雄性不育基因OsDPW2的应用及水稻育性恢复的方法
【专利摘要】本发明公开了一种雄性不育基因OsDPW2的应用及水稻育性恢复的方法；采用常规基因工程方法或基于CRISPR/Cas9系统，敲除、改变或抑制OsDPW2基因，在粳稻背景野生型水稻中使得OsDPW2基因表达水降低，进而获得水稻雄性不育系。本发明还涉及一种水稻育性恢复的方法，通过引物扩增OsDPW2基因，使用遗传转化的手段转化突变体植株，能够使突变体恢复到野生型表型。本发明制备的水稻雄性不育株系在水稻营养生长时期无异常表型出现，但在生殖生长时期的花药发育过程中出现异常。如果应用于杂交育种中，可以免除母本去雄的工作，大大提高生产效率，降低人工成本，在农业生产上具有重要的应用。
【专利说明】
雄性不育基因0sDPW2的应用及水稻育性恢复的方法
技术领域
[0001] 本发明设及的是一种生物工程技术领域的水稻株系创制的方法，具体设及一种雄 性不育基因 0SDPW2的应用及水稻育性恢复的方法。
【背景技术】
[0002] 水稻是全世界重要的粮食作物，世界上约有50%的人口 W水稻为主食，大米也是 加工许多食品的原材料。由于水稻的基因组较小，且水稻转化系统非常成熟，可W作为单子 叶研究的模式植物，人们对水稻生殖发育机制还有待了解。水稻雄性不育系的发现及其利 用开创了水稻杂交育种的新时代，对提高水稻产量发挥了巨大作用。由于目前水稻杂交过 程中使用的不育系存在育性不稳定、细胞质负效应等缺点，因此深入开展水稻雄性不育调 控机制的研究，对获得新型水稻不育系，提高农业产量等具有重要意义。同时对掲示植物生 殖发育的分子调控机理等方面也具有重要的理论意义。
[0003] 雄性不育系：是指一种雄性退化（主要是花粉退化)但雌蕊正常的母水稻，由于花 粉无力生活，不能自花授粉结实，只有依靠外来花粉才能受精结实，因此借助运种母水稻作 为遗传工具，通过人工辅助授粉的方法，就能产生大量杂交种子。从育种战略上看，杂交水 稻的发展可W分为Ξ系法、两系法和一系法Ξ个发展阶段。每进入一个新阶段，都是育种上 的一次突破，从而会把水稻的产量提高到一个新台阶。现在生产上用的杂交水稻属于Ξ系 法品种间杂交优势利用的范畴，运种Ξ系杂交稻一般要比常规水稻增产20%左右，当前仍 处于方兴未艾时期。但是，Ξ系法杂交水稻种子优势表现复杂，受恢复系和保持系关系限 审IJ，使优良组合的筛选比较困难。因此，科学家一直在筛选和培育新的不育系，W期扩展细 胞质背景，为远缘杂交和杂种优势的利用奠定基础。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种雄性不育基因 0SDPW2的应用及水 稻育性恢复（即，恢复水稻雄性不育）的方法。本发明利用0SDPW2基因及其蛋白参与调控水 稻雄性生殖的特点，及其利用转基因技术控制水稻雄性生殖发育，通过突变该蛋白序列或 抑制该蛋白的表达产生新的水稻雄性不育株系，在农业生产上具有十分重要的应用。
[0005] 本发明的目的是通过W下技术方案实现的：
[0006] 第一方面，本发明设及一种雄性不育基因 0SDPW2的应用，所述的雄性不育基因 0SDPW2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的应用是：采用常规方法或基于 CRISPR/化s9系统，敲除、改变或抑制0sDPW2基因，使得常规水稻品种中的0sDPW2基因表达 水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。
[0007] 第二方面，本发明还设及一种水稻不育株系创制的方法，包括如下步骤:选择常规 水稻品种，处理，培育，即得所述水稻雄性不育株系，所述处理为，采用常规方法或基于 CRISPR/化s9系统，使得水稻中编码如SEQ ID No. 1所示氨基酸的核巧酸序列发生缺失，变 异或抑制，进而使得所述氨基酸序列对应多肤的表达水平降低或活性丧失。
[000引优选地，所述水稻品种为梗稻品种9522。
[0009] 优选地，所述核巧酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0010] 优选地，所述水稻雄性不育株系创制的方法包括如下步骤:采用物理诱变的方法， 使常规水稻品种中如SEQ ID No.2所示核巧酸序列突变为SEQ ID No.9,进而获得所述水稻 雄性不育株系，即〇sdpw2突变体。
