一种重金属转运蛋白基因及其应用方法
【专利摘要】本发明公开了一种重金属转运蛋白基因及其应用方法，本发明首次克隆了木本植物毛果杨的PtABCC1基因，并将其转入拟南芥中。通过镉胁迫拟南芥实验，证明了PtABCC1可以增加拟南芥对镉的抗性和富集。本发明为治理土壤重金属污染提供了新的思路。
【专利说明】
-种重金属转运蛋白基因及其应用方法
技术领域
[0001] 本发明设及生物修复技术，尤其是一种重金属转运蛋白基因及其应用方法。
【背景技术】
[0002] 前人研究表明，拟南芥的ABC转运蛋白家族中的ABCC类的转运蛋白ABCC1和ABCC2， 能将植物馨合肤馨合的重金属儒、隶运入液泡，从而减少其对植物细胞的毒害(Park J， Song WY,Ko D,et al.The phytochelatin transporters AtABCCland AtABCC2mediate tolerance to cadmium and mercury.Plant Journal,2012,69(2):278-288)。
[0003] 杨树对儒的富集的研究已经较多，但都还不深入。何佳丽等分析了灰杨，美洲黑 杨、欧美杨、84K杨、欧洲黑杨、群众杨六种杨树对儒胁迫的分子生理响应机制，发现运六种 杨树对儒都具有较高的耐受性与富集性化e J,Ma C,Ma Y,et al.Cadmium tolerance in six poplar species.Environmental Science and Pollution Research,2013,20(1): 163-174)。吴雁华等研究了京南地区±壤重金属污染特征与杨树修复效应，发现棉白杨对 ±壤中儒的吸附含量顺序为叶〉枝皮〉根皮〉根材〉茎皮〉枝材〉茎材(吴雁华.京南地区±壤 重金属污染特征与杨树修复效应[硕±学位论文].中国地质大学(北京），2005)。化im等将 酵母中的ScYCFl(yeast cadmium factor 1)基因转入到杨树（Populus a化a X Populus tr emu la var. g 1 andu 1 ο sa，BHl)中，使得转基因杨树中儒、锋、铅的积累量都有所提高 (Shim D,Kim S,Choi ΥΙ,et al.Transgenic poplar trees expressing yeast cadmium factor lexhibit the characteristics necessary for the phytoremediation of mine tailing soil.化emosphere,2013,90(4): 1478-1486)。胎等将细菌中的谷脫甘肤合 成酶在杨树(Popu lus tr emu la X P. al ba)中过表达，使得杨树对1 OOjiM的儒的抗性增强化e J,Li H,Ma C,et al.Overexpression of bacterial丫-glutamylcysteine synthetase mediates changes in cadmium influx,allocation and detoxification in poplar.化w Phytologist,2015,205(1):24〇-254)。
[0004] 生物修复技术中的植物修复技术，因其投资少，不需要大型设备，可长久有效的处 理污染±壤，容易进行后续处理等优点吸引了我们的关注。杨树是世界范围内种植最为广 泛的一种速生树木，具有一定的重金属富集能力。我们拟克隆杨树中负责重金属富集的相 关基因，并在拟南芥中验证其功能，培育出富集重金属能力更加强大的超富集植物材料，为 将来缓解±壤重金属污染提供新的思路。
[0005] 本发明提供了一种木本植物重金属转运蛋白基因及其应用方法。该基因可W增加 拟南芥对儒的抗性和富集，是首次将木本植物ABC转运蛋白基因应用于重金属污染修复。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了 一种重金属转运蛋白基因及其应用方法。
[0007] 生物修复技术中的植物修复技术，因其投资少，不需要大型设备，可长久有效的处 理污染±壤，容易进行后续处理等优点吸引了我们的关注。杨树是世界范围内种植最为广 泛的一种速生树木，具有一定的重金属富集能力。我们拟克隆杨树中负责重金属富集的相 关基因，并在拟南芥中验证其功能，培育出富集重金属能力更加强大的超富集植物材料，为 将来缓解±壤重金属污染提供新的思路。
[000引毛果杨（Populus t;richoca;rpa To;r;r.&Gray)PtABCCl基因的克隆方法。
[0009] A、通过Trizol法从毛果杨(P. trichoca巧a)的嫩叶中提取RNA，利用Takara公司的 逆转录试剂盒将其mRNA反转录成cDNA;
