特别适于维持骨细胞活性的人造稳定的磷酸钙相组合物的制作方法

专利名称：特别适于维持骨细胞活性的人造稳定的磷酸钙相组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够维持其上的骨细胞活性的具生物活性的人造稳定的烧结磷酸钙相组合物。本发明可用于评价正常和异常骨细胞活性的医学诊断和医学治疗，包括骨和牙组织更换和修复以及体外的骨移植片组织工程。
背景技术：
骨是由无机或矿物相、有机基质相和水组成的复杂矿化体系。无机矿物相由结晶的磷酸钙盐组成，而有机基质相主要由胶原蛋白质和其它非胶原蛋白质组成。骨的钙化作用取决于形成矿化组织的有机相和无机相之间的紧密联系。
骨生长的过程要调整到满足结构和功能的需要。与骨形成、维持、和吸收有关的细胞是成骨细胞、骨细胞和破骨细胞。成骨细胞合成骨的有机基质和类骨质，该类骨质在磷酸钙晶体生长和骨胶原结合以后矿化。骨细胞调节骨矿物和细胞外液之间的钙和磷酸盐的流动。破骨细胞的功能是吸收骨并且是骨修复过程中必不可少的。骨形成和骨吸收的天然平衡受到干扰会导致各种骨紊乱。已经证明提高破骨活性将导致骨密度降低的骨疾病，例如常见的骨质疏松、纤维性骨炎和Paget氏病。所有这些疾病都是骨吸收增加的结果。
为了了解骨细胞功能调节的机理，重要的是能够测定骨细胞的正常功能和在各种骨疾病中这种活性的紊乱程度。这样才可以找到可以使异常骨细胞活性恢复到正常水平以内的药物。除了识别异常和正常骨细胞活性的病因和测定该活性以外，人们还需要开发出用来治疗由于导致骨组织损伤的疾病、外科切除或生理外伤的原因而导致的异常骨细胞活性的组合物和方法。更换和修复骨组织(例如用骨植入物)的治疗更是人们所需要的。
几个研究机构已经研制了直接观察体外分离破骨细胞活性的方法。已经在天然材料例如抹香鲸牙质(Boyde等人，Brit.Dent.J.156，216，1984)或骨(Chambers等人，J.Cell Sci.66，383，1984)的薄片上培养从骨髓细胞群分离的破骨细胞。后面一个小组已经能显示出其它的单核吞噬细胞系不具有吸收活性(Chambers & Horton，CalcifTissue Int.36，556，1984)。近来使用其它的细胞培养技术来研究破骨细胞系的尝试依然依赖于使用皮层骨片(Amano等人和Kerby等人，J.Bone& Min.Res.7(3))，在这种情况下，吸收活性的定量取决于深度可变的吸收凹痕区域的二维分析或取决于吸收体积的定位。这种技术当测定比较厚的基体时提供的最高精确度为约50％。另外这些分析技术耗时过长并需要高级的专门设备并需要培训。此外，骨或齿质片的制备和随后的检查是一种既不容易也不实用的测定破骨细胞活性的方法。
使用人造磷酸钙制品作为破骨细胞培养的基体几乎没有取得成功。Jones等人(Anat.Embryol 170，247，1984)报道了破骨细胞在体外吸收合成磷灰石，但是没有提供支持这种观测结果的实验证据。Shimizu等人(Bone and Mineral 6，261，1989)已经报道说分离的破骨细胞仅吸收早衰的骨表面，而不合成钙基羟基磷灰石。这些结果表明有功能的破骨细胞难以在体外培养。
有几个机构已经尝试提供适于治疗替代骨组织的组合物。美国专利US4871578公开了一种形成可用作植入物的无孔平滑羟基磷灰石涂层的方法。美国专利US4983182公开了一种陶瓷植入物，它们含有氧化锆的烧结体和α-TCP和氧化锆的涂层或羟基磷灰石和氧化锆。美国专利US4988362公开了一种用于将一种生物陶瓷与另一种生物陶瓷熔合在一起的组合物。美国专利US4990163公开了一种用于生产由α-TCP和β-TCP组成的生物陶瓷的涂层。尽管这些不同种类的组合物可用作植入物等的生物适应性涂层，但是，这些组合物中没有一种表明能以可靠和重现的方式(例如能定量测定骨基质中破骨细胞吸收和成骨细胞分泌的特异活性)培养活性破骨细胞和成骨细胞。此外，已开发出的现有组合物中没有一种能被控制以便能可靠地生产具有常规的组成和形态，使之与在体内和体外具有相似的生物活性性能的各种膜、较厚的涂层和整体陶瓷件。
申请人已公开的国际PCT专利申请WO94/26872公开了一种形成具有骨细胞功能的磷酸钙相的薄膜的烧结方法。这是在其上破骨细胞能显示出长久活性和成骨细胞可分泌骨基质的第一种合成材料薄层。正如在该申请中所描述的，在制备具有所需比例的羟基磷灰石与磷酸三钙薄膜时，应考虑到许多因素。这些参数包括1)用于制备溶胶—凝胶羟基磷灰石物质的反应物质的用量；2)反应物质结合的速率；3)当制备溶胶—凝胶时的混合时间和速率；4)沉淀和分离的速率和方法；5)在制备溶胶—凝胶时的工艺环境条件；6)在浸渍涂覆膜时从溶胶—凝胶体系中取出基体的速度；7)烧结温度；8)在受控气氛例如惰性气体、真空或有水蒸汽存在的气氛中的烧结；9)基体的性质，石英是产生透明基体的优选实施方式，其基体上涂覆有稳定的磷酸钙相。
在该PCT专利申请中提出为了在石英基体上达到宽范围的羟基磷灰石与磷酸三钙的比例，要使其比值达到10∶90-90∶10，需要考虑到这些参数中的许多因素。指出在空气气氛下的烧结温度为约800-1100℃。证实在800℃时，膜的主要成分是羟基磷灰石。烧结温度为约900℃时，达到的比例为约70∶30。在1000℃时，达到的比例为约10∶90，而在1100℃时膜的主要成分是磷酸三钙。它还指出烧结在真空中1000℃下进行时达到的比例为约66∶34。目前已经发现优选的比例是50∶50-20∶80。最佳比例约为333∶666。为了达到这些比例，可以考虑上面给出的几个因素。但是，人们要求使上述几个因素的可变性达最小，并以精确可重现的方式达到最佳膜组成所要求的比例。令人惊奇地是，尽管人们认为α-磷酸三钙在水中是可溶的，但是膜在各种含水介质中是稳定的。