[0011] 优选地，所述水稻雄性不育株系创制的方法包括如下步骤:采用物理诱变的方法， 使常规水稻品种中如SEQ ID No.1所示氨基酸序列突变为SEQ ID No.10,进而获得所述水 稻雄性不育株系，即osdpw2突变体。
[0012] 优选地，所述基于CRISPR/Cas9系统具体包括:采用CRISPR/Cas9系统定点敲除的 方法，敲除0SDPW2基因，抑制编码如SEQ ID No. 1所示氨基酸序列的核巧酸序列的表达。
[0013] 更优选地，所述CRISPR/tas9系统定点敲除的方法包括如下步骤：
[0014] a)合成单核巧酸序列引物如沈Q ID No.3和沈Q ID No.4所示；
[0015] 0sDPW2CRISPRUP(SEQ ID No.3)：TGTGTGGCGGCGCCGGCGACGCACTG
[0016] 0sDPW2CRISP畑0WN(SEQ ID No.4):AAACCAGTGCGTCGCCGGCGCCGCCA
[0017] b)通过退火反应使合成的单核巧酸序列形成二聚体结构，与载体片段(载体来自 百格公司，货号861(〇3)进行连接反应，构建含有水稻〇3〇?胖2基因祀序列（如560 1〇齡.5所 示）的0SDPW2-BGK03质粒；
[001引C)用含0SDPW2-BGK03质粒的根癌农杆菌侵染水稻品种；
[0019] d)通过利用如沈Q ID No.l巧日沈Q ID齡.12所示的〇3〇?胖2基因的特异性引物，扩 增基因组片段进行测序，筛选突变植株。
[0020] Identify-F(SEQ ID No.11)：GTGGAGCTTGGAGTGAAGCGA [00別]Identify-R(SEQ ID No.l2):GGGGTCGGGGCGGGTGATGTC
[0022] 所述水稻0sDPW2基因祀序列如下所示：
[0023] 沈Q ID No.5:GCGGCGCCGGCGACGCACTG
[0024] 第Ξ方面，本发明还设及一种所述水稻雄性不育株系创制的方法获得的水稻雄性 不育株系在水稻制种中的用途，所述用途包括：W所述水稻雄性不育株系作为母本，进行杂 交育种。
[0025] 第四方面，本发明还设及一种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，包 括如下步骤:采用常规遗传手段将所述0SDPW2基因，转入如前述所述应用获得的水稻雄性 不育株系，进而使得突变体恢复野生型表型。
[0026] 优选地，所述方法包括如下步骤：将含0SDPW2互补构建的根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens化ΗΑ105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中 〇3〇口￥2互补构建含有编码如5日〇10^.6所示的核巧酸序列。
[0027] 更优选地，所述方法具体包括如下步骤：
[0028] (a)从野生型9522幼苗叶片中提取基因组DNA作为模板，用碱基序列如SEQ ID 齡.7和569 10齡.8所示的引物扩增出〇3〇口胖2基因的如沈9 10^.6所示的59976口的基因 组序列片段；
[0029] (b)提供携带表达0sDPW2互补构建载体的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)EHA105；
[0030] (c)将水稻雄性不育株系的细胞或组织或器官与步骤(b)中的农杆菌接触，从而使 编码如SEQ ID NO. 1所示氨基酸的核巧酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；
[0031] (d)选择转入所述核巧酸的水稻细胞或组织，再生，获得恢复育性的水稻植株。
[0032] 优选地，编码如SEQ ID NO. 1所示氨基酸的核巧酸如SEQ ID No.2所示。
[0033] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0034] 1、本发明通过控制水稻花粉乙酷转移酶0SDPW2基因及其编码蛋白获得水稻雄性 生殖发育的变异株，实现控制水稻生殖过程；
[0035] 2、本发明制备的水稻雄性不育株系在水稻营养生长时期无异常表型出现，与来源 亲本无明显差异，但在生殖生长时期的花药发育过程中出现异常，花粉败育，得到完全不育 的植株，如果应用于杂交育种中，可W免除母本去雄的工作，大大提高生产效率，降低人工 成本，在杂交水稻构建和农业生产上具有十分重要的应用。