[0010] B、W该cDNA作为PCR模板，使用肥B公司Q5高保真酶，W及PtABCCl基因特异引物 PtABCCl_FP4:5 '-GATGGGATTTGAAGCATTGGA、PtABCCl_RP2:5 '-CTACATTTCAACATGGTTCCAG扩 增得到PtABCCl片段；
[0011] C、通过TA克隆方法将PtABCCl连入载体pCXSNeXcml酶切连接载体，会切除一条 670bp的小条带。然后将转化后得到的单菌落进行菌检，得到了阳性克隆PtAl-25与PtAl- 35。
[0012] 将重金属转运蛋白基因应用于植物中，培育出富集重金属能力更加强大的植物， 为缓解±壤重金属污染提供新的思路。
[0013] 将重金属转运蛋白基因应用于植物中，包括W下步骤：
[0014] a、将P巧SN-PtABCCl质粒载体通过浸花法转入植物中，得到T1代种子；
[0015] b、将T1代种子经过消毒铺于含有1/2MS潮霉素培养皿上，生长10天左右可W看到 阳性苗的生长；
[0016] C、将阳性植株苗移栽到±壤中生长，收获转PtABCCl的T2代种子，T2种子继续使用 潮霉素筛选，种植到±壤当中，收获T3代种子；
[0017] T3种子继续使用潮霉素筛选，种植到±壤当中，收获T4代种子，利用T4代种子是否 发生分离比来确定T3代种子的纯合与杂合，或继续下一代纯合体筛选。
[001引本发明的有益优点：
[0019] (1)本发明成功克隆了毛果杨PtABCCl基因，是首先在木本植物中克隆得到ABCC类 转运蛋白并应用到植物修复研究中。通过儒胁迫拟南芥的实验，证明了PtABCCl可W增加拟 南芥Atabccl突变体对儒的抗性、增强野生型拟南芥对儒的富集作用。
[0020] (2)首先尝试利用木本植物中的ABC转运蛋白基因对植物进行操作，培育具有重金 属超富集能力的植物，为治理上壤重金属污染提供了新的思路。
【附图说明】
[00別]图1:毛果杨RNA的提取(A)及PtABCCl的扩增(B)，M为Marker。
[0022] 图2:pCXSN质粒的Xcml酶切与BamHI与Hindlll酶切质粒pCXSN-PtABCCl的检测结 果。
[0023] 图3:拟南芥WT、PtABCCl-WT、Atabccl、PtABCCl-Atabccl在含有儒离子培养基中的 生长情况(标尺1.5cm)。
[0024] 图4:在含有儒的培养基中生长的不同拟南芥株系地上部分的儒含量。
【具体实施方式】
[0025] 下面列举实施例对本发明进行更为详细的说明，但本发明并不仅限于运些实施 例。
[00%]毛果杨（Populus t;richoca;rpa To;r;r.&Gray)PtABCCl基因的克隆方法。
[0027] 通过Trizol法从毛果杨(P. trichocarpa)的嫩叶中提取RNA，利用Takara公司的逆 转录试剂盒将其mRNA反转录成cDNA(图2A);W该cDNA作为PCR模板，使用N邸公司Q5高保真 酶，W及PtABCCl基因特异引物PtABCCl_FP4:5'-GATGGGATTTGAAGCATTGGA、PtABCCl_RP2: 5 ' -CTACATTTCAACATGGTTCCAG扩增得到PtABCCl片段，PCR方法与程序如下。
[002引
[0029] 反应条件如下:98°C，30s预变性;33循环:98°C，10s变性;Tm= 51.5°C，30s退火;72 °C延伸200s;最后72°C终延伸SmiruPCR产物W用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测质量。
[0030] 扩增片段的电泳显示，该基因片段大小约为化b，与预测的片段大小4875bp-致 (图1B)。图1A中是毛果杨RNA提取后电泳检测结果，其28S、18S、5s较为清晰明亮，其标量是 2000bp的DNA marker。如图1B中是PtABCCl的扩增结果，图中可W看到清晰明亮的5000bp左 右的条带，W及一条模糊的小条带，该短片段可能是非特异的扩增带。
[0031] 通过TA克隆方法将PtABCCl连入载体pCXSN(GenBank:FJ905214.1，ChenS等 2009)，连接载体使用Xcml进行酶切，会切除一条67化P的小条带（图2A)。然后将转化后得到 的单菌落进行菌检，得到了阳性克隆PtAl-25与PtAl-35。提取阳性克隆的质粒，使用BamHI 与化ndin内切酶分别进行酶切（图2B)，经过分析，如果基因连接正确，BamHI酶切后将产生 4280bp与59化P的条带，Hindlll酶切后将产生4248bp条带。
[0032] 图2中显示PtAl-25与PtAl-35运两个克隆的酶切片段与预测的一致，说明我们得 到了正确连接的克隆。
[0033] 测序工作由Life technologies测序部广州分公司完成，测序结果与氨基酸序列 如沈Q ID NO: 1所示。
