中的 用途，其中单克隆抗体2B4用作检测抗体，单克隆抗体20B10用作包被抗体。
[0015] -种人可溶性ICO化ELISA试剂盒，其包括如下组分： (1) 固相载体:酶标板，1块； (2) 包被抗体:抗人ICO化单克隆抗体20B10，30yg/管，1管； (3) 检测抗体:抗人ICO化单克隆抗体2B4，lOyg/管，1管； (4) 抗体稀释液:0.01M碳酸盐缓冲液(CBS)，pH9.6，50mL/瓶，1瓶； 巧)封闭液:牛血清白蛋白（BSA)溶液，2g/100mL，30mL/瓶，1瓶； (6) 样品稀释液:0.01M憐酸盐缓冲液(PBS)，含有0.5%牛血清白蛋白，250mL/瓶，1瓶； (7) 标准品蛋白：ICO化-Ig融合蛋白，25ng/管，1管； (8) 酶标二抗:链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物(S化eptavidin-HRP，1: 3000)，10μ g/管，1管； (9) 底物:3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(了18)，10血/管，1管； (10) 洗液:0.01M憐酸盐缓冲液，含有0.2%吐溫20，lOOmL/瓶，1瓶;和 (11) 终止液:2M硫酸，5血/管，1管。
[0016] 上述人可溶性IC0SL ELISA试剂盒在定量检测人体血清、血浆或组织液内sICO化 中的用途，并具体公开了一种利用上述ELISA试剂盒进行人sICO化定量检测的方法，其包括 如下步骤： (1) 采用抗体稀释液将包被抗体配制成浓度为化g/mL的包被抗体工作液，然后按照100 μL孔的用量加入到酶标板中，于4°C静置，过夜； (2) 弃掉酶标板