一种稳定表达hpv16 e5蛋白细胞株的构建方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，具体涉及一种稳定表达HPV16E5蛋白细胞株的构建方 法及应用。
【背景技术】
[0002] 慢病毒(Lentivirus)载体是以I型人类免疫缺陷病毒为基础发展起来的基因治疗 载体。区别一般的逆转录病毒载体，慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体 上，从而达到持久性表达。慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息， 需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装。包装好的病毒 颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，产生高滴度的病毒颗粒，可以直接用于 宿主细胞的感染。目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平 的表达目的基因。在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染 的细胞，通过慢病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效表 达。
[0003] 人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是一类能引起皮肤和黏膜鳞状上皮 增殖的DNA肿瘤病毒。高危型HPV16的感染与宫颈癌、食管癌、喉癌、鼻咽癌、乳腺癌等多种恶 性肿瘤的发生发展密切相关。HPVE5癌基因是导致和维持肿瘤发生发展的关键基因之一， 其编码的HPVE5癌蛋白是一种具有高度疏水性的膜结合蛋白，主要定位于细胞膜、内质网、 高尔基体等结构上。在HPV感染相关肿瘤形成的早期阶段，细胞中含有丰富的E5 0RF及E5蛋 白，而在晚期肿瘤细胞中，E5蛋白的表达常因HPV基因组整合而缺失。由于E5蛋白具有高度 疏水性及较弱的抗原性，并且目前没有相应的抗体，因此，对该蛋白的研究受到了阻碍。基 于HPVE5蛋白的特点，若能构建一种带有标签的稳定表达HPV16E5蛋白的细胞株，就能为 E5蛋白生物学特性及功能的研究提供一个良好的工具。也望成为HPV相关肿瘤治疗的一个 理想细胞模型。
【发明内容】
[0004]本发明目的是利用重组慢病毒系统制备一种带有标签蛋白并能高效表达HPV16 E5蛋白的细胞株，该细胞株为研究HPV16E5蛋白的生物学功能提供平台，并可作为HPVE5 蛋白研究中的阳性对照细胞株。
[0005] 该细胞株的建立方法包括构建pLVX-Pur〇-HPV16E5-His重组慢病毒表达载体的步 骤，重组慢病毒包装、收获、转染Balb/c3T3细胞的步骤，经嘌呤霉素(puromycin)筛选以及 RT-PCRwesternblot鉴定的步骤，最终获得稳定表达HPV16E5蛋白细胞株。所获得的细胞 株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo. 11794。
[0006]本发明以重组慢病毒为载体，将其感染Balb/c3T3小鼠胚胎细胞，筛选获得能高效 表达HPV16E5蛋白的细胞株，此细胞株带有的His标签方便用于HPV16E5蛋白表达的检测。
[0007] 在此发明所述的构建pLVX-Pur〇-HPV16E5-His重组质粒的步骤中，首先根据HPV16 E5基因设计引物，通过PCR反应扩增带有His标签的HPV16E5基因，在pLVX-Puro载体的EcoRl和BamH1多克隆位点处插入HPV16E5-His基因。在制备重组慢病毒步骤中，利用构建 好的pLVX-Pur〇-HPV16E5-His重组质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞，经培养、出毒、收 取病毒上清、过滤后收获重组慢病毒液。取包装好的重组慢病毒感染Balb/c3T3细胞，用含 有嘌呤霉素的培养基筛选，经RT-PCR、westernblot鉴定，最终获得稳定表达HPV16E5蛋白 的Balb/c3T3细胞株，同时构建空载慢病毒并转染Balb/c3T3细胞作为对照。将构建好的细 胞株冻存于_150°C冰箱中保藏。
[0008] 此发明建立了能稳定高效表达HPV16E5蛋白的细胞株，该细胞株为进一步深入研 究HPV16E5蛋白的生物学特性及致细胞恶性转化的作用奠定了坚实基础。
【附图说明】
[0009] 图 1pLVX-Pur〇-HPV16E5-His重组质粒酶切鉴定图，其中 1 为pLVX-Pur〇-HPV16E5-His重组质粒，2为pLVX-Puro空质粒作为对照
[0010] 图2pLVX-Pur〇-HPV16E5-His重组质粒测序图
[0011]图3稳定表达株的RT-PCR鉴定，其中1为Balb/c-HPV16 E5细胞株，2为作为对照的Balb/c-Lenti细胞株
[0012] 图4稳定表达株的Western blot鉴定具体实施方案
[0013] (一)重组载体的构建
[0014] (1)HPV16E5基因扩增
[0015] 根据HPV16全基因组序列（GenBankNC_001526)，设计带有His标签、EcoRl和Bam Η1双酶切位点及保护碱基的ΗPV1 6E5特异引物，引物序列为：5 ' -CCG GAATTCGCCACCATGACAAATCTTGATACTGCATCC-3'（SEQIDΝ0·1)和5'-CGCGGATCCTTAA TGATGATGATGATGATGTGTAATTAAAAAGCGTGCATGT-3'（SEQIDN0.2KPCR反应体系为：
[0018] (2)DNA琼脂糖凝胶电泳
[0019] 配置1.5%的琼脂糖，微波炉加热使琼脂糖颗粒完全溶解;将洗净、干燥的制胶板 水平放置在工作台上;混匀，灌胶，插入梳子，避免产生气泡;待凝胶凝固后，小心拔去梳子； 将胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液;将PCR产物上样，经110V电泳30min。
[0020] (3)PCR产物凝胶回收（QIAquickGelExtraction Kit)
[0021 ] 切下HPV16E5-His基因条带的凝胶，加入3倍体积QGBuffer溶解凝胶；于50°C孵 育lOmin，摇晃混匀，直至胶完全溶解;加入1倍体积异丙醇沉淀DNA，翻转混匀，静止5min;吸 取混合物至Silica柱上，13000rpm离心lmin，弃去滤液；加入500μ1PBBuffer使DNA结合于 Silica柱，13000rpm离心lmin，弃去滤液；加入750μ1PEBuffer，13000rpm离心lmin，弃下 管滤液，13000rpm离心2min;换新离心管，加入10μ1已50°C预热的EBBuffer至Silica柱上， 13000rpm离心3min，洗脱得到DNA。
[0022] (4)HPV16 E5_His和pLVX-Puro载体双酶切
[0023] 将HPV16E5-His凝胶回收产物与pLVX-Puro载体(购于Clontech公司）分别进行BamH1和EcoR1双酶切。酶切体系于37°C水浴过夜，电泳，将正确的目的条带进行凝胶回 收。酶切体系如下：
[0026] (5)HPV16 E5基因与pLVX-Puro载体连接
[0027]将凝胶回收后的酶切产物HPV16E5-His基因与pLVX-Puro载体在16°C连接4KT4酶 连接体系如下：
[0029] 对构建好的重组质粒进行双酶切鉴定(见图1)。
[0030] (6)质粒转化感受态大肠杆菌Stbl3
[0031] 取出E.coliCompetentCellsstbl3(购自广州复能