本申请人已经发现稳定本体的存在，能够稳定组合物并防止它们在生理液体中发生降解。因此，磷酸三钙本体在该组合物的膜、涂层或整体陶瓷件中消失主要是由于破骨细胞的活性，而不是由于溶解过程。稳定的人造生物活性组合物首先是这样的一种组合物，即它们能维持破骨细胞和成骨细胞活性并能容易地测定这两种细胞的生理活性以及能制定诊断和治疗对策。稳定本体能稳定在烧结期间形成的磷酸钙相内的α-磷酸三钙，以提供稳定形式的α-磷酸三钙，这种物质不会在生理液体中降解，而且它会形成具有维持和促进骨细胞活性的细胞相容形态的磷酸钙相。
本发明的概况本发明提供了一种稳定的组合物，该组合物能广泛地应用于各种诊断和治疗。按照本发明的一个方面，所述的稳定组合物可以用来产生薄膜、涂层、粉末和整体陶瓷构件，它们具有同样的表面球状微孔和内部微孔。另外，为了提供与体内发现的相类似的三维骨组织，该整体陶瓷的结构内部也可存在大孔。按任何方法制成的组合物能促进在其上培养的骨细胞的活性并生长出用作骨移植物的体外工程人造骨组织。
按照本发明的一个方面，提供了一种具生物活性的人造烧结组合物，用来提供能稳定地维持其上的骨细胞活性的形态，所述组合物含有稳定的磷酸钙相，它们是在稳定本体的存在下，在烧结温度下由羟基磷灰石物质转变成难溶和稳定的磷酸三钙而产生的。
按照本发明的另一方面，提供了用来稳定人造烧结的磷酸钙相组合物的方法，所述的磷酸钙相具有适合于维持其上的骨细胞活性的形态，该方法包括通过烧结将羟基磷灰石物质主要转变成α磷酸三钙，并提供使所形成的α-磷酸三钙稳定和难溶于磷酸盐相的稳定本体。
按照本发明的另一个方面，提供了用来维持骨细胞活性的烧结人造微孔多晶结构，所述结构含有经过烧结的稳定磷酸钙相，而所述的磷酸钙相具有松散的内连圆形颗粒的球状表面形态，并且在结构内有内连微孔。
按照本发明的又一个方面，提供的是可植入的钙化骨基质，它含有a)用来维持基质的结构；b)稳定的磷酸钙相层，该磷酸钙相是在稳定本体的存在下，在烧结温度下由羟基磷灰石物质转变成磷酸三钙而产生的，其中稳定本体使磷酸钙相不溶和稳定。
c)由在稳定磷酸钙相层上培养的成骨细胞沉积而成的界面层；和d)由这类培养的成骨细胞分泌出的矿化胶原基质。
按照本发明的另一方面，提供了培养有功能的骨细胞的方法，所述的方法包括—向基体上的稳定的磷酸钙相人造烧结膜上涂覆悬浮在生理介质中的骨细胞悬浮液，所述的烧结膜含有稳定和难溶的α-磷酸三钙复合物。
按照本发明的又一方面，提供了监测和定量测定骨细胞活性的试剂盒，该试剂盒包括—具有磷酸钙相烧结膜的基体，所说的磷酸钙相含有稳定和难溶的α-磷酸三钙，—粘附到所述基体上的多孔骨细胞培养装置。
按照本发明的再一个方面，提供了用来体外矿化胶原基质的组织工程的方法，该方法包括下列步骤—提供一种具有松散内连的圆形颗粒的球状表面形态并且在结构内有内连微孔的人造稳定的组合物，—向组合物上施加悬浮在生理介质中的成骨细胞悬浮液，—培育由成骨细胞在培养液中选出的矿化胶原基质；和—向患者体内植入分离出的胶原骨基质。
附图的简要描述

图1是CaO活性对羟基磷灰石和磷酸三钙的稳定性影响的主要区域示意图。
图2是在稳定的硅本体存在下通过转变本发明的羟基磷灰石物质形成的磷酸钙本体相的曲线图。
图3是CaO/Al2O3对CaO活性影响的曲线图。
图4是CaO/TiO2和CaO/B2O3的比对CaO活性影响的曲线图。
图5包括图(a)、(b)和(c)，表示(a)在组合物与基体的界面处；(b)刚好在界面以上和(c)在膜的顶部的能量分散X射线光谱的结果。
图6是由活性成骨细胞在本发明的稳定薄膜组合物上沉积的矿化胶原骨基质的横截面SEM。
图7(a)是由在稳定的组合物上培养的成骨细胞产生的荧光钙化骨基质沉积的照片。
图7(b)是在稳定的薄膜组合物上未培养成骨细胞和没有看到荧光钙化骨基质的对照照片。
图8是在由人造生物活性稳定组合物组成的整体三维固体陶瓷上的破骨细胞吸收凹坑的SEM。
图9是在人造生物活性稳定组合物的薄膜上的破骨细胞吸收凹坑的SEM。
图10是在表示石英基体上的人造稳定组合物的薄层形态的横截面TEM的放大显微照片。
图11是作为薄膜而涂覆的稳定组合物的SEM显微照片，表示表面微孔结构。
图12(a)是在无稳定本体存在时烧结的市售羟基磷灰石的SEM显微照片。
图12(b)是在硅稳定本体存在下烧结的市售羟基磷灰石的SEM显微照片。
图13是天然骨上的破骨细胞的SEM，表示天然吸收凹坑。
图14是说明用本发明方法制备的整体陶瓷的球表面形态的SEM显微照片。
优选实施方案的详细描述磷酸钙物质的组成按申请人的已公开的共同未决PCT申请WO94/26872中所述。该方法持续可靠地提供了一种磷酸钙相薄膜，该相的羟基磷灰石与α-磷酸三钙的比例在合适的50∶50-20∶80比例范围内。目前已经发现有稳定本体存在时，能够显著地和意想不到地稳定磷酸钙相中的α-TCP，从而提供了能维持和提高成骨细胞和破骨细胞活性的生物活性组合物，该组合物可以以可重复再现的方式给这种活性定量，并且制定了诊断和治疗骨组织损伤的对策。
应该明白，本文所使用的术语“稳定的”是指通过转变羟基磷灰石而形成的磷酸钙相，当将它们置于室温条件下或在体内或体外的生理环境下时能保持稳定不变的结晶和化学结构。还应该明白，术语“生物活性”是指在基本上或完全由本发明的组合物制成的结构中能维持成骨细胞骨生长，同时促进由破骨细胞自然控制的组合物的细胞外吸收并且在与正常骨代谢极相似的过程中避免非特异性化学和/或细胞溶解和/或降解的能力。这种生物活性在有骨细胞存在下在体外和体内使用这些物质时存在。术语“磷酸钙相”包括在烧结产品中的各种磷酸钙，例如羟基磷灰石α-TCP、β-TCP、八磷酸钙、磷酸四钙和磷酸二钙。
