水稻根系发育和叶色形成的控制基因OsERV1及编码的蛋白质的制作方法
【专利摘要】本发明公开了水稻根系发育和叶色形成的控制基因OsERV1及编码的蛋白质，该控制基因OsERV1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；我们研究表明OsERV1具有控制水稻根系发育，与侧根伸长、不定根数目及根系伸长有关，OsERV1具有控制水稻叶色形成，与叶片中叶绿素含量有关，可以为水稻的根系及叶色改良和杂交育种或转基因植物的开发创造条件。
【专利说明】
水稻根系发育和叶色形成的控制基因OsERVI及编码的蛋白质
技术领域
[0001]本发明涉及水稻根系发育和叶色形成相关的控制基因，具体涉及水稻根系发育和叶色形成的控制基因OsERVl及编码的蛋白质。
【背景技术】
[0002]水稻根系为须根系，一般由胚根、不定根和侧根组成，由于其庞大的侧根，极大的增加了水稻从外界吸收水分和矿物质的能力。调控水稻侧根的基因如授权公告号为CN102268081的发明专利，该专利就公开了水稻侧根的控制基因OsIAAII及编码的蛋白质，可培育出侧根控制功能较好的转基因水稻。申请号为CN2013103726010的发明则公开了水稻侧根发生控制基因OsHKl的突变体，也可选育出控制侧根发生和生长的转基因水稻。
[0003]叶片是植物进行光合作用和呼吸作用的主要器官。植物叶绿素的生物合成循环途径已经研究得非常清楚，整个过程需经19步、18个酶和对应的29个基因参与，相关的基因均已被克隆，叶绿素合成的调控和降解也取得了较大进展。根据叶绿素合成、调控和降解途径，以及外界温度、光等环境因子的综合影响，目前发现水稻的叶绿素、类胡萝卜素、血红素合成与降解过程相所涉及到的基因的突变，会导致叶色发生变化。如公告号为CN103114076的发明，就公开了水稻叶色控制基因H02，该基因使水稻具有适合的叶色，能提高光合作用。另外如水稻叶色控制基因LYLl的突变可使水稻叶色由绿转黄。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种水稻根系发育和叶色形成的控制基因OsERVl及编码的蛋白质，我们研究表明OsERVl具有控制水稻根系发育，与侧根伸长、不定根数目及根系伸长有关，O W K 2具有控制水稻叶色形成，与叶片中叶绿素含量有关。
[0005]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:水稻根系发育和叶色形成的控制基因OsERVl，该控制基因OsERVl的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其序列由3152个碱基组成，包含6个外显子和5个内含子，⑶S全长为585bp。
[0006]水稻根系发育和叶色形成的控制基因OsERVl所编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示，是一个巯基氧化酶，表现为与水稻根系发育和叶色形成有关。
[0007]如基因OsERVl起始密码子ATG后第20个碱基发生突变，从鸟嘌呤(G)突变成腺嘌呤(A)，形成终止密码子TAG，导致该基因翻译提前终止，这样所编码的蛋白就抑制根系发育与叶色形成，具体在植株表现为侧根突破表皮后，伸长受抑制，不定根数目减少且伸长受抑制，叶绿素降低至正常的三成左右，叶色变淡。
[0008]与现有技术相比，本发明的优点在于水稻根系发育和叶色形成的控制基因OsERVl及编码的蛋白质，该控制基因OsERVl的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示;我们研究表明OsERVl具有控制水稻根系发育，与侧根伸长、不定根数目及根系伸长有关，O si? W V I具有控制水稻叶色形成，与叶片中叶绿素含量有关，可以为水稻的根系及叶色改良和杂交育种或转基因植物的开发创造条件。
【附图说明】
[0009]图1是正常型籼稻(WT)和OsERVl突变体籼稻(起始密码子ATG后第20个碱基为A，Oservl)正常水培7天的水稻根系表型比较图，a为野生型和突变体全株系比较，b、c为WT水稻根茎结合部和侧根局部放大图，d、e为Oservl突变体水稻根茎结合部和侧根放大图。
【具体实施方式】
[0010]
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0011]实施例1
我们选取正常型籼稻(WT，0ryza Sativa L.ssp indica)品种和该籼稻经甲基磺酸乙酯诱变的籼稻中筛选到的OsERVl突变的水稻突变体Oservl，其中WT中控制基因OsERVl的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。Oservl中控制基因OsERVl的核苷酸序列在起始密码子ATG后第20个碱基发生突变，从鸟嘌呤(G)突变成腺嘌呤(A)，经培育得到种子。
[0012]实施例2
将上述选取的WT种子和Oservl种子发芽后漂浮于水稻培养液的尼龙网纱上同时培育7天，观察它们的根系和叶片，它们的根系比较如图1所示，从中可以看出WT的根系要比Oservl的根系发达，且侧根和不定根的长度也要长得多，说明基因OsERVl与根系发育有关。而它们的叶片同样明显，WT的叶片要比Oservl的叶片绿得多，0servl的叶片明显缺绿。
[0013]实施例3
水稻突变体O serW的基因定位和序列分析:以突变体Oser VI为父本，与野生型Kasalath杂交，获得子一代Fi植株与野生型Kasalath完全一致，说明Oservl为隐性突变;Fi代自花授粉所得的F2*，正常植株与短根植株的分离比为152/48=3.17，正常植株与突变植株的比例符合一对基因控制的3:1分离比，表明该突变体是隐性单基因突变体。从突变体OsERVl后代F2中分离出突变个体，利用基因图位克隆法(Map-based Cloning)对F2突变基因进行定位，初定位(30个？2突变个体)，将突变基因定位在第3条染色体SSR标记为RM6038和RM1022之间，之后，扩大定位群体，并在该区间内发展了5对有多态的新的STS分子标记，分别命名为STSl，STS2，STS3，STS4，STS5和序列如下:
