I基因的引物序列：
琼脂糖凝胶电泳检测：以 P1P2，P3P4、P5P6、P7P8、P9P10等5对特异性引物PCR扩增杂色蛤的CoxI基因后，以 2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示(如图1所示)，经琼脂糖凝胶电泳检测后会分别产 生182bp、178bp、180bp、212bp、269bp大小的特异性电泳条带。以P1P2作为上下游引物进 行特异性PCR扩增，电泳效果最好，PCR扩增效率最高，因此选取P1P2作为扩增体系的特异 性扩增引物(如图1所示)。
[0021] 2.杂色蛤物种特异性检测探针合成：在宝生物公司合成杂色蛤物种特异性检测 探针，其序列是： _tctcttcacgtaggtggtgtctcttcaatt_3,〇
[0022] 3.杂色蛤DNA的提取：采用DNA提取试剂盒(购于宝生物公司）提取杂色蛤模板 DNA，用微量分光光度计检测提取杂色蛤模板DNA的浓度为100ng。
[0023] 4.实时荧光PCR扩增杂色蛤的CoxI基因：配制杂色蛤物种实时荧光PCR特异性 检测体系的25yLPCR反应体系(如上表3)，设置杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系 的反应参数(如上表4 )。
[0024] 采用杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测组合物进行实时荧光PCR扩增杂色蛤的 Cox I基因时，以Hotstart Taq DNA聚合酶进行PCR反应，当DNA链延伸到杂色蛤物种特异 性检测探针位置时，以Hotstart Taq DNA聚合酶的5'端外切酶活性切断杂色蛤物种特异 性检测探针的淬灭基团，使杂色蛤物种特异性检测探针发出荧光信号，经信号收集处理，获 得特异性扩增曲线(如图2所示)。
[0025] 利用所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系进行杂色蛤的物种成分实时 荧光PCR特异性检测杂色蛤、夏夷扇贝、紫海胆、太平洋牡蛎、魁蚶等样品，采用DNA提取试 剂盒提取各待测样品的模板DNA，用微量分光光度计分别检测所提取的模板DNA的浓度为 lOOng，分别按照上述步骤4中所述反应体系及反应参数进行PCR扩增，产生的特异性扩增 曲线即为杂色蛤，此方法可以准确的对杂色蛤的成分进行鉴定，具有很好的特异性(如图3 所示)。
[0026] 采用DNA提取试剂盒提取各待测样品的模板DNA，用微量分光光度计分别检测 所提取的模板DNA梯度稀释，制备成5ng/yL、lng/yL、0.5ng/yL、0.1ng/yL、 0. 05ng/yL5个浓度梯度样品，分别按照上述步骤3中所述反应体系及反应参数进行实时 荧光PCR扩增，以确定本标准方法的检测灵敏度，结果如图4所示，所产生特异性扩增曲线 即为杂色蛤，当DNA浓度多0.Ing/yL时均可以特异扩增，即该标准方法的检测灵敏度为 0.1 ng/yL。此方法可以准确的对杂色蛤的成分进行鉴定，具有很好的灵敏度。
[0027] 以上内容是结合优选技术方案对本发明所做的进一步详细说明，不能认定发明的 具体实施仅限于这些说明。对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明 的构思的前提下，还可以做出简单的推演及替换，都应当视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系，其特征在于：包括引物与探针的序 列是： 上游引物：5' -ggttgaacagtctaccctcc-3' ； 下游引物：5' -gctaacatactactacgcaaaa_3' ； 探针：5> -Ixtcttcacgtaggtggtgtctcttcaatt-Sj02. 根据权利要求1所述的一种杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系，其特征在于： 所述探针的5'端标记FAM荧光基团，3'端标记荧光淬灭基团。3. 根据权利要求1所述的一种杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系，其特征在于： 所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系还包括由其他试剂所组成的反应体系如下 表1 : 表1杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应体系4. 根据权利要求1至3任一所述的一种杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系，其 特征在于：所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数如下表2 : 表2杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的反应参数5. -种根据权利要求1至3任一所述的杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的应 用，其特征在于：利用所述杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系对杂色蛤物种进行实 时荧光PCR特异性检测。6. 根据权利要求5所述的一种杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系的应用，其特 征在于：所述杂色蛤物种进行实时荧光PCR特异性检测方法为：采用杂色蛤物种实时荧光 PCR特异性检测体系进行实时荧光PCR扩增杂色蛤的CoxI基因，以HotstartTaqDNA聚 合酶进行PCR反应，当DNA链延伸到杂色蛤物种特异性检测探针位置时，以HotstartTaq DNA聚合酶的5'端外切酶活性切断杂色蛤物种特异性检测探针的淬灭基团，使杂色蛤物种 特异性检测探针发出荧光信号，经信号收集处理，获得特异性扩增曲线。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，特别涉及一种杂色蛤物种实时荧光PCR特异性检测体系及应用。引物及探针序列：5’-ggttgaacagtctaccctcc-3’（上游）；5’-gctaacatactactacgcaaaa-3’（下游）：5’-tctcttcacgtaggtggtgtctcttcaatt-3’（探针）。采用杂色蛤物种特异性检测引物与探针进行实时荧光PCR扩增杂色蛤的CoxⅠ基因，实时荧光PCR扩增后会产生一条特异性扩增曲线，从而将杂色蛤成分进行特异性鉴定。本发明特异性引物、探针设计合理，用于杂色蛤物种检测，特异性好，检测灵敏度高，即经过荧光PCR分析，即可将杂色蛤成分进行准确鉴定，具有很好的特异性。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104962660
【申请号】CN201510473143
【发明人】刘淑艳, 万超, 孙晓飞, 丁健
【申请人】刘淑艳, 万超, 孙晓飞, 丁健
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年8月5日