最初认为为了体外维持骨细胞活性，适用的磷酸钙产品是纯的或基本上是纯的羟基磷灰石，并且认为在制膜时要选择磷酸钙。现在已经确定羟基磷灰石占主要量的材料不能促进破骨细胞和成骨细胞的正常功能，实际上，在有破骨细胞存在时可观察到的活性极小。但是，已经发现由于提供了包含羟基磷灰石和α-磷酸三钙的磷酸钙相混合物，所以在更宽的范围内提高了吸收程度，而主要由α-磷酸三钙组成的膜提供了最高程度的吸收，而主要由羟基磷灰石组成的膜所提供的吸收程度可被忽略。正是这个关于α-磷酸三钙存在的认识，它部分说明了为什么目前研制的磷酸钙材料可以促进在这类材料上培养的骨细胞的功能特性。以薄膜形式如可以透过光或反射光的形式提供稳定磷酸钙相使得可以实施诊断方法，以此评价在该膜上培养的骨细胞的几种功能特性。
令人惊奇地是，已经发现使羟基磷灰石溶胶—凝胶物质的制备标准化并选择非常特定范围的烧结温度不仅实现了所要求的比例，而且还发现通过将按溶胶—凝胶法制得的羟基磷灰石转变成α-磷酸三钙可以形成最佳的组合物。在这些优选的最佳膜组合物中只检测到很少或未检测到β-磷酸三钙。无需制备羟基磷灰石和α-磷酸三钙各自相的混合物。采用在公开的PCT申请WO94/26872中所述的技术来制备溶胶—凝胶羟基磷灰石就足已。用于在具有较高pH的介质中制备这类羟基磷灰石物质的化学反应如下
起始溶液由水溶液组成，反应物完全溶解于该溶液中并且进行很好地混合。羟基磷灰石以细颗粒的形式悬浮在悬浮液中，在制备后老化溶胶—凝胶物质24小时后，由光散射实验获得的颗粒大小从平均大小为0.3微米到1微米。
羟基磷灰石物质在中性和/或碱性介质中是稳定的。优选的反应介质的pH值较高，通常在约12的范围内。向第二种钙溶液中滴加第一种磷酸盐溶液，以防止形成三磷酸一氢四钙，由此得到所要求的羟基磷灰石产物。过滤溶胶—凝胶物质，干燥成粉末，在氧化铝坩埚中于1000℃下进行煅烧和烧结，形成在潮湿环境的正常条件下呈稳定状态的钙基羟基磷灰石。在1200℃以上的烧结温度下，该相主要转变成α-磷酸三钙，只有少量的其它相例如β-TCP、八磷酸钙、磷酸四钙或磷酸二钙形成。对于本领域熟练的专业人员来说应该清楚在烧结的稳定磷酸钙相中还会形成其它的“掺杂”物质。这类物质也可在烧结前就加入到羟基磷灰石物质中。存在或加入这类掺杂物最好对组合物和稳定组合物的形态没有影响，它们会影响对其上的骨细胞活性的维持。
就烧结过程而言，已经发现羟基磷灰石物质干燥膜的烧结可以在标准型高温炉中进行，无需控制炉内气氛。在使用新的炉子或使用以前用于其它目的已被污染的炉子时，最好使炉子在烧结温度以上的范围内循环空烧结几次。这样预处理后的炉子除去了任何挥发性物质并准备投入使用。无需另外的步骤。在试运转期间和用来烧结涂层物质的正常使用期间可以有外界空气存在，只要存在的外界空气对方法无不利影响并且所要求的比例结果恒定。在这种条件下，在所需的比例为50∶50-20∶80，在有石英物质存在时，烧结温度的范围可以是920-1100℃。已经发现，当温度增加时，羟基磷灰石向α-磷酸三钙的转化率也增加。当烧结温度的范围为920-950℃时，比例可以由50∶50改变成333∶666。在烧结温度选择在950-1000℃的范围内时，比例大约为333∶666。温度增加到超出1000℃以上高达1100℃时，进一步提高了转化率并生成比例在333∶666-20∶80范围内的组合物。优选的烧结温度大约为975℃，此时可达到的比例为333∶666。
羟基磷灰石向α-磷酸三钙的转变过程通过如下的反应进行；
在任何温度下的转变程度与周围气氛中水的分压和改变CaO浓度的因素有关。
形成的磷酸三钙的性质是重要的。对于非化学计量的Ca/P比例为1.5-1.60的羟基磷灰石来说(Nakamura，Thermochimica Acta，第165卷，1990)，以及于许多市售羟基磷灰石粉末(Aldrich化学公司)来说，在将粉末加热到1100℃，然后冷却到低于1000℃时，经常形成β-磷酸三钙。β-TCP是一种稳定的难溶化合物，它会呈现出象矿物白磷钙石那样的性质。在由如上描述的水溶液形成的通过溶胶—凝胶法产生的羟基磷灰石物质的转变过程中以及在由另一种沉淀反应形成的钙基羟基磷灰石粉末中，发现在低于1000℃的温度下，在有稳定本体存在时形成较多α-磷酸三钙。在开发磷酸钙基涂层产品时，α-TCP已经不很引人注意，其原因在于它们具有较高的溶解度而在生理液体中降解，结果只能通过在1250℃以上的温度下高温转变纯羟基磷灰石而产生。
由该转变反应式，可以看出控制体系中CaO活性的任何因素将改变羟基磷灰石的转变温度和可逆性。据信加入的诸如SiO2的稳定本体与CaO反应，反应式如下
从而使转变在低温下进行。在反应中每1摩尔CaO需1摩尔SiO2才能使反应完全。也可能存在形成具有其它CaO/SiO2比的不同硅酸盐的其它反应。
当通过用二氧化硅形成硅酸钙来除去CaO时，如图1所示，形成TCP相的温度被降低到与转变制得的羟基磷灰石组合物的数据相一致的温度。加入硅本体使转变线向右移动，即向形成主要是α-TCP的低温方向移动。
所提出的二氧化硅直接起着与其它的相例如β-磷酸三钙比较，促进α-磷酸三钙形成的作用的机理是硅本体进入羟基磷灰石晶体结构并相对于β相来说更加稳定α相。根据一个优选的实施方案，现已证实起始羟基磷灰石物质的性质和二氧化硅的加入方式是重要的。当向市售的纯羟基磷灰石粉末中加入二氧化硅粉末并共同研磨促进混合时，在1000℃以上的高烧结温度下观察到的转变产品是β-TCP。相反，在向用本发明方法制备的粉末中加入金属有机溶液的二氧化硅时，主要转变成稳定的α-磷酸三钙，如图2所示，该相存在于950℃线的低温下。这种转变是不可逆的。在高温下，掺杂粉末的转变温度被降低，从纯粉末的1200℃以上降低到掺杂二氧化硅的粉末的约950℃。如上所述，可以认为这种结果是由于形成了硅酸钙，从而在冷却至低温时保持了产生稳定相的组成。
