改进的等位基因特异性扩增的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是W下申请的分案申请：申请日：2009年10月17日；【申请号】 200980141303. 2 ;发明名称：同上。
技术领域
[0002] 本申请设及改进的等位基因特异性扩增。
【背景技术】
[0003] 核酸的等位基因特异性扩增允许祀序列的同步扩增和分析。当怀疑祀核酸在其序 列中具有一个或多个具有变异(多态性)的亚群时通常使用等位基因特异性扩增。dm多态 性用于DNA序型（profile)分析(法医取证、亲子鉴定、用于器官移植的组织分型)，遗传作 图，W及稀有突变的检测，例如在具有正常DNA的细胞背景下在癌细胞中发生的那些稀有 突变。
[0004] 在成功的等位基因特异性扩增中，期望的祀核酸变体得到扩增，而其他变体不扩 增，至少不扩增至可检测的水平。通常的等位基因特异性扩增测定包括聚合酶链式反应 (PCR)，其中至少一种引物与具有可疑多态性的区域互补。等位基因特异性引物的设计成如 此W使仅在存在多态性的特定变体时才发生引物延伸。最简单形式的等位基因特异性引物 具有与祀中的多态核巧酸期望变体互补的3' -端核巧酸。通常在引物3' -端的单个错配 就足够阻止祀序列的非期望变体的扩增。然而，扩增的特异性在不同的3' -端序列中变化 很大：一些错配有效地阻止聚合酶的延伸，而其他不能，见美国专利号5, 639, 611。
[000引等位基因鉴别的成功取决于DNA聚合酶延伸错配引物的无能性（in油ility)。DNA聚合酶的此无能性可通过调整反应条件来调节W获得最大选择性。然而，对许多多态序列， 等位基因特异性PCR的低选择性仍然是个问题。
[0006] 增加特异性的一种方法包括设计具有内部错配核巧酸或多个核巧酸的扩增引物。 此方法在一些系统中被证明是成功的，见美国专利号5, 137, 806。
[0007] 增加特异性的另一种方法包括引物的化学修饰。例如，发现引物中一些核巧酸 的脱氧核糖的特定2'-C和4'-C修饰提高了聚合酶的等位基因鉴别，见Gaster,J.和 Marx,A.，Chem.化r.J. 2005，11:1861-1870。在另一个研究中，发现通过在引物的 一个核巧酸中使用非天然喀晚碱基，特别是在喀晚环的6-位具有不同取代的假异胞喀晚 (pseudoiso巧tidine)，提高了等位基因的鉴别，见美国专利号7, 408, 051。
[0008] 在实时等位基因特异性PCR的情况下，可通过匹配和错配模板间阔值循环数（Ct) 的差异来测量测定的选择性。更大的差异指示错配模板扩增的更大延迟，从而更好的鉴别 等位基因。修饰的脱氧核糖已显示导致1至14个循环之间的Ct差异。假异胞喀晚的使用 导致错配模板扩增的7个循环的延迟。此程度的鉴别对许多应用是不足的，在运些应用中 样品包含几种均竞争扩增的模板变体。错配模板通常W比匹配模板多许多的量存在。例如， 在组织样品中，仅小部分的细胞可能是恶性的并携带等位基因特异性扩增测定祀向的突变 ("匹配模板")。正常细胞中存在的模板可能被较低效的扩增，但是正常细胞的压倒性数量 将克服在扩增中的任何延迟并清除突变模板的任何优势。为了检测在野生型模板存在下的 稀有突变，需要改进等位基因特异性扩增测定的特异性。
【发明内容】
[0009] 在第一个方面，本发明设及等位基因特异性扩增的改进方法，其中在等位基因特 异性引物或多个引物中的一个或多个核巧酸通过修饰基团和核碱基环外氨基的共价连接 来修饰。修饰可发生在引物内部或3' -末端，或二者均有。
