ABC转运蛋白基因ABCH1及其特异性dsRNA在小菜蛾防治和Bt抗性治理中的应用
【专利说明】ABC转运蛋白基因ABCH1及其特异性dsRNA在小菜蛾防治 和Bt抗性治理中的应用
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技术领域
[0002] 本发明属于生物技术领域，具体涉及小菜蛾ABC转运蛋白基因及其特异性dsRNA 在害虫防治和Bt抗性治理中的应用。
【背景技术】
[0003] 农业害虫每年都在世界范围内严重危害农作物并引起巨大的经济损失。农业害 虫的防治长期依赖化学杀虫剂，然而，化学杀虫剂的长期使用影响了非靶标生物的存活并 导致了害虫抗药性、环境污染等一系列问题严重危害人类身体健康。虽然已有生物杀虫剂 如苏云金芽孢杆菌（AaciBy1S 简称Bt)等被应用于害虫防治中，但是其作 用时间通常比较长且杀虫效果缓慢，推广面积较小。目前，Bt转基因抗虫作物（Bt作物）被 认为是替代化学农药防治害虫的首选方法，且其2013年在世界范围内的推广面积已超过 7500万公顷（James, 2013)。然而，最近田间检测结果显示多种害虫已对Bt作物产生了抗 性（Tabashniketal.，2011;Tabashniketal.，2013)。因此，随着社会的不断发展，人 们迫切需要更新型的害虫防治方法来结合或替代Bt作物实现现代农业的可持续发展。
[0004]RNA干扰（RNAinterference,简称RNAi)是一种由双链RNA(double-stranded RNA，简称dsRNA)分子引起的转录后水平特异性基因沉默现象。RNA干扰发现后迅速成为 了 21世纪以来的十大热门科技之一并极大地促进了生物基因功能的研究，因此，该技术于 2006年获得了诺贝尔生理及医学奖。令人兴奋地是，NatureBiotechnology杂志在2007 年先后发表两篇著名的SCI论文表明可以利用转基因技术表达靶标害虫致死基因的dsRNA 来控制害虫，从而开辟了利用RNA干扰技术防治田间害虫的新方法（Baumetal.，2007; Maoetal.，2007)。随后，在2008年，Price和Gatehouse提出了基于RNAi的害虫防治方 法并讨论了该方法的优势：（1)特异性干扰害虫专一基因，对高等动物和人类安全；(2)杀 虫具有专一性，对非靶标生物安全；（3)对环境无毒无害。目前，基于RNA干扰的害虫防治 研究领域发展非常迅速，给现代农业生产带来了新的科技革命的希望。然而，尽管基于RNA 干扰的害虫防治新方法具有很大优势，实现基于RNA干扰的害虫有效治理的关键是筛选出 合适的对害虫高效致死的靶标基因。
[0005]昆虫的ABC转运蛋白（ATP-bindingcassettetransporter,简称ABC transporter)基因超家族共包括ABCA-ABCH这8个亚家族，每个亚家族又包括多个基因， 不同亚家族的基因具有不同的生物学功能。其中，ABCH亚家族是一个比较特殊的ABC转运 蛋白亚家族，它只存在于无脊椎动物和脊椎动物硬骨鱼类中，高等动物和人类中没有该ABC 转运蛋白亚家族的基因。ABCHl基因是ABCH亚家族中的一个基因，它可以参与昆虫的脂质 转运等重要的生物学过程，本研究发现昆虫缺失该基因的表达后表现为明显的致死表型。 由于高等动物和人类中并没有该ABC转运蛋白基因，故对该基因进行RNA干扰是非常安全 的。由于该基因编码蛋白的跨膜结构域部分在不同昆虫中分化较大，因此可以在该区域设 计特异性的dsRNA进行专一的害虫防治而不影响其他非靶标昆虫。更重要的是，我们研究 发现该基因与昆虫Bt抗性无关，在BtCrylAc杀虫蛋白抗性昆虫中对该基因进行RNA干扰 后同样表现出明显的致死表型，这表明该基因可以同时用于昆虫防治和Bt抗性治理。
[0006] 因此，以害虫关键生理功能基因ABCHl作为基于RNA干扰的害虫防治和Bt抗性治 理的分子靶标，通过转基因技术抑制靶标害虫该基因表达的害虫防治新策略具有明显的商 业价值和应用前景。
【发明内容】