按本发明方法制备的掺入稳定本体的粉末具有可重现且稳定的相组成并且该相组成具有所要求的表面形态和内部微孔结构的一个原因是，羟基磷灰石物质原本是用溶胶—凝胶法作为非常细的颗粒而制备的。稳定本体例如金属有机溶液形式的硅本体的加入使这些颗粒的每一个与硅本体层密切接触，致使混合充分。在烧结时，二氧化硅与转化反应中释放的CaO极为靠近。为此可以认为在各个颗粒的表面上形成的难溶硅酸钙本体限制了反应的可逆性并防止α-磷酸三钙在含水生理介质中溶解。
与二氧化硅类似，可以推断钛、铝和硼也可降低转化温度，因此可作为稳定剂使用。图3和4示出了温度降低与形成CaO/Al/Ti/Ba复合物的关系。这些金属也可用来除去羟基磷灰石中的CaO，从而产生稳定的α-TCP。选择稳定剂(掺杂剂)和分散化合物的重要因素是(a)需要与所形成的形成稳定钙化合物的CaO相配合，(b)必须能优选地以围绕在新形成的颗粒外表面上的方式在整个溶胶—凝胶物质中均匀地分散，(c)应该不会稳定磷酸钙体系中不需要的相，和(d)当在生物领域中应用时，必须无毒性。适用于本发明的稳定本体是形成氧化物(优选形成金属氧化物)的那些物质。优选的金属氧化物选自能形成所要求的组成和形态的那些氧化物，例如铝、锆、锗、铬、钒和铌的氧化物，更优选地选自氧化硅和氧化钛。这类稳定本体的混合物也是适用的。
烧结是在稳定本体的存在下进行的。稳定本体可以在烧结过程中通过羟基磷灰石由基体扩散而提供或在烧结前向羟基磷灰石中加入稳定本体来提供。无论是以扩散形式还是以加入形式来提供稳定本体，其用量都应足以稳定磷酸钙相，而所述的磷酸钙相是以薄膜、粉末、厚的涂层、整体陶瓷件和具有内部巨孔的整体陶瓷的形式存在的。优选地，为了维持和促进骨细胞活性，要形成可以重现的并且在烧结过程中是存在的稳定本体的函数的独特生物活性表面形态和内部微孔结构。
根据其欲使用的用途，可以提供各种形式的组合物，例如以用于诊断的薄膜形式或用于骨或牙植入物上的厚涂层的形式存在的组合物。这里，所述薄膜的厚度为0.1-5微米，用于其它基体的厚涂层的厚度为5微米。整体陶瓷件是指其功能与基体无关的较大的整体三维结构。
一个优选的实施方案是在石英基体表面上烧制羟基磷灰石物质。石英基体提供足够的能扩散到磷酸钙相中并产生足够量硅本体的硅本体源。如图5(a)在组合物与基体的界面处，图5(b)刚好在界面上和图5(c)在膜的顶部所示，硅本体可以存在于整个膜组合物中。在烧结期间，硅本体从石英表面上释放出来并扩散通过羟基磷灰石物质层的表面。在羟基磷灰石转变成α-磷酸三钙(羟基磷灰石与α-磷酸三钙的比例在优选的范围内)的过程中，硅本体与CaO反应，形成硅酸钙，硅酸钙与α-磷酸三钙形成稳定的复合物。对于本领域熟练的技术人员来说，应该清楚在烧结期间释放出稳定本体进入磷酸钙相中的其它的基体或添加剂也可在本发明中使用。该稳定本体可以选自金属氧化物和非金属氧化物，例如硅、铝、锆、硼、钛、锗、铬、钒、铌的氧化物和其混合物。含有或由铝、锆、硼、钛和这些物质的各种混合物制成的基体可作为用于提供稳定本体的源。
按照本发明，施加在合适载体上的薄膜明显地有助于研究和理解骨细胞的功能特性。正如本发明所提供的，稳定膜的组成使得它们可以在其上培养各种类型的骨细胞。在研究破骨细胞活性时，可以调节表面组成，以促使膜材料的磷酸钙本体从显著的吸收程度调节到磷酸钙本体的吸收达到可忽略的程度。类似地，通过测定钙化骨基质的构成来研究成骨细胞的活性。提供足够薄的薄膜从而使破骨细胞对本体的吸收可以通过所吸收的磷酸钙本体的消失来测定，这就提供了一种与现有技术的方法相比简单、价廉的分析方法。按本发明制成的膜组成维持了骨细胞的生物功能。在透明的支承基体例如石英或玻璃上施加这种膜的优点是导致了包括自动机器阅读在内的简易判断诊断方法的技术。
理想的膜厚大于0.1微米，原因是已经发现膜厚小于0.1微米时难以获得均匀的无间隙的覆盖膜。至于如何限制膜的上限，任何所需的厚度将取决于其最终用途。正如将要讨论的，吸收程度可以通过透光率来测定，优选地，它要求膜的厚度小于10微米。基体是容易耐所需烧结温度并具有所需透明度的石英，从而可以通过透光率实验来测定膜材料中磷酸钙本体的吸收程度。
研制的薄膜可以在试剂盒及其类似物中使用，用来评价骨细胞的活性。可将膜以“试剂盒”的形式装配，它包括石英基体、其上预涂覆有磷酸钙的薄膜，它们可以在细胞培养容器(可能地是24孔，任选地为无菌的多孔板，直径为约15mm)中使用，作为适合于培养混合骨细胞群体的体系。该装置简单并仅依赖于常规的实验设备和使用技术，适合于进行定量分析，该装置的造价低，但强度足以承受正常的操作水平并可在塑料盒中进行多个包装，例如分24个试样包装。薄膜表面有明确和可重现的化学性，当使用适宜的包装材料包装时，其机械强度足以承受运输压力。
在每一种情况下，培养条件应使单核细胞或多核细胞形式的破骨细胞在功能状态下存活，并能吸收膜中的人造磷酸钙。同样地，成骨细胞在这样的培养条件下也能活性分泌钙化骨基质。
这些基体可以用来评定破骨细胞的吸收活性，监测由于疾病或在培养介质中所含的药剂例如会直接或间接影响破骨细胞吸收活性的药物而导致的吸收活性量的改变。这种基体还适用于培养活性成骨细胞，以观察和测定其分泌的骨基质以及使用沉积的矿化基质进行体内移植。如图6所示，通过在稳定薄膜12的表面(如在石英基体14上提供的)上培养的成骨细胞来沉积矿化胶原基质10。图中示出了一个类似于胶凝线的良好结合的边界层16，并与相同类型的由成骨细胞在体内在新骨和老骨的界面上形成的胶凝线类似。这清楚地表明加压稳定的组合物具有成骨细胞生理活性，从而进一步证实这种稳定的组合物可以用作为重要的骨修复产品。