STS1U-5， AGGATTGAGAAATGAATCAA 3，
STS1L-5’ GCATAATATGTAGGGCACC 3’
STS2U-5’ CCTTCCTTTTGGCATCCCAG 3’
STS2L-5’ CACAAGCTGCCTGTTGATTG 3’
STS3U-5’ CAGGTGTCGTCTCCGTCATC 3’
STS3L-5’ TACTGAACCGCAGAAGTTAC 3’
STS4U-5’ CAGTGAGCCCATTGGAAGAG 3’
STS4L-5’ GCTTATTGTACCATGAATGC 3’
STS5U-5’ TACTAAACAGTCTCATATAC 3’
STS5L-5， AAGTATAAATGAAGCACAC 3， 最终将基因锁定在STS标记为STS3和STS4(第3染色体上具体物理位置分别为5，544，833 bp和5，680，643bp)之间，重组子分别为1/500和1/500，且重组的号码不同。该区间有135.8kb 大小。根据 TIGR(http://www.tigr.0rg/tdb/e2kl/osal/)的水稻基因注释信息，对定位的染色体区段内基因预测分析，该区间共有22个预测的基因，用Kasalath野生型和Oservl突变体DNA模板对候选的其中15个有功能注释的基因进行扩增，扩增产物分别测序，测序结果进行比对分析，发现基因号为L0C_0s03gl0850(巯基氧化酶)基因的起始密码子ATG后第20个碱基发生突变，从G突变成A，形成终止密码子TAG，导致该基因翻译提前终止，命名该基因为OsERVl。
[0014]实施例4
根据OsERVl基因的CDS序列信息，设计扩增完整CDS的引物，引物序列如下(加下划线的为酶切位点):
上游引物:AAAGGTACCATGCCGCCTCCAGCGTGG
下游引物:AAAGGATCCTCATCTATTTGGGATGATGTCGTT
采用上海生工RNA提取试剂盒(SK1321)提取水稻kasalash叶片总RNA，以01igo(dt)-18为引物，以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。以此cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增全长0RF，PCR条件:98°C预变性10s，然后进入循环反应(980C 1s,580C 108，72°(:，308)，循环数为30，最后再延伸51^11结束。琼脂糖电泳割胶回收PCR产物，连A尾纯化并连接到pMD19-T载体。连接产物热击转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，37°C培养16h后挑阳性单克隆测序，测序鉴定序列无误后用KpnI和BamHI在37°C双酶切过夜，连入经同样双酶切的PCAMBIA1300改(35S)载体中，命名为35S-0sERVl-0VER。连接产物以相同的方法热击转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布在含有kan抗性的LB平板培养16h后挑取单克隆，摇菌抽提质粒双酶切并通过琼脂糖胶检测正确后电击转化农杆菌EHA105。酶切检测正确的质粒通过农杆菌株系EHA105介导的水稻遗传转化体系导入到突变体Oservl中，经过侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌(EHA105)介导的水稻遗传转化体系主要应用Hiei等人(1994)报道的方法基础上进行优化。该转基因植株中分离的Oservl突变体的根系长度回复成野生型，说明Oservl的表型确实是有OsERVl突变引起的。为了检测表型回复的转基因阳性植株是否超表达了OsERVl基因，采用Trizol法分别提取Kasalath、Oservl和2个转基因回复株系叶片的总RNA，逆转录成cDNA。半定量反应时，各样品的cDNA模板量先通过OsActin基因的表达量调成一致(扩增条件:56 °C，28个循环)，再扩增目的基因的上游引物序列(5 ’ -3 ’)为:ACACCATCGCAGCGCAGTT ；下游引物序列(5 ’ -3 ’)为:ATTCGGGATGATGTCGTTGGA。PCR反应条件为:94 °C预变性4min，然后进入循环反应即94°C，30s ; 56°C，30s; 72°C，30s，28个循环。最后再延伸5min结束。转基因回复验证结果= Kasalath和2个转基因回复株系叶色、不定根数、不定根长与侧根相当，确认突变性状是由O sfT? K 2基因的突变所引起。半定量RT-PCR结果:Kasalath和2个转基因回复株系叶片的叶绿素含量基本相当，Oservl叶片的叶绿素含量约只有3成左右。
【主权项】
1.水稻根系发育和叶色形成的控制基因OsERVl，其特征在于该控制基因OsERVl的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.权利要求1所述的水稻根系发育和叶色形成的控制基因OsERVl编码的蛋白质，其特征在于该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
【文档编号】C12N9/02GK106011156SQ201610533402
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】朱世华, 丁沃娜, 郑文娟, 项显波
【申请人】宁波大学