复制型痘苗病毒载体艾滋病疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及医学生物技术领域，具体设及复制型痘苗病毒艾滋病疫苗，其能够诱 导高水平的抗人类免疫缺陷病毒的体液和细胞免疫应答，并允许对疫苗可能导致的严重不 良反应进行有效控制。
【背景技术】
[0002] 痘苗病毒载体是研究最为深入和广泛的病毒载体之一，可作为用于构建疫苗的载 体。非复制型痘苗病毒载体的安全性高，但免疫原性相对较弱，特别是在人体中诱导的免疫 反应明显弱于猴体内的免疫应答。复制型痘苗病毒载体免疫原性强，可诱导持久的免疫力， 但具有引起严重的不良反应等潜在安全性问题。
[0003] 由于天花已经消灭了多年，作为天花疫苗的痘苗病毒已经停止接种30多年，针对 痘苗病毒的药物研发已很少有人关注。随着复制型痘苗病毒载体在疫苗开发领域中的应 用，亟需在出现严重不良反应时可W进行有效治疗的药物和措施。
【发明内容】
[0004] 在第一方面，本发明提供一种重组复制型痘苗病毒，其在TK区包含编码服V-TK的 第一多核巧酸和编码HIV抗原的第二多核巧酸。 阳〇化]优选地，本发明的重组复制型痘苗病毒是痘苗病毒天坛株。
[0006] 在一个具体的实施方式中，本发明的重组复制型痘苗病毒中的所述第一多核巧酸 包含SEQ ID N0:3所示的核巧酸序列。
[0007] 在另一个具体的实施方式中，本发明的重组复制型痘苗病毒中的所述第二多核巧 酸编码来源于中国HIV主要流行毒株97CN001的甜1452M并包含SEQ ID N0:1所示的核巧 酸序列。
[0008] 优选地，本发明的重组复制型痘苗病毒还包含编码额外的HIV抗原的第Ξ多核巧 酸。在一个优选的实施方式中，所述第Ξ多核巧酸插入复制型痘苗病毒的至HA区。在一 个具体的实施方式中，所述第Ξ多核巧酸编码来源于中国HIV主要流行毒株97CN001的gag 并包含SEQ ID N0:2所示的核巧酸序列。
[0009] 在一个优选的实施方式中，本发明提供重组复制型痘苗病毒，其是天坛株痘苗 病毒，其包含插入至天坛株痘苗病毒的TK区的编码来自中国HIV主要流行毒株97CN001 的甜1452M的基因和编码服V-TK的基因，并包含插入至天坛株痘苗病毒的HA区的编码 97CN001的gag的基因。
[0010] 本发明进一步提供活载体HIV疫苗组合物，其包含上述第一方面的本发明的重组 复制型痘苗病毒和药用可接受载体和/或佐剂。
[0011] 本发明还设及上述第一方面的本发明的重组复制型痘苗病毒在制备用于预防和/ 或治疗对象的HIV感染的活载体HIV疫苗组合物中的用途。优选地，所述对象是免疫抑制 患者，例如所述对象患有先天性免疫系统缺陷、HIV感染或正接受免疫抑制治疗。
[0012] 本发明还提供一种艾滋病免疫试剂盒，所述试剂盒包含多个成份和指示免疫程序 的说明书，其中一个成份为本发明的活载体疫苗组合物。
【附图说明】
[0013] 图1 :GCV对重组痘苗病毒的体外抑制作用。
[0014] 图2 :GCV对小鼠脑内TT-TK和ΤΤ-ΕηνΤΚ复制的抑制作用。
[0015] 图3 :GCV对小鼠卵巢中ΤΤ-ΤΚ复制的抑制作用。
[0016] 图4 :TT-EnvTK在小鼠诱导的免疫反应。A :细胞免疫巧：体液免疫。
[0017] 图5 :多个HIV抗原间的免疫干扰。
[0018] 保藏信息
[0019] 重组痘苗病毒TT-TK于2014年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中屯、（CGMCC)，保藏号CGMCC No. 9810,保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号 院3号；
[0020] 重组痘苗病毒ΤΤ-ΕηνΤΚ于2014年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中屯、（CGMCC)，保藏号CGMCC No. 9808，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1 号院3号；