[0007] 针对以上现有化学防治技术存在的各种问题，本发明的目的是提供一种昆虫ABC 转运蛋白基因ABCHl的序列及其dsRNA在防治小菜蛾和治理小菜蛾Bt抗性中的应用，相对 于传统的化学防治技术，该技术具有高效低毒、安全可靠的优点。
[0008] 本发明提供一种昆虫ABC转运蛋白基因ABCH1，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所 示。该序列是在小菜蛾中肠转录组中搜索找到的一个基因片段的基础上，通过cDNA末端 快速扩增（rapidamplificationofcDNAends,简称RACE)技术进一步克隆得到的全长 cDNA序列。该cDNA序列全长3556bp，其中开放阅读框（openreadingframe,简称0RF)为 2313bp，编码含有770个氨基酸的蛋白，该蛋白序列如SEQIDNO. 2所示，此外，其5'-UTR (untranslatedregion,简称UTR)为llObp，3'-UTR为 1133bp。
[0009] 本发明还提供一种昆虫ABC转运蛋白基因ABCHl的基因片段，其核苷酸序列如SEQ IDNO. 3所示，是根据SEQIDNO. 1的氨基酸序列SEQIDNO. 2分析得到的特有跨膜结构 域（transmembranedomain,简称TMD)，设计出含有23-bp的17启动子的特异性正向引物 SEQIDNO. 4和反向引物SEQIDNO. 5进行PCR扩增，然后将得到的PCR产物纯化后进一步 使用T7Ribomax?ExpressRNAiSystem(Promega,Madison,WI,USA)试剂盒并按照其 说明书经体外反转录合成的。
[0010] 本发明还提供一种dsRNA(由SEQ ID NO. 3合成）在致死Bt CrylAc敏感和抗性 小菜蛾中的应用：显微注射该dsRNA到小菜蛾3龄初幼虫体腔中，结果显示，该dsRNA可以 特异性地沉默小菜蛾ABC转运蛋白基因ABCHl的mRNA表达，并导致小菜蛾在幼虫期和随后 的蛹期死亡。由此可见，该dsRNA可以同时用于小菜蛾的防治和Bt抗性治理。
[0011] 本研究通过注射发现害虫关键生理功能基因ABCHl的特异性dsRNA可以致死Bt 敏感和抗性的害虫，从而证明ABCHl的特异性dsRNA可以作为基于RNA干扰的害虫防治和 Bt抗性治理的分子靶标。可以通过转基因技术转入该害虫关键生理功能基因ABCHl的特异 性dsRNA来抑制靶标害虫该基因的表达并致死靶标害虫，从而达到田间害虫治理的目的。 因此，基于害虫关键生理功能基因ABCHl的转基因RNA干扰技术是一种害虫防治新策略，它 具有明显的商业价值和应用前景。总结来说，本发明具有以下有益效果如下， (1)特异性干扰害虫专一基因，对高等动物和人类安全；(2)杀虫具有专一性，对非靶 标生物安全；（3)对环境无毒无害。因此，本发明相对于传统的害虫防治方法具有明显的技 术优势。
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【附图说明】
[0013] 图1 :为小菜蛾ABC转运蛋白基因ABCHl功能结构域分布示意图。长方形表示该 基因的跨物种保守的核酸结合结构域（nucleotide-bindingdomain,简称NBD)，坚条长方 形表示该基因的物种特有的跨膜结构域（transmembranedomain,简称TMD)中的6个跨膜 区。本研究中设计的ABCHl基因特异性dsRNA区域已标出。
[0014] 图2 :小菜蛾BtCrylAc敏感种群DBMlAc-S和小菜蛾CrylAc抗性近等基因系种 群NIL-R的4龄幼虫中肠的ABCHl基因mRNA的表达量检测，用L32基因作为内参基因，相 同字母表不无显著性差异（P> 0.05;Holm-Sidak'stest;n= 3)。
[0015] 图3 : (A)小菜蛾BtCrylAc敏感种群DBMlAc-S的3龄初幼虫显微注射SEQID NO. 3合成的dsRNA后，在0 - 120h内每隔24h检测一次ABCHl基因的mRNA表达量情况，用 L32基因作为内参基因；(B)注射dsRNA后0-120h内每隔24h统计一次小菜蛾幼虫的死亡 率情况。注射Bu