[0010] 在第二个方面，本发明设及W几种变体序列形式存在的祀序列变体的等位基因特 异性扩增的方法，所述方法包括： (a) 提供样品，其可能含有祀序列的至少一种变体； (b) 提供第一种寡核巧酸，其与祀序列的一种或多种变体至少部分互补； (C)提供第二种寡核巧酸，其与祀序列的一种或多种变体至少部分互补，并具有至少一 个与祀序列的仅一种变体互补的3' -端核巧酸；其中所述第二种寡核巧酸参入至少一个具 有在环外氨基被共价修饰的碱基的核巧酸； (d) 提供适于所述第一种和第二种寡核巧酸与祀序列的至少一种变体杂交的条件；和 (e) 提供适于第二种寡核巧酸通过核巧酸参入生物催化剂延伸的条件；其中当所述第 二种寡核巧酸和与其具有的所述3' -端核巧酸互补的祀序列变体杂交时，所述生物催化剂 能够延伸所述第二种寡核巧酸，当所述第二种寡核巧酸和与其具有的3' -端核巧酸不互补 的祀序列变体杂交时，所述延伸大大降低。
[0011] 在第=个方面，本发明设及检测样品中W几种变体序列形式存在的祀序列变体的 方法，所述方法包括： (a) 将第一种和第二种寡核巧酸与祀序列的至少一种变体杂交；其中第一种寡核巧酸 与祀序列的一种或多种变体至少部分互补，第二种寡核巧酸与祀序列的一种或多种变体至 少部分互补并具有与祀序列的仅一种变体互补的3' -端核巧酸，所述第二种寡核巧酸参入 至少一个具有在环外氨基被共价修饰的碱基的核巧酸； (b) 使用核巧酸参入生物催化剂延伸第二种寡核巧酸；其中所述生物催化剂能够可检 测地延伸仅与祀序列变体杂交的寡核巧酸，所述寡核巧酸具有与所述祀序列变体所述互补 的3' -端核巧酸讯 (C)检测所述第二种寡核巧酸延伸的产物，其中延伸表示下述祀序列变体的存在，即所 述寡核巧酸具有与之互补的3' -端核巧酸。
[0012] 在第四个方面，本发明设及用于W几种变体序列形式存在的祀序列的等位基因特 异性扩增的试剂盒，其包含 (a) 第一种寡核巧酸，其至少与祀序列的一种或多种变体部分互补；和 (b) 第二种寡核巧酸，其至少与祀序列的一种或多种变体部分互补并具有与祀序列的 仅一种变体互补的3' -端核巧酸；其中所述第二种寡核巧酸参入至少一个具有在环外氨基 被共价修饰的碱基的核巧酸。
[0013] 在第五个方面，本发明设及用于进行W几种变体序列形式存在的祀序列的等位基 因特异性扩增的寡核巧酸，其包含： -与所述祀序列的一种或多种变体的一部分至少部分互补的序列； -与所述祀序列的仅一种变体互补的3' -端核巧酸和 -至少一个具有在环外氨基被共价修饰的碱基的核巧酸。
【附图说明】
[0014]图1为本发明的等位基因特异性扩增测定的示意图。
[0015] 图2显示了使用具有内部碱基修饰的引物的等位基因特异性扩增结果。
[0016]图3显示了使用具有一个或多个内部和3'-端碱基修饰的引物的等位基因特异性 扩增结果。
[0017] 图4显示了使用具有碱基修饰的引物和不同DNA聚合酶的等位基因特异性扩增结 果。
[0018]图5显示了在过量错配模板存在下使用碱基修饰引物的等位基因特异性扩增结 果。
[0019] 图6显示了在本发明含义内的蜗型或类蜗型探针-引物形式的实例。
[0020] 图7显示了根据本发明可使用的蜗型ARMS形式结构的图示。
【具体实施方式】
[0021] 定义 除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与此发明所属领域普通技术人员通常 理解的具有相同的含义。在描述和要求保护本发明中将使用W下定义。