所述装置可作为定量测定破骨细胞的吸收活性或由于成骨细胞的活性而造成的骨类材料的累积量。这类活性分析可以在连续的实时监控、延时时间间隔或终点测定的情况下进行。测定骨细胞活性的步骤是上述监控方法中常用的，其中骨细胞(动物或人)是在一个或多个装置中在特定条件下培养的。培养周期为几小时到许多天，优选地为约2-10天(最佳时间取决于细胞种类和方案)，在此期间，可以连续地监控、周期地监控破骨活性的范围或在正在进行的基础上对其简单地不进行监控，这样有利于最终点的测定。同样地，通过测定钙化骨基质积累的程度可以观测成骨细胞活性。如图7所示，涂覆有本发明的稳定膜和同时与成骨细胞一起培养的石英盘显示出大量的荧光，这表明有矿化骨基质存在。相反，在只有介质(b)存在的情况下涂覆在石英上的稳定膜未显示出荧光。钙化骨基质的量直接与可测定的发射出的荧光量成正比。四环素是天然的荧光材料。当细胞吸收四环素时，四环素可被代谢，分泌出它们的代谢物并被掺入到新形成的骨基质中。四环素仅仅在被成骨细胞代谢时产生荧光。这表明成骨细胞在稳定的组合物上活性分泌出骨基质。
一旦制备了溶胶—凝胶羟基磷灰石物质，就可用各种技术将其作为薄膜涂覆在所需基体上。例如，浸涂法(C.J.Brinker等人，Fundamentalsof Sol-Gel Dip Coating，Thin Solid Film，第201卷，第1期，97-108，1991)由一系列步骤构成以恒定的速度从溶胶或溶液中取出基体，在适当的温度下干燥涂覆的液体膜，将膜烧制成最终的陶瓷。
在旋转涂覆时，将溶胶—凝胶滴在板上，板以一定的速度旋转，通过离心作用足以使溶液均匀地分布。随后按与浸涂法相同的方法进行处理。
应该认识到有各种技术可以用来向基体上施加溶胶—凝胶的薄膜。其它的技术包括喷涂溶胶—凝胶、滚涂溶胶—凝胶、涂铺溶胶—凝胶和涂抹溶胶—凝胶。
涂覆统一尺寸的单个盘的另一种方法是用溶胶—凝胶膜覆盖大的基体。烧结基体上的整个膜。然后可以在膜上采用诸如栅格类的装置，将其分成多个独立的实验区。
在涂覆溶胶—凝胶物质的各种技术中，所形成的膜的厚度和质量(气孔率、微结构、结晶状态和均匀性)受多种因素影响。这些因素包括起始溶胶的物理特性、组成和浓度、基体表面的清洁度、基体的取出速度和烧成温度。对于浸涂法来说，厚度通常主要取决于取出速率和溶胶粘度。由于溶胶的不均匀性会导致形成微孔和破裂，所以涂层操作应在清洁的室内进行，以避免溶胶的颗粒污染。在热处理阶段，要求温度要高，以产生所需的微结构和所需的羟基磷灰石向α-磷酸三钙的转变。
用浸涂法制备磷酸钙膜的目的有下面两个方面(a)制备具有所需质量(均匀性、厚度和气孔率等)的膜；和(b)制备用于生物试验的在透明基体上的半透明磷酸钙膜。
还发现本发明稳定的人造组合物不仅适用于制备薄膜和厚膜，还适合于制备粉末和整体陶瓷。陶瓷是用本文所述的溶胶—凝胶法制备的烧结粉末来制备的，其中添加二氧化硅形成所需的稳定的羟基磷灰石/α-磷酸三钙相混合物。在一个实施方案中，磨细经过烧结的粉末，使其足以形成0.5-1mm厚的圆片，然后与滴加的具有相同掺杂物组成的溶胶-凝胶物质混合形成有助于保持颗粒的潮湿粉末。在试验膜中在大约5吨/cm2的压力下单轴压制潮湿的粉末。所制成的整块材料具有极好的生坯强度，然后将其在1000℃于空气中烧制1小时。这类陶瓷保持了所有与用作薄膜或涂层的稳定组合物相同的特性。对于SiO2稳定的组合物来说，X射线衍射表明在初始粉末和最终陶瓷之间相组成几乎没有变化。如图8的平面图所示，表面构型与图9所示的涂覆在石英基体上的组合物有惊人的相似之处。破骨细胞在薄膜和整体陶瓷上的吸收能力很类似。通过在整体陶瓷上存在的吸收凹坑18，可以观察到破骨细胞的吸收，它们与在薄膜(图8和9)上所示的吸收凹坑相似。
正如本专业领域熟练的技术人员所认识到的，通过将陶瓷制成整件的形状可以制成用于所需目的的大型整件陶瓷。所制成的整件产品保持了所需的稳定磷酸钙相组成以及促进其上的骨细胞活性的微孔球形表面形态和内部微孔结构。
制备用于生物领域的陶瓷的一个特定方面是制备在内部结构中具有导致生物活性的细的球形表面微孔和内部微孔和孔径为50-1000微米或更大的大尺寸结构的陶瓷件。这促使体系中的骨修复与体内生理骨修复更为接近。处在该范围下限的这种巨孔特别适合于所要求的骨基质的快速生长，而处在该范围上限的这种巨孔使得细胞进入其内部，从而例如进行骨移植片的体外组织制备。在采用诸如二氧化硅的稳定本体掺杂并在使用前进行烧结的粉末时，通过将这种粉末与所需大小的苯乙烯球混合可制备多孔陶瓷。在所需压力下压制掺有苯乙烯球的湿粉末后，通过在约400-600℃的温度下热解除去苯乙烯。接着按以前所说的常规方法在1000℃下烧制多孔陶瓷。这种工艺的结果是所形成的具有外层球形微孔结构、亚外层内部微孔结构和内部巨孔结构的整体陶瓷，从而使得细胞通过整个整体陶瓷部件中迁移并起作用。
作为本领域熟练的普通技术人员应该清楚，为了使陶瓷结构内具有气孔，也可使用与苯乙烯类似的物质。能够在正常的烧结温度下的温度范围内进行热解的其它物质也可用来形成微孔结构。所使用的物质还应该不留有任何毒性残余物。还应该清楚其它的方法也可用来形成微孔，例如机械钻孔、使用激光器或使用发泡剂。
由于本发明的一个显著方面是提供羟基磷灰石和α-磷酸三钙相的混合物，这些物相通过由溶胶—凝胶羟基磷灰石形成的掺杂粉末产生的表面形态而连接，所以本领域内熟练的技术人员应该清楚用该粉末制备膜、涂层和整体构件的其它的方法也可在本发明中使用。这包括使用已知技术例如等离子或热喷涂或电泳沉积。
参见图10，横截面TEM显微照片示出了石英基体(a)，包含小晶粒的界面层(b)和包括膜表面的上层(c)形式的层梯度，其中的膜表面由包埋在颗粒中的小晶体构成，所述的颗粒提供球形微孔结构。在烧结过程中，硅本体从石英中释放出来，在羟基磷灰石转变成烧结薄层的α-磷酸三钙时在羟基磷灰石中扩散。界面层(b)结晶结构要比具有大的磷酸钙相的多晶颗粒表面的小。