[0021] 重组痘苗病毒TT-gag于2014年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中屯、（CGMCC)，保藏号CGMCC No. 9809，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1 号院3号。 阳0巧序列信息
[0023] 沈Q ID N0:1 :Gpl452M 基因序列，来自 HIV-1 ;
[0024] 沈Q ID N0:2 :Gag 基因序列，来自 HIV-1 ; 阳0巧]沈Q ID N0:3 :HSV-TK基因序列，来自HSV-1 ;
[0026] 沈Q ID N0:4 :质粒 PSC65-DR-GN 序列。 具体实施方案
[0027] 获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immunodeficien巧Syn化ome，AIDS)简称艾滋 病，是由人免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Vi;rus，HIV)感染引起的一种传染性疾 病。自从1981年发现第一例病例W来，艾滋病一直W惊人的速度在全球蔓延，成为世界上 危害人类生命和健康最严重的病毒性疾病之一。艾滋病的流行给世界的社会和经济发展带 来了巨大影响。在一些发展中国家，HIV感染已造成了人均寿命缩短、劳动力减少、食品短 缺，使经济和社会发展倒退了 20年。HIV在中国的流行经历了传入期（1985 - 1988)、播散 期（1989 - 1994)和增长期（1995年至今）Ξ个阶段。
[0028] 近年来抗HIV病毒药物的研制和应用取得了很大进展，部分感染者得到了较好的 治疗。然而，耐药株的出现使运些药物不是对每个病人都有效，复杂的服药过程使部分病人 不能坚持按时服药而导致治疗失败，昂贵的费用也使治疗难W大规模推广。历史经验证明， 控制疾病流行最经济有效的方法就是应用疫苗，成功的实例如天花、脊髓灰质炎、麻疹、肝 炎等，因此，研制安全有效的艾滋病疫苗一直是科学工作者们奋斗的目标。
[0029] 各国科学家一致认为有效的艾滋病疫苗必须能够诱导机体产生HIV特异性的 CD8+细胞毒Τ淋己细胞反应（CTL)和中和抗体反应。目前各单一疫苗难W实现运一目标， 需要采用不同类型疫苗联合免疫的策略才能提高艾滋病疫苗的免疫效果。可供选择的候选 疫苗包括下列几种：传统疫苗（灭活疫苗和减毒活疫苗）、合成肤和蛋白亚单位疫苗、DNA疫 苗W及活载体疫苗。
[0030] 与其它类型疫苗相比，活载体疫苗的优势体现在：（1)能主动感染祀组织或细胞， 提高了外源基因进入细胞的效率；（2)载体自身有佐剂效应，能诱导细胞因子和趋化因子 的产生；（3)多数能诱导长期的免疫应答。
[0031] 其中W痘苗病毒为载体的活载体疫苗研究进行得最为深入和广泛，但目前进入临 床试验阶段的多为非复制型载体，如MVA、NYVAC和ALVAC。但临床试验显示非复制型载体免 疫原性相对较弱，而且同一种疫苗在人体中诱导的免疫反应明显弱于猴体内的免疫应答。 运可能与其非复制的特性有关。非复制型载体疫苗感染宿主细胞后，只能进行一个周期的 抗原表达、加工和呈递过程，无法产生有感染性的病毒并开始新一轮的感染，因而它对免疫 系统的刺激是有限的和短暂的。有鉴于此，国际上活载体疫苗的研究重点已从非复制型转 向复制型，W充分发挥活载体能够复制的特点，更好地刺激机体产生免疫反应。
[0032] 复制型痘苗病毒载体免疫原性强，可诱导持久的免疫力，但具有引起严重的不良 反应等潜在安全性问题。特别是对于因先天性免疫系统缺陷、免疫抑制治疗或HIV感染等 原因造成免疫系统抑制的个体，复制型痘苗病毒载体疫苗可能会引起严重的不良反应Ei'2^。
[0033] 由于天花已经消灭了多年，作为天花疫苗的痘苗病毒已经停止接种30多年，针对 痘苗病毒的药物研发已很少有人关注。随着复制型痘苗病毒载体在疫苗开发领域中的应 用，亟需在出现严重不良反应时可W进行有效治疗的药物和措施。
[0034] 自杀基因系统是近些年来广泛用于癌症等疾病治疗的方法，常见的自杀基因/药 物组合有：胞喀晚脱氨酶（切tosine deaminase,〔0)/5-氣胞喀晚巧寸111〇1'〇。八〇3；[]16) 口]、硝基还原酶（Nitroreductase)/CB 1954[4]、胸巧憐酸化酶（Thymidine 地os地or}dase, ΤΡ)/5' 脱氧 5 氣