一种基于磁珠法纯化非特异性扩增pcr产物的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于磁珠法纯化非特异性扩增PCR产物的方法。
【背景技术】
[0002]聚合酶链反应，简称PCR。聚合酶链反应是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研宄，还可用于疾病的诊断或任何有DNA，RNA的地方。聚合酶链反应又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
[0003]PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因:一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体；二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数；适当提高退火温度或采用二温度点法(93°C变性，65°C左右退火与延伸)。
[0004]然而有时改变扩增条件，PCR产物中仍存在非特异性扩增条带。同时因为PCR反应体系中含有dNTP、Mg2+、DNA聚合酶等物质，这些物质会对下游的实验产生影响，因此需要对获得的非特异性扩增PCR产物进行进一步的纯化。目前常用的非特异性扩增PCR产物的回收方法基本上都是吸附柱回收法。利用磁珠法来纯化非特异性扩增PCR产物的方法目前未见报道。磁珠法纯化DNA主要是利用交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和其他杂质分离。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种简单、快速的基于磁珠法纯化非特异性扩增PCR产物的方法。
[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0007]一种基于磁珠法纯化非特异性扩增PCR产物的方法，包括以下步骤:
[0008]I)通过琼脂糖凝胶检测PCR产物，当观察到非特异性条带与目的性条带分开时，用干净的小刀将目的条带切下，放入离心管中，然后在离心管中加入工作液A，所述目的条带与工作液A的重量比为1:3，然后于50-70°C温育8-15min ；
[0009]2)加入与上述离心管中的溶液等体积的工作液B，震荡10-30s，室温放置1-1Omin后，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠；
[0010]3)往上述含有磁珠的离心管中加入0.5-1.5ml工作液C，打匀后室温静置5-10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠；
[0011]4)往上述含有磁珠的离心管中加入30-60 μ I工作液D，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸取溶液，此溶液即为回收后的PCR产物，后续于1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测；
[0012]所述工作液A由终浓度4-8mol/L NaClOjP终浓度0.01-0.lmol/L NaAc组成，pH=5-6 ；
[0013]所述工作液B由异丙醇和磁珠混悬液按照体积比24:1混合配制而成，其中，所述磁珠混悬液由磁珠和水按照体积比1:2混合配置而成；
[0014]所述工作液C由终浓度4.3-21.4mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris),终浓度
2.1-4.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，终浓度42.9-85.7mmol/L Nacl和体积终浓度60-80%无水乙醇组成；
[0015]所述工作液D为5-10mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH = 7.0-9.0。
[0016]所述磁珠为硅基生物磁珠，粒径为lum，购买自温州安科纳米科技有限公司，产品编号:AK1-G1000o
[0017]本发明所述终浓度是指溶液在工作液中的终浓度，例如所述工作液A由终浓度
4-8mol/L NaClO4和终浓度 0.01-0.lmol/L NaAc 组成，pH = 5-6，是指 NaClO 4在工作液 A中的浓度为4-8mol/L，NaAc在工作液A中的浓度为0.01-0.lmol/Lo
[0018]进一步，所述工作液A由终浓度6mol/L NaClO4和终浓度0.012mol/L NaAc组成，pH = 5.2o
[0019]进一步，所述工作液C由终浓度8.6mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，终浓度
3.4mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，终浓度60mmol/L Nacl和体积终浓度70%无水乙醇组成。
[0020]进一步，所述工作液D为8mmol/L三轻甲基氨基甲烧(Tris)，pH = 8.0。
[0021]本发明采用以上技术方案，通过磁珠法来纯化非特异性扩增PCR产物，其最大优点就是自动化，磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，整个流程方便快捷，不需要使用到离心机等设备。本发明方法能简单、快速地纯化非特异性扩增的PCR产物，与以往的非特异性扩增的PCR产物纯化方法相比，本方法不需要使用离心机等大型仪器，便于小实验室更好地开展分子生物学的相关研宄。
【附图说明】
[0022]图1为非特异性扩增PCR产物检测结果:泳道1，2，3，4是四管重复的非特异性扩增PCR产物，泳道5是TAKARA公司的DL