该人造烧结组合物的形态独特，以前未曾报道或经证实过。现在，我们所揭示的表面形态具有松散内连的圆颗粒球形表面，其中的圆形颗粒具有内连的微孔结构。在本发明一个优选的实施方案中，所具有的形态成功地维持了功能性破骨细胞和成骨细胞的培养。
涂层表面形态具有特定的形式，包括有类似于珊瑚状的松散内连的球形结构(图11)。颗粒的大小在约0.5-1微米的范围(横向尺寸)内改变。涂层在与基体垂直的方向上是多孔的，它们在接近表面处所具有的平面密度要比接近基体处的大。这种形态使得涂层内的液体介质和其它生理液体可以渗透。相反，用其它共同沉淀方法制备的羟基磷灰石的表面形态不会产生由本发明提供的微孔结构。参见图12(a)和12(b)，在无稳定本体(a)和有稳定本体(b)存在的情况下制备的羟基磷灰石膜的表面形态与图11中用本发明组合物制备的相比无微孔。另外，已有报道合成的多晶羟基磷灰石不会被破骨细胞吸收(Shimizu，Bone and Minerology，第6卷，1989)。
球形表面形态是由大小可与最初由成骨细胞在形成骨的过程中形成的附聚沉积物相比的圆形颗粒构成。本发明的组合物提供的表面形态与细胞在体内预期接触的形态相匹配。图13中示出了典型的破骨细胞吸收凹坑，其中基体是骨。如图9所示，在本发明人造组合物上由破骨细胞20形成的吸收凹坑18与图13天然骨中看见的极为类似，图13说明破骨细胞在两个体系中起类似的作用。这就是说人造烧结组合物的表面形态与细胞在体内预期接触的形态相匹配。
稳定组合物的整体微孔可确保接近人造材料表面处的钙或磷酸盐离子的浓度限定在细胞在体内与天然骨细胞接触时细胞所期望的范围内，所述的天然骨细胞由羟基磷灰石、胶原和其它纤维组织构成。在导致吸收的由破骨细胞参与的细胞外溶解过程中，这种复合材料致使溶解产品有一个特定的局部浓度。在无机人造羟基磷灰石或α-TCP溶解或吸收期间，所产生的限定某些细胞行为的浓度被限定在较窄的范围内，为了使细胞在人造表面上达到可与天然骨相匹配的活性，必须采用一些手段来调节元素例如钙的局部浓度。组合物的气孔率可以通过介质的流动或扩散来实现这一目的。
本发明的稳定的生物活性人造组合物提供了独特的化学组合物，它具有独特的表面形态和以前从未证实过的内部微孔结构。在体内和体外具有稳定的骨细胞生物活性的组合物并且这种组合物在体内能够容易、精确和可重复地定量以前从未报道过。稳定组合物的性质是通用的，可将它们制成粉末、薄膜、厚涂层、整体陶瓷件或巨孔整体陶瓷件。在各种情况下，独特的表面形态、内部微孔率以及稳定的磷酸钙相组成得到保持。如图14所示，用本发明的稳定组合物制成的整体陶瓷的微孔表面形态得到保持。
本发明的稳定组合物适合于体外诊断，以便以大规模和自动方式表征异常骨细胞的功能。稳定的人造组合物还易于用作骨和牙植入物的涂层，以促进组织再生和修复。该组合物的结构应使其与体内骨组织和细胞极为相似，因此可与体内骨组织和细胞相匹配，以避免带来排斥外来材料的问题。
本发明的组合物具有所需的物理特性以及与体内硬组织的亲合性/相匹配性，致使它们能用于各种治疗领域中，例如用于提供体内植入物以及体内再生和修复骨组织，例如替代髋部和膝盖、骨折和牙的植入物。所述组合物还可用于在体外进行的各种组织工程应用，以提供人造骨材料，然后将这种材料作为体内骨移植物而被植入，用于骨组织替代、再生和修复。病人可提供用于在组合物上培养的破骨细胞和成骨细胞，以降低组织排斥的机会，由此产生完全相匹配的骨移植物。另外，供体骨细胞也可用于该目的。可以在有或没有用于产生骨组织的骨细胞的存在下制备这种移植物，用于组织移植。但是，优选地是含有细胞的移植物来自于自体供体，使得与组织排斥有关的问题减至最小。粉末形式的稳定组合物还可用作医学治疗。稳定的粉末可以混合并悬浮在与组织相匹配并且无毒的聚合物中，然后在体内施用以填充骨组织上的孔隙。
可使用本发明组合物的所有用途都具有优点，即破骨细胞和成骨细胞可以通过任何形式的组合物而起作用，由此使骨组织体系更接近体内存在的体系。本发明的人造生物活性组合物促进了骨质传输和吸收，以便可以发生正常组织的愈合和再生，同时在正常骨组织重建过程中吸收人造材料。
下面的方法举例说明提供生物活性人造烧结组合物的本发明的有关方面，所述的组合物具有稳定的磷酸钙本体，它还显示出维持其上的骨细胞活性的独特形态。方法1.制备羟基磷灰石溶胶—凝胶物质下面的方法是制备足够量的用于制备目的的溶胶—凝胶羟基磷灰石。溶液A含有硝酸钙四水合物和溶液B含有正磷酸二氢铵(一价碱)。混合溶液A和溶液B，生成所需的溶胶—凝胶即溶液C。向4.722g硝酸钙(Ca(NO3)2)中加入40ml二次蒸馏水以制备溶液A。以中等速度搅拌该溶液达足够的时间以溶解全部的硝酸钙，搅拌时间通常在3分钟以内。向该溶液中加入3ml氢氧化铵(NH4OH)，再搅拌约3分钟。测定溶液的pH值，要求pH值约为12。向该溶液中加入37ml二次蒸馏水，使溶液的总体积达到约80ml。再搅拌溶液7分钟并盖上该溶液。
向250ml装有1.382gNH4H2PO4的烧杯中加入60ml二次蒸馏水以制备溶液B。盖上烧杯并以中等速度搅拌3-4分钟，直到全部的NH4H2PO4溶解。向该溶液中加入71ml NH4OH，然后盖上烧杯，再连续搅拌约7分钟。测定溶液的pH值，要求pH值约为12。向该溶液中再加入61ml二次蒸馏水，盖上溶液以使溶液的总体积达到约192ml。再搅拌溶液7分钟并盖上溶液。
