一种杂色蛤物种实时荧光pcr特异性检测体系及应用
【专利说明】-种杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系及应用
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体 系及应用。
【背景技术】
[0003] 杂色蛤是贝壳类海产品，隶属帘蛤科，学名菲律宾蛤仔，南方俗称花蛤，辽宁称蚬 子，山东称蛤蜊。杂色蛤广泛分布在我国南北海区，它生长迅速，养殖周期短，适应性强(广 温、广盐、广分布)，离水存活时间长，是一种适合于人工高密度养殖的优良贝类，是我国主 要海产经济贝类之一。通过形态学特征进行判断是对杂色蛤识别的传统方法，但是这些形 态学特征的可塑性强，受环境影响大，具有人为的主观倾向性，且存在丰富的近缘物种，近 缘种间的形态差异细微，所以传统的形态学特征识别方法存在识别困难与识别错误的问 题。
[0004] 快速进化并呈母系遗传的线粒体DNA是种群遗传学和进化遗传学的理想研宄对 象。杂色蛤与其它近源物种的序列相似度在85-94%之间，而CoxI基因序列有较大差异， 目前，贝类动物的分子检测主要集中于这一序列。采用DNA技术鉴定动物物种是物种识别 方法中最为热门也是发展最快的分子技术。实时荧光PCR是DNA技术鉴定中快捷高效的技 术之一，指在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR)循环后产物总 量的方法，研宄利用实时荧光PCR对杂色蛤进行物种识别对杂色蛤的物种保护及系统发育 研宄等领域均具有重大意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种杂色蛤物种特异性检测体系及该特 异性检测体系的应用方法。本发明可以检测出来自动物样品的微量DNA，完全区分杂色蛤的 基因与其它贝类动物基因，检测灵敏度高，方法快速，易操作。
[0006] 本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种杂色蛤物种实时荧光PCR特异 性检测体系，其特征在于：包括引物与探针的序列是： 上游引物：5' -ggttgaacagtctaccctcc-3' ； 下游引物：5' -gctaacatactactacgcaaaa_3' ； 探针：5> -tctcttcacgtaggtggtgtctcttcaatt_3,〇
[0007] 进一步地，所述探针的5'端标记FAM荧光基团，3'端标记荧光淬灭基团。
[0008] 进一步地，所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系还包括由其他试剂所组 成的反应体系如下表1 : 表1杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应体系
[0009] 进一步地，所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数如下表2 : 表2杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数
[0010] 一种根据所述的杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的应用，其特征在于： 利用所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系对杂色蛤物种进行实时荧光PCR特异性 检测。
[0011] 进一步地，所述杂色蛤物种进行实时荧光PCR特异性检测方法为：采用杂色蛤 物种实时荧光PCR特异性检测组合物进行实时荧光PCR扩增杂色蛤的CoxI基因，以 HotstartTaqDNA聚合酶进行PCR反应，当DNA链延伸到杂色蛤物种特异性检测探针位置 时，以HotstartTaqDNA聚合酶的5'端外切酶活性切断杂色蛤物种特异性检测探针的淬 灭基团，使杂色蛤物种特异性检测探针发出荧光信号，经信号收集处理，获得特异性扩增曲 线。
[0012] 本发明特异性引物设计合理，用于杂色蛤物种检测，特异性好，检测灵敏度高。采 用本方法检测杂色蛤动物成分结果显示，采用杂色蛤物种特异性检测引物与探针进行实时 荧光PCR扩增杂色蛤的CoxI基因，会产生一条特异性扩增曲线，即经过实时荧光PCR分 析，即可将杂色蛤成分进行准确鉴定，具有很好的特异性。
【附图说明】
[0013] 图1为5种引物PCR结果图，图中：M、DL2000marker;1、P1P2引物扩增结果，2、P3P4 引物扩增结果，3、P5P6引物扩增结果，4、P7P8引物扩增结果，5、P9P10引物扩增结果，6、阴 性对照，7、空白对照。
[0014] 图2为杂色蛤实时荧光PCR特异性检测结果图，图中：1、杂色蛤，2、杂色蛤，3、阴性 对照，4、空白对照。 图3为杂色蛤与其他海洋动物的实时荧光PCR特异性检测结果图，图中：1、杂色蛤， 2、杂色蛤，3、杂色蛤，4、夏夷扇贝，5、紫海胆，6、太平洋牡蛎，7、魁蚶，8、阴性对照，9、空白对 照。
[0015] 图4为灵敏度分析结果图，图中：1、5ng/yL扩增结果；2、lng/yL扩增结果；3、 0. 5ng/yL扩增结果；4、0.lng/yL扩增结果；5、0. 05ng/yL扩增结果；6、阴性对照；7、空 白对照。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不局限于具体实施 例。
[0017] 本实施例中所利用的杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系包括引物与探针 的序列是： 5' -ggttgaacagtctaccctcc-3'（上游）； 5' -gctaacatactactacgcaaaa-3'（下游）； 5' -tctcttcacgtaggtggtgtctcttcaatt-3'（探针）。
[0018] 所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系还包括由其他试剂所组成的反应 体系如下表3 : 表3杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应体系
[0019] 所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数如下表4 : 表4杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数
[0020] 一种所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的应用，即利用所述杂色蛤物 种实时荧光PCR特异性检测体系对杂色蛤物种进行实时荧光PCR特异性检测，具体步骤如 下： 1.杂色蛤物种特异性检测引物合成：在宝生物公司合成杂色蛤物种特异性检测引物5对，其序列(见表5): 表5. PCR扩增杂色蛤的Cox