【附图说明】
[0036] 通过阅读参照W下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0037] 图1为OS化w2突变体植株的形态学观察示意图；其中，图1A为野生型9522和OS化w2 突变体整株表型；图1B为野生型9522和os化w2突变体穗形；图1C为野生型9522和os化w2突 变体小穗；图1D为野生型9522和OS化w2突变体小花内部结构；图化为野生型9522和OS化w2 突变体雄蕊；图IF为野生型9522成熟花粉I2/KI染色结果；图1G为osdpw2突变体I2/KI染色结 果；
[003引图2为0sDPW2表达模式示意图；其中，图2A为半定量RT-PCR法确定0sDPW2基因的表 达模式示意图；图2B为巧光定量PCR确定0SDPW2基因的表达模式示意图；图2C为GUS染色分 析结果示意图；图2D为染色的StagelO花药半薄切片示意图；
[0039] 图3为互补OS化w2突变体得到野生型表型示意图；其中，图3A为野生型9522小花内 部结构图；图3B为野生型成熟花粉I2/KI染色结果；图3C为野生型9522恢复育性时小穗种子 图；图3D为互补OS化w2突变体后代的小花内部结构图；图3E为互补OS化w2突变体后代的成 熟花粉I2/KI染色结果；图3F为互补osdpw2突变体后代恢复育性时小穗种子图。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。W下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不W任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进。运些都属于本发明 的保护范围。
[0041 ]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring 化rbor Laboratory Press, 1989)中所述 的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0042] 所述0sDPW2基因为编码如SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的核巧酸序列SEQ ID NO.2。
[00创实施例1、水稻雄性不育株系创制的方法
[0044] 1.1通过常规育种手段创制os化w2水稻雄性不育株系
[0045] 本实施例的OS化w2突变材料是由常规梗稻品种武育梗7号(又名9522)经过常规的 基因工程方法突变而得。
[0046] 本领域人员知晓，还可W采用诸如射线照射等其他手段诱变水稻常规品种进行突 变，具体包括经过^Co 丫射线诱变获得OS化w2突变体，处理剂量为280Gy (参照方法:陈亮，储 黄伟，袁政，et al. 60CO 丫 -Ray射线诱变水稻突变体的分离和遗传学初步分析[J].厦口大 学学报：自然科学版，2006,（S1) :82-85)。对诱变的突变体回交Ξ代，获得隐性核单基因控 制的稳定遗传的OS化w2突变体。将OS化w2突变体与9522回交，所有F1代的表型都与9522- 致，表现为可育。突变体与野生型杂交的F1代自交后产生的F2代群体中，可育与不育植株的 分离比约为3:1，表明运是一个由隐性单基因突变导致的突变体不育的表型。
[0047] 1.2水稻育性控制蛋白基因 0sDPW2的克隆
[004引利用发明人构建的包含育性控制蛋白基因0sDPW2(其核巧酸序列如SEQ ID No.2 所示)及其突变基因 os化w2(其核巧酸序列如SEQ ID No.9所示)组成的、本领域内技术人员 清楚的水稻基因定位克隆(map-based cloning或position cloning)群体，按分子标记定 位于1个小的基因组片段内，例如100肺内。在此基础上，用常规方法分离包含该片段的基因 组DNA克隆。经测序和进一步的杂交鉴定确定其中一个含完整水稻雄性生殖发育控制蛋白 0sDPW20
[0049] 经全核巧酸序列分析结果表明：水稻雄性育性0sDPW2基因全长为2129bp(SEQ ID NO. 13,包含调控区和内含子）。经软件分析和cDNA克隆，其ORF如SEQ ID NO. 2所示，编码全 长为447个氨基酸的水稻雄性生殖发育控制蛋白，其序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0050] 1.3水稻育性控制蛋白基因0sDPW2的点突变