接着合并溶液B和溶液A，以制备所需的溶胶—凝胶。将所有的溶液A加入到500ml试剂瓶中。以中等速度开始搅拌，并以大约256ml/小时的速率向试剂瓶中加入溶液B，直到将全部的192ml溶液B供入溶液A中。过量的溶液B可用于补偿在250ml烧杯中保留的或在转移过程中管子中的任何溶液。在完成加料和溶液A与溶液B的合并以后，以中等速度连续搅拌所制成的溶液大约23-24小时。观察产生的溶胶—凝胶是否有任何异常的沉淀或附聚。如果发生了任何异常的沉淀或附聚，那么必须丢弃溶液并次开始制备过程。然后小心地将该溶胶转移到另一个500ml试剂瓶中，以避免混入可能存在在原始试剂瓶的壁上的任何颗粒附聚物。向离心瓶中加入大约240ml的溶液C即生成的溶胶—凝胶，并在室温下以500rpm的速度离心20分钟。离心后，在不干扰沉降物的情况下倒掉180ml上清液。通过以平稳转动的方式混合使沉降物缓慢地再悬浮约30分钟。然后测定溶胶—凝胶的粘度，优选地为20-60cP。随后就可以将溶胶—凝胶用于浸涂所选择的基体或用于其它应用。方法2.制备掺杂二氧化硅的羟基磷灰石物质按如下方法制备二氧化硅溶液。所确定的量为每4ml溶液中大约含有0.168gSiO2。将4ml二氧化硅溶液加入到60ml在方法1中制备的经离心的羟基磷灰石溶胶—凝胶物质中，并与转变反应中生成的0.168gCaO反应。硅溶液组分正硅酸四丙酯Si(OC3H7)47.32gm2-甲氧基乙醇CH3OCH2CH2OH34.5gm将二氧化硅溶液加入到由方法1制备的羟基磷灰石物质中，以使SiO2的浓度与在烧结转变过程中产生的CaO的浓度的比为1M SiO2/l摩尔CaO。方法3.制备薄膜根据基体的性质，可用方法1或方法2制备羟基磷灰石溶胶—凝胶物质的方法来制备薄膜。如果基体能提供烧结膜中所需的稳定本体的话，那么可以采用方法1。如果基体不能提供这类稳定本体，那么将需要采用具有掺杂添加剂的方法2。
在将薄膜涂覆到基体上之前，需要彻底地清洁基体，以确保膜具有令人满意的覆盖度。在基体是石英的情况下，通过将盘放置在玻璃烧杯中并向玻璃烧杯中加入铬酸清洗溶液并覆盖整个盘来实现清洁。然后盖上烧杯。接着在水浴中声处理该盘1小时。用自来水冲洗酸20分钟。通过三次更换二次蒸馏水除去残余的自来水。在最后一次更换二次蒸馏水后，用不起毛的抹布擦干各单个盘并检查石英表面上的毛病。需要时用压缩氮气或空气清除表面上的任何残余颗粒。将所述盘在无菌环境下存放在带盖容器中。这种方法可用来清洁任何类型的石英基体。
将具有适当组成的石英盘基体或其它基体浸渍在方法1制备的溶胶—凝胶中。抓住盘的边缘以避免触及表面。将盘浸渍在溶胶中，优选地是通过机械方法进行。按预定的取出速度从溶胶中取出盘。除去盘一侧上的涂层。然后将涂覆的基体置于清洁的陪替式培养皿中，盖上盖并在室温下干燥。在烧结前形成的膜应该是均匀，无裂纹、块或孔隙。应该清楚涂覆盘表面的浸涂工艺也可用来涂覆其它形状的基体，例如平面矩形石英基体。方法4.制备羟基磷灰石干粉将按方法1或2制备的溶胶—凝胶物质在100℃干燥约8小时。然后采用研钵、研杵和其它能研磨和产生细颗粒的机械方法研磨干燥的物质。随后按下面如方法7所述的标准的烧结过程烧结粉末，其不同之处在于将粉末置于坩埚中进行烧结，然后在冷却后再次研磨。可用相同的方法制备掺杂或稳定的羟基磷灰石。方法5.生产整体陶瓷件按照下面的方法用掺杂二氧化硅的羟基磷灰石粉末制备陶瓷(三维整件)。掺杂的溶胶—凝胶物质是按方法2制成的。贮存部分溶胶—凝胶物质并将剩余的一部分过滤。在120℃下干燥粉末，研磨制成细粉末。将约0.09gm的粉末置于塑料盘中。使用玻璃滴管形成初始溶胶—凝胶物质的滴液，所述的溶胶—凝胶当与粉末混合时重量约为0.055gm。将溶胶与粉末混合成潮湿状，但不是湿的浆料。将该潮湿状浆料装入到直径为6.25mm的不锈钢模中，以2千公斤/分钟的压力压制。从压模中取出整件，在空气中干燥，并按方法7在带盖的氧化铝坩埚中进行烧制。其表面形态与图14所示的人造烧结薄膜的形态极为相似。方法6.制备具有微孔结构的整体陶瓷件将按方法2制备的掺杂有稳定本体例如二氧化硅并在1000℃下烧结的羟基磷灰石粉末与大小合适的苯乙烯球混合，用另外的溶胶—凝胶物质湿润粉末，在约1吨/cm2的压力下压制，以便不会挤压苯乙烯。采用剩余溶胶和2.5％(重量)的聚乙烯醇溶液湿润混合物，压实粉末/苯乙烯以增加其生坯强度。在空气或氧气中加热到550℃进行热解，除去苯乙烯。然后按方法7所描述的标准烧结的方式将微孔陶瓷烧制到1000℃。方法7.烧结羟基磷灰石物质下面的烧结过程可以在各种尺寸，能在环境温度至1100℃的温度下进行操作的标准实验室窑炉内进行，该窑炉被设计成可以使其内部温度保持在精确和稳定的状态，尤其使温度处在800-1100℃的范围内，例如使用Lindberg型51744或894-Blue M炉子。将按方法3、4、5或6制备的组分小心地转移到标准陶瓷板上(如在Lindberg炉中通常进行的)。陶瓷板在烧结过程中用作载体，从而可以容易地向炉子中装入和取出多个基体。将炉温设置到可以达到所需的HAα-TCP比例的温度。使用可以用程序控制的炉子例如Lindberg型894-Blue M的炉子，可使炉子被程序控制，以保持所要求的温度，温度通常被设置在920-1100℃，烧结时间最长为1小时，以确保硅本体扩散通过由羟基磷灰石和α-磷酸三钙所形成的梯度层。在使用不能用程序控制的炉子的情况下，可以使用独立式计时器，旨在在选择的温度下在所需的烧结时间结束时提醒操作者关闭炉子。在将炉内温度冷却到手可以接触并安全的温度(大约60℃)后，在任何时间取出带有烧结基体的陶瓷板。然后可以包装或贮存单个基体用于最终的应用。
根据该方法，羟基磷灰石/α-磷酸三钙的薄膜和增厚涂层可以按稳定的方式来生产，其产品具有所需的组成，结果使得各种工艺参数的变化程度达到最小，以确保这种稳定性。
尽管在本文中详细描述了本发明优选的实施方式，但是对于本领域内那些熟练的技术人员来说应该清楚在不违背本发明精神或所附的权利要求书范围的情况下可改变本发明。
权利要求