[0022] 术语"核酸"指核巧酸(例如核糖核巧酸、脱氧核糖核巧酸、核巧酸类似物等等）的 聚合物，包含脱氧核糖核酸（DNA)、核糖核酸（RNA)、DNA-RNA杂交物、寡核巧酸、多核巧酸、 适配体、肤核酸（PNA)、PNA-DNA缀合物、PNA-RNA缀合物等等，上述分子包含W线性或分支 方式共价连接在一起的核巧酸。核酸通常是单链或双链的，通常包含憐酸二醋键，虽然在一 些情况下包括可具有交替骨架的核酸类似物，所述交替骨架包括例如憐酷胺度eaucage等 人（1993)Tetr址e化on49 (10): 1925);硫代憐酸醋（Mag等人（1991)NucleicAcids Res. 19:1437;和美国专利号5, 644, 048)，二硫代憐酸醋度riu等人（1989)J.Am. Qiem.Soc. 111:2321), 〇-甲基亚憐酷胺连接（见Eckstein,Oligonucleotidesand Analogues:APracticalApproach,OxfordUniversityPress(1992)),及肤核酸骨 架和连接（见，E曲olm(1992)J.Am.Chem.Soc. 114:1895)。其他类似物核酸包括具 有正电荷骨架值e吨cy等人（1995)Proc.化tl.Acad.Sci.USA92: 6097);非离子骨 架（美国专利号 5, 386, 023，5, 637, 684，5, 602, 240，5, 216, 141 和 4, 469, 863)和非核糖 骨架(包括在美国专利号5, 235, 033和5, 034, 506中描述的）的类似物核酸。在核酸定义 中也包括含有一个或多个碳环糖的核酸（见Jenkins等人（1995)化em.Soc.Rev.PP. 169-176)，在例如Rawls,C&ENews化n. 2，1997第35页中也描述了类似物。可进行 核糖-憐酸骨架的运些修饰W便于加入另外的部分例如标记物，或改变运些分子在生理环 境下的稳定性和半衰期。
[002引除了在核酸中通常可见的天然存在杂环碱基(例如腺嚷岭、鸟嚷岭、胸腺喀晚、胞 喀晚和尿喀晚）外，核巧酸类似物还可包括非天然存在的杂环碱基，例如在例如Seela等 人（1999)Helv.化im.Acta82:1640中描述的那些。在核巧酸类似物中使用特定碱基 作为解链溫度（Tm)修饰剂。例如，运些碱基中的一些包括7-脱氮嚷岭(例如，7-脱氮鸟嚷 岭，7-脱氮腺嚷岭，等等)，化挫并巧，4-d]喀晚，丙烘基-dN(例如，丙烘基-加，丙烘基-dC 等等)等等。见例如美国专利号5, 990, 303,在此引入作为参考。其他代表性杂环碱基包括 例如次黄嚷岭、次黄巧、黄嚷岭；2-氨基嚷岭、2, 6-二氨基嚷岭、2-氨基-6-氯嚷岭、次黄嚷 岭、次黄巧、黄嚷岭的8-氮杂衍生物；腺嚷岭、鸟嚷岭、2-氨基嚷岭、2, 6-二氨基嚷岭、2-氨 基-6-氯嚷岭、次黄嚷岭、次黄巧、黄嚷岭的7-脱氮-8-氮杂衍生物；6-氮杂胞喀晚；5-氣 胞喀晚；5-氯胞喀晚；5-舰胞喀晚；5-漠胞喀晚；5-甲基胞喀晚；5-丙烘基胞喀晚；5-漠 乙締基尿喀晚；5-氣尿喀晚；5-氯尿喀晚；5-舰尿喀晚；5-漠尿喀晚；5-=氣甲基尿喀晚； 5-甲氧基甲基尿喀晚；5-乙烘基尿喀晚；5-丙烘基尿喀晚等等。
[0024]"核巧"指核酸的成分，所述成分包含与糖部分(核糖或脱氧核糖)、糖部分的衍生 物或糖部分的功能等价物(例如碳环）共价连接的碱基或碱基基团(包含至少一个同素环、 至少一个杂环、至少一个芳基和/或类似物)。例如，当核巧包括糖部分时，碱基通常与该糖 部分的r位连接。如上所述，碱基可为天然存在的碱基或非天然存在的碱基。示例性核巧 包括核糖核巧、脱氧核糖核巧、双脱氧核糖核巧和碳环核巧。
[002引"核巧酸"指核