[0051 ]本实施例的0sdpw2突变材料是由常规梗稻品种武育梗7号（又名9522)经过对 0sDPW2基因的序列变异获得，经过对0sDPW2突变基因 OS化w2的序列比较，水稻雄性生殖发 育控制蛋白的移码和提前终止会使得水稻雄性生殖器官不能正常发育，造成植株不育;本 实施例0SDPW2突变基因是在编码区的1个碱基对缺失(其序列如SEQ ID NO.9所示）引起水 稻雄性生殖发育控制蛋白翻译得提前终止和功能丧失。
[0052] 1.4通过CRISPR手段降低水稻品种中的0sDPW2的表达水平
[0化3] 为了对0sDPW2蛋白进行应用，构建了0sDPW2基因 CRISPR的载体(载体来自百格公 司，货号BGK03)，并转化野生型9522植株，W降低0SDPW2的表达，从而达到改变水稻育性的 目的。
[0054] 合成单核巧酸序列引物
[0055] 0sDPW2CRISPRUP(SEQ ID No.3)：TGTGTGGCGGCGCCGGCGACGCACTG
[0056] 0sDPW2CRISP畑0WN(SEQ ID No.4):AAACCAGTGCGTCGCCGGCGCCGCCA
[0057] 通过退火反应使合成的单核巧酸序列形成二聚体结构，与载体片段(载体来自百 格公司，货号BGK03)进行连接反应，构建含有水稻0sDPW2基因祀序列0SDPW2-BGK03质粒； [0化引将含有0SDPW2-BGK03构建的农杆菌在含有Kan(50ygAU)的Y邸平板上划线，获的 单菌落。挑单菌落接种到3ml含抗生素的YEB液体培养基中于28Γ振荡培养过夜，第2天按 1 %接种量转接入50ml含抗生素的YEB液体培养基中，20化pm继续振荡培养至0D6日日为0.4至 0.6左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000巧m、离屯、5分钟，收集并重悬于]V3体积的AAM液体 培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。
[0059] 本实施例采用常规的农杆菌转化方法转化水稻9522的幼胚愈伤。取授粉后12-15 天的9522未成熟种子经70%乙醇浸泡1分钟后，于次氯酸钢溶液中（与水1:3混合，加2-3滴 吐溫20)消毒90分钟W上，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和綴子挑出幼胚并转入到 N6D2培养基上诱导愈伤组织，在26± rC、避光条件下培育，4天后可用于转化。将幼胚愈伤 浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去 过多的菌液，随即转移到N6D2C培养基上，于26Γ共培养3天。共培养时，在共培养培养基中 加入乙酷下香酬，使用浓度为1〇〇μΜ"3天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并 转入含有25mg/L潮霉素的选择培养基上进行选择培养。7-12天后将抗性愈伤组织转到含有 50mg/L Hyg的选择培养基上继续筛选。10-12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化 培养基上培养一周左右，再移至分化培养基上分化（12小时光照/天）。再生的小苗在1/ 2MS〇H培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室营养液栽培。
[0060] 阳性植株提取叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。测序检测祀位点基因序列， 如果发生纯合突变则为有效的基因敲除植株。
[0061] 1.50SDPW2蛋白活性丧失或表达水平降低导致水稻雄性发育异常
[0062] 对osdpw2突变体植株的形态学观察。如图1，野生型和突变型OS化w2的表型在营养 生长时期没有明显差别，在营养生殖生长时期，野生型和突变型OS化w2的穗形、穗粒数均没 有明显差异，但是对比显示野生型9522花药发育正常，而OS化w2突变型花药变白变小(D， E);野生型9522舰染正常(F)，突变型OS化w2花药舰染不上成熟的花粉粒(G)。
[0063] 1.60SDPW2 表达特征