1.用来提供能稳定地维持其上的骨细胞活性形态的生物活性人造烧结组合物，所述的组合物含有稳定的磷酸钙相，该磷酸钙相是在有稳定本体存在的情况下，通过在烧结温度下将羟基磷灰石物质转变成难溶并且稳定的磷酸三钙而产生的。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述的稳定的磷酸三钙主要是α-磷酸三钙。
3.根据权利要求2的组合物，其中所述的组合物为粉末、薄膜、厚涂层或三维整体材料。
4.根据权利要求3的组合物，其中所述的膜厚约0.1-10微米。
5.根据权利要求3的组合物，其中所述的羟基磷灰石物质在烧结前就被施加在基体上，所述基体含有选自硅本体、铝本体、锆本体、钡本体、钛本体和它们的混合物的组分。
6.根据权利要求5的组合物，其中所述的稳定本体是在烧结期间从所述的基体中释放出来的或者是在烧结前添加到羟基磷灰石物质中的。
7.根据权利要求3、5或6的组合物，其中所述的稳定本体选自硅、锗、铬、钒、铌、钛、硼、铝、锆和其混合物。
8.根据权利要求2的组合物，其中所述的组合物被涂覆到石英基体上，硅本体是在烧结期间从石英中释放到所形成的磷酸钙相中以稳定α-磷酸三钙。
9.根据权利要求3的组合物，其中所述的硅本体是在烧结前以溶液形式加入到羟基磷灰石物质中的。
10.根据权利要求1或9的组合物，其中所述的硅本体是正硅酸四丙酯。
11.根据权利要求1的组合物，其中所述的磷酸钙相中羟基磷灰石与α-磷酸三钙的比例为50∶50-20∶80。
12.根据权利要求1的组合物，其中所述的组合物难溶于pH值为约6.4-7.3的生理液体中。
13.用来提供能稳定地维持其上的骨细胞活性形态的生物活性人造烧结组合物的制备方法，所述的方法包括通过烧结使羟基磷灰石物质主要转变成α-磷酸三钙，和提供起稳定作用的本体以使所形成的α-磷酸三钙稳定并在磷酸盐相中难溶。
14.根据权利要求13的方法，其中所形成的组合物为粉末、薄膜、涂层或三维固体。
15.根据权利要求14的方法，其中所述所羟基磷灰石物质被施加在基体上，所述基体含有选自硅本体、铝本体、锆本体、钛本体、硼本体、锗本体、铬本体、钒本体、铌本体和它们的混合物的组分。
16.根据权利要求15的方法，其中所述的稳定本体是从所述的基体中释放到在烧结期间形成的羟基磷灰石相中的。
17.根据权利要求14或16的方法，其中所述的稳定本体选自硅、铝、锆、钛、硼、锗、铬、钒、铌和其混合物。
18.根据权利要求17的方法，其中所述的羟基磷灰石物质被涂覆到石英基体上，硅本体是在烧结期间从石英中释放到所形成的磷酸钙相中以稳定α-磷酸三钙。
19.根据权利要求13的方法，其中在烧结前以溶液的形式将硅本体加入到羟基磷灰石物质中。
20.根据权利要求13或19的方法，其中所述的硅本体是正硅酸四丙酯。
21.根据权利要求13的方法，其中所述的磷酸钙相中羟基磷灰石与α-磷酸三钙的比例为50∶50-20∶80。
22.根据权利要求13的方法，其中羟基磷灰石物质的烧结是在900-1100℃的温度下进行的。
23.用来维持骨细胞活性的烧结人造微孔多晶结构，所述的结构含有烧结的稳定磷酸钙相，该磷酸钙相在所述的结构中具有内连微孔的松散内连圆形颗粒的球形表面形态。
24.根据权利要求23的多晶结构，其中所述的结构具有如图10所示的球形表面形态。
25.根据权利要求24的多晶结构，其中所述的圆形颗粒的横向尺寸在0.5-1微米的范围内。
26.一种可植入的钙化骨基质，含有a)用来维持所述基质的结构；b)稳定的磷酸钙相层，该磷酸钙相是在稳定本体的存在下，通过在烧结温度下将羟基磷灰石物质转变成磷酸三钙而产生的，其中稳定本体使磷酸钙相不溶并稳定；c)由在上述的稳定的磷酸钙相层上培养的成骨细胞沉积而成的界面层；和d)由这种培养的成骨细胞分泌的矿化胶原基质。
27.权利要求26所述的可植入的钙化骨基质，其中所述的骨基质不含包括成骨细胞在内的骨细胞。
28.权利要求26所述的可植入的钙化骨基质，其中所述的基质包含患者的包括成骨细胞在内的骨细胞。
29.权利要求26所述的可植入的钙化骨基质，其中所述的基质能被破骨细胞吸收。
30.用权利要求1或2的组合物制成的整体陶瓷微孔结构。
31.根据权利要求30所述的整体陶瓷微孔结构，其中所述的结构具有内部巨孔。
32.一种用权利要求1或2所述的烧结组合物涂覆的可植入的装置。
33.一种主要由权利要求1所述的组合物组成的可植入的装置。
34.培养有功能的骨细胞的方法，所述方法包括将悬浮在生理介质中的骨细胞悬浮液施加到在基体上的稳定磷酸钙相的人造烧结膜上，所述的膜含有稳定且难溶的α-磷酸三钙复合物。
35.一种用来监测和定量测定骨细胞活性的试剂盒，所述的试剂盒包含具有磷酸钙相烧结膜的基体，所述的磷酸钙相含有稳定和难溶的α-磷酸三钙，粘附到所述基体上的多孔骨细胞培养装置。
36.一种用于体外对矿化胶原基质进行处理的方法，该方法包括如下的步骤—提供一种具有松散内连圆形颗粒的球状表面形态并且在结构内有内连微孔的人造稳定的组合物，—向该组合物上施加悬浮在生理介质中的成骨细胞悬浮液，—培育由成骨细胞在培养液中选出的矿化胶原基质；和—将分离出的胶原骨基质植入病人体内。
全文摘要
本发明涉及提供能稳定地维持其上的骨细胞活性形态的生物活性人造稳定的烧结磷酸钙相组合物。所述组合物含有稳定的磷酸钙相,它们是在有稳定本体存在的情况下在烧结温度下通过将羟基磷灰石物质转变成难溶和稳定的磷酸三钙而产生的。本发明在评价异常骨细胞活性以及医学治疗的医学诊断,包括骨和牙组织更换和修复以及体外骨接肢组织工程方面有许多用途。
文档编号C04B38/00GK1195336SQ96196686
公开日1998年10月7日 申请日期1996年8月30日 优先权日1995年9月1日
发明者悉尼·M·皮尤, 蒂莫西·J·N·史密斯, 迈克尔·塞耶, 萨拉·多西·兰斯塔夫 申请人:米列姆·贝尔罗吉克公司