基因有限公司），插入湿冰中 溶解;将1〇μ1连接产物加入50μ1感受态细胞，轻轻旋转混匀，冰浴30min;于42°C水浴中热休 克大肠杆菌45s，迅速移入湿冰中，静置2min;加入已37°C预热无抗生素的S0C培养液500μ1， 以150-160rpm转速于37°C恒温箱摇床培养lh。取120μ1已转化的感受态细胞涂于含100yg/ ml氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，将平板置于室温待其干燥后，倒置于37°C的培养箱中过 夜培养12-16h，检查各培养皿中是否出现菌落。挑选琼脂平板上的单菌落接种到5ml氨苄抗 性的LB培养基中，37°C摇床220rpm培养过夜，培养时间不能超过16h。
[0032] (7)菌液目的条带检测
[0033] 将菌液进行PCR检测，有目的条带的菌液送去测序(见图2)。测序正确的菌液一部 分冻甘油菌，于-80°C长期保存。另一部分菌液提质粒。
[0034] (8)pLVX-Pur〇-HPV16E5-His重组质粒的提取
[0035] 测序正确的菌液进行质粒提取，得到pLVX-Pur〇-HPV16E5-His重组表达质粒。用紫 外分光光度计测定0D260及0D280,计算核酸纯度及核酸含量。
[0036](二)HPV16E5-Lenti慢病毒的获得[0037] (1)慢病毒的包装
[0038] 预先抽提慢病毒表达质粒pLVX-Pur〇-HPV16E5-His。将构建好的重组慢病毒质粒 和病毒包装辅助质粒SL2、SL3、SL4(购于Clontech公司）共转染293T细胞(转染pLVX-Puro空 病毒载体作为对照）。转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的 培养基调整细胞密度为5X105细胞，重新接种10ml于10cm细胞培养皿，37°C、5%C02培养箱 内培24h，待细胞密度达90%-95%时即可用于转染。转染前2h将细胞培养基更换为无血清 培养基。
[0039] 向灭菌2ml离心管中加入所制备的pLVX-Pur〇-HPV16E5_His载体4yg，以及慢病毒 包装质粒SL2、SL3、SL4各4yg，与1.5ml的无血清Opti-MEM培养基混合均匀，在室温下温育5 分钟。取48μ1FuGeneHD试剂在另一管中与1.5mlOpti-MEM混合，室温下温育5分钟。将上 述两种溶液进行混合，室温下温育20分钟，形成DNA与FuGeneHD转染复合物。将混合液转移 至293T细胞的培养液中，于37°C，5%⑶2细胞培养箱中培养。24h后倒去含有转染混和物的 培养基，每瓶细胞中加入含1 〇 %血清的细胞培养基1 〇ml，于37°C、5 %C02培养箱内继续培养 2处。241!后更换无抗生素的完全培养基继续培养。
[0040] (2)慢病毒的收集及浓缩
[0041]转染48h后收集含有病毒的培养液到50ml无菌离心管中，再补加10ml新鲜完全培 养液至还能产毒的细胞中；转染72h后再次收集含有病毒的培养液，将两次收集的培养液于 4°C、3000rpm/min离心机中离心15min。病毒上清液用0.45μηι滤膜过滤去除细胞碎片，滤液 于4°C、50000Xg高速离心90min，去除上清，加入100μΙ完全培养液，用200μ1枪头缓慢充分 重悬后，将病毒浓缩液分装后保存在病毒管中，_80°C长期保存。
[0042] (3)慢病毒浓度测定
[0043]按照标准的慢病毒稀释测定法测定病毒滴度，最终得到包含HPV16E5_His基因的 慢病毒7·5X105TU/ml，空载慢病毒5·2X106TU/ml。
[0044](三)稳定转染细胞株的筛选[0045] (1)最适条件优化
[0046]慢病毒感染方法应该根据不同的细胞系和以细胞为基础的试验来进行优化。首 先，对细胞密度、慢病毒的数量、嘌呤霉素的浓度、感染时间等参数进行优化，以确定感染实 验中各参数的最适条件。慢病毒的感染数量为1〇 2~l〇6TU/ml范围之间，嘌呤霉素的筛选浓 度为5yg/mL，即在5-7天内杀死所有正常细胞的浓度。
[0047] (2)稳定转染细胞株筛选
[0048]第一天，在6孔板中接种1X106个Balb/c3T3细胞，使得次日细胞汇合度达到 80%。第二天，弃掉培养基，在细胞中加入用DMEM稀释适当倍数的病毒液（以转染空载慢病 毒的细胞作为对照）。转染24h后更换成2ml新鲜的培养基。转染48h后，加入含有5yg/mL嘌呤 霉素的新鲜培养基筛选稳定转染的细胞。根据需要每隔三天更换含有5yg/mL嘌呤霉素的培 养基，筛选4周左右，6孔板中可见阳性细胞簇。挑取阳性细胞簇，稀释后接种在96孔板中，确 保每孔中有一个细胞，继续用含嘌呤霉素的培养基筛选阳性细胞株。
[0049] (3)Balb/c-HPV16E5细胞株的检测
[0050]用Trizo1提取阳性细胞簇中的总RNA，进行逆转录PCR鉴定(见图3)。对阳性细胞进 行扩大培养后提取总蛋白，用His单克隆抗体作为一抗，进行westernblot鉴定(见图4)。最 后获得稳定转染HPV16E5基因的Balb/c3T3细胞株，命名为Balb/c-HPV16E5细胞株，所获 得的细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 如.11794，转染了空载慢病毒的对照细胞命名为8&此/〇-1^拉丨细胞株。
【主权项】
1. 一种新的稳定表达HPV16E5蛋白的细胞株(Balb/c-HPV16E5)，其特征在于:该细胞 株整合了HPV16E5基因，能稳定高效的表达HPV16E5蛋白。2. 如权利要求1所述的一种新的稳定表达HPV16E5蛋白的细胞株(Balb/c-HPV16E5)， 所述细胞株的保藏号为CGMCCNo. 11794。3. -种如权利要求1所述的稳定表达HPV16E5蛋白细胞株(Balb/c-HPV16E5)的建立 方法，其特征在于该方法包括以下步骤： 1) 利用基因重组技术将带有His标签的HPV16E5基因克隆到慢病毒表达载体中； 2) 将构建好的重组慢病毒载体与病毒包装质粒共转染293T细胞，得到重组慢病毒； 3) 用重组慢病毒转染Balb/c3T3细胞，通过嘌呤霉素筛选阳性细胞株； 4) 对阳性细胞株进行RT-PCR及westernblot鉴定。4. 根据权利要求3所述构建方法获得高效表达HPV16E5蛋白的Balb/c-HPV16E5稳定 细胞株。5. 如权利要求4所述的Balb/c-HPV16E5稳定细胞株，所述细胞株的保藏号为 CGMCCNo.11794。
【专利摘要】本发明涉及一种稳定表达HPV16？E5蛋白细胞株的构建方法及应用。该发明以慢病毒介导的将带有His标签的HPV16？E5基因整合到Balb/c3T3细胞中，实现了对HPV16？E5癌基因的稳定表达。本发明的细胞株可以为HPV16？E5蛋白生物学特性及致病机制的研究提供一个稳定的细胞平台，同时也为HPV相关肿瘤的防治工作奠定基础。CGMCC No.1179420151211
【IPC分类】C12N15/867, C12N5/10
【公开号】CN105420196
【申请号】CN201510974888
【发明人】钟儒刚, 李凡, 李劲涛, 汪杨俊琦
【申请人】北京工业大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月23日