[0064] 利用OS化w2突变株的来源亲本9522各个器官组织，提取RNA，进行反转录得到cDNA 第一链，利用半定量RT-PCR(图2A)和巧光定量PCR的方法确定0sDPW2基因的表达模式（图 2B)，发现0SDPW2基因在水稻中是广泛表达的，在根、茎、叶和不同发育时期的花药中都有表 达。在水稻雄性生殖发育时期花药的Stage?至Stagell显著表达。用0SDPW2基因自身启动子 融合GUS报告基因，转化野生型，染色T1代转基因阳性植株，GUS染色分析显示其在花药的 51曰旨日7至51日旨日11表达（图2〇，对染色的51日旨日10花药半薄切片显示其在花药的绒拉层和小 抱子中高表达(图2D)。
[0065] 1.70SDPW2基因在创制其他水稻品系雄性不育株系中的应用
[0066] 将osdpw2突变体与釉稻品种9311、龙特甫或广陆矮4号水稻品系杂交，在F2代中具 有釉型特征的植株中均出现了雄性不育株系，符合3:1分离规律，进而证明0SDPW2基因在其 他水稻品种中发生核巧酸序列变化时，同样可W产生雄性不育植株。
[0067] 实施例2、os化w2突变体在水稻制种中的用途
[0068] 将OS化w2突变体作为父本与Ξ系或两系杂交组合中的不育亲本杂交，得到F1代。 在F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株，将该植株与原不育亲本对应的保持系 杂交。再次在F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株与保持系杂交，经多代杂交 筛选后获得新的雄性不育系，适宜作为杂交组合中的母本。
[00~]实施例3、恢复OS化w2突变体雄性不育性状的方法
[0070]将编码0SDPW2基因的基因组核巧酸序列转入突变体OS化w2突变体植株，能够使突 变体恢复到野生型表型。
[0071] 从野生型9522幼苗叶片中提取基因组DM作为模板，用引物：
[0072] 70025曲NAF(其序列如沈Q ID NO.7所示）：
[0073] CCATGATTACGAATTCTATTGCCTGTTTGTGGCTGGAC，
[0074] 70025gDNAR (其序列如 SEQ ID N0.8所示）： ATTCGAGCTGGTCACCGCCGCTTACACGTTACTGTATTGG
[0075] 扩增出0sDPW2基因的如沈Q ID ^.6所示的59976口的基因组序列片段；
[0076] 将该片段通过大连宝生物公司的In-Fusion转化体系将扩增的DNA片段插入到用 于转化水稻的双元载体DCAMBIA1301载体中；测序验证正确，该载体通过电击导入根癌农杆 菌（Agrobacterium tumefaciens 化HA105得到0sDPW2互补根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens化HA105,使用遗传转化手段转化突变体osdpw2突变体营养生殖生长期的幼穗 愈伤，从而使编码如SEQ ID NO. 1所示氨基酸的核巧酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞 的染色体上;再生，获得水稻植株;W观察是否会使突变体恢复到野生型表型。
[0077] To代获得互补植株，图3显示To代互补植株可W产生花粉，并被I2/KI染色，即表现 出的野生型表型。
[0078] 综上所述，本发明通过控制水稻BA皿家族HXXXD类型的乙酷转移酶0sDPW2基因及 其编码蛋白获得水稻雄性生殖发育异常的变异株，实现控制水稻雄性生殖发育和育性;本 发明获得的水稻突变体在营养生长时期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后，雄 性生殖器官发育异常、花粉败育引起植株不育，在农业生产上具有十分重要的应用。
[0079] W上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可W在权利要求的范围内做出各种变形或修改，运并不影 响本发明的实质内容。
【主权项】