[0034] Μ 为 Marker;PtAl-25为pCXSN-PtABCCl-25号克隆，PtAl-35为pCXSN-PtABCCl-35号 克隆。
[0035] 在拟南芥野生型与Atabccl突变体中进行毛果杨PtABCC基因的功能验证。
[0036] 将pCXSN-PtABCCl 质粒载体通过浸花法（Mart inez-Zapater J , Sal inas J.Arabidopsis protocols .Humana Press , 1998)转入野生型（WT)和Atabccl突变拟南芥 中，得到ΤΙ代种子分别命名为PtABCCl-WT和PtABCCl-A化bccl。将ΤΙ代种子经过消毒铺于含 有1/2MS潮霉素培养皿上，生长10天左右可W看到阳性苗的生长。阳性苗叶子较绿，有较长 根部，能看到明显的真叶。将阳性植株苗移栽到±壤中生长，收获转PtABCCl的Τ2代种子;Τ2 种子继续使用潮霉素筛选，种植到±壤当中，收获Τ3代种子;Τ3种子继续使用潮霉素筛选， 种植到±壤当中，收获Τ4代种子。利用Τ4代种子是否发生分离比来确定Τ3代种子的纯合与 杂合，或继续下一代纯合体筛选。
[0037] 分别将拟南芥株系机\?148〔(：1-^、41日6(3(31、？148〇：1-4化6(3(31分别种在含有04]\1、 40μΜ、60μΜ儒离子的1/2MS培养基中。结果显示如图3当拟南芥缺少了 AtABCCl后，植株对儒 离子敏感;当杨树PtABCCl在拟南芥Atabccl中过表达时，能提高植株对儒离子的耐受性。
[0038] 儒胁迫下1/2MS培养基中拟南芥的地上部分儒含量测定结果显示，随着儒浓度的 增高，拟南芥地上部分儒含量也增加，在40μΜΚ及eOiiM儒浓度下PtABCCl-WT地上部分儒的 积累都比WT植株显著增多。PtABCCl可W促进WT拟南芥对儒的吸收(图4)。
[0039] W上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明掲露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加 W等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种重金属转运蛋白基因，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. -种由权利要求1所述重金属转运蛋白基因编码的重金属转运蛋白，其特征在于，其 氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3. -种由权利要求1所述重金属转运蛋白基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步 骤： A、 通过Trizol法从毛果杨的嫩叶中提取RNA，利用Takara公司的逆转录试剂盒将其 mRNA反转录成cDNA; B、 以该cDNA作为PCR模板，使用NEB公司Q5高保真酶，以及PtABCCl基因特异引物 PtABCCl_FP4:5，-GATGGGATTTGAAGCATTGGA、PtABCCl_RP2:5，-CTACATTTCAACATGGTTCCAG扩 增得到PtABCCl片段； C、 通过TA克隆方法将PtABCCl连入载体pCXSN，pCXSN载体使用Xcml进行酶切，会切除一 条670bp的小条带，然后将转化后得到的单菌落进行菌检，得到了阳性克隆PtAl-25与PtAl-35〇4. 根据权利要求1所述的重金属转运蛋白基因在提高植物富集重金属能力中的应用。5. 根据权利要求1所述的重金属转运蛋白基因在提高拟南芥富集重金属能力中的应 用。6. -种如权利要求4所述的重金属转运蛋白基因应用的方法，其特征在于，包括以下步 骤： a、 将pCXSN-PtABCC1质粒载体通过浸花法转入植物中，得到T1代种子； b、 将T1代种子经过消毒铺于含有1/2MS潮霉素培养皿上，生长10天左右可以看到阳性 苗的生长； c、 将阳性植株苗移栽到土壤中生长，收获转PtABCCl的T2代种子，T2种子继续使用潮霉 素筛选，种植到土壤当中，收获T3代种子。7. 根据权利要求6所述的重金属转运蛋白基因的应用方法，其特征在于，T3种子继续使 用潮霉素筛选，种植到土壤当中，收获T4代种子，利用T4代种子是否发生分离比来确定T3代 种子的纯合与杂合，或继续下一代纯合体筛选。
【文档编号】C12N15/82GK106011151SQ201610624317
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月1日
【发明人】王邦俊, 马义峰, 孙丽萍, 韩二琴, 王晓珠, 韩丽, 孙万梅
【申请人】西南大学