1. 一种雄性不育基因 OsDPW2的应用，其特征在于，所述的雄性不育基因 OsDPW2编码的 氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的应用是：采用常规基因工程方法或基于CRISPR/ Cas9系统，敲除、改变或抑制0sDPW2基因，在粳稻背景野生型水稻中使得0sDPW2基因表达水 平降低，进而获得水稻雄性不育株系。2. -种水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，包括如下步骤:选择常规水稻品 种，处理，培育，即得所述水稻雄性不育株系，所述处理为，采用常规基因工程方法或基于 CRISPR/Cas9系统，使得水稻中编码SEQ ID N0.1所示氨基酸的核苷酸序列发生缺失，变异 或抑制，进而使得所述氨基酸序列对应多肽的表达水平降低或者活性丧失。3. 如权利要求2所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征是，所述水稻品种为粳稻 品种9522。4. 如权利要求2所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征是，所述核苷酸序列如 SEQIDN0.2**。5. 如权利要求2所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，所述基于CRISPR/ Cas9系统具体包括:采用CRISPR/Cas9系统定点敲除0sDPW2基因，抑制编码如SEQ ID No. 1 所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达。6. 如权利要求5所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9 系统定点敲除的方法包括如下步骤： a) 合成单核苷酸序列引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示； b) 通过退火反应使合成的单核苷酸序列形成二聚体结构，与载体片段进行连接反应， 构建含有水稻0sDPW2基因靶序列的0sDPW2-BGK03质粒;所述靶序列如SEQ ID No. 5所示； c) 用含0sDPW2-BGK03质粒的根癌农杆菌侵染水稻品种； d) 通过利用如SEQIDNo.ll和SEQIDNo.l2所示的0sDPW2基因的特异性引物扩增基 因组片段进行测序，筛选突变植株。7. -种如权利要求2所述的水稻雄性不育株系创制的方法获得的水稻雄性不育株系在 水稻制种中的用途，其特征在于，所述用途包括：以所述水稻雄性不育株系作为母本，进行 杂交育种。8. -种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，包括如下步骤:采 用常规遗传手段将所述0sDPW2基因，转入如权利要求2所述方法获得的水稻雄性不育株系， 进而使得突变体恢复野生型表型。9. 如权利要求8所述的恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，包 括如下步骤:将含0sDPW2互补构建的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens )EHA105转 入所述水稻雄性不育株系，培育，即得;其中0sDPW2互补构建含有编码如SEQ ID NO.6所示 的核苷酸序列。10. 如权利要求9所述的恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于， 所述方法具体包括如下步骤： (a) 从野生型9522幼苗叶片中提取基因组DNA作为模板，用碱基序列如SEQ ID No.7和 SEQ ID No.8所示的引物扩增出0sDPW2基因的如SEQ ID NO.6所示的5997bp的基因组序列 片段； (b) 提供携带表达0sDPW2互补构建载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105； (c) 将水稻细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使编码如SEQ ID NO.1 所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上； (d) 选择转入所述核苷酸的水稻细胞或组织，再生，获得恢复育性的水稻植株。
【文档编号】C07K14/415GK106011167SQ201610362598
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】梁婉琪, 张大兵, 徐大伟, 袁政, 陈明姣, 罗治靖
【申请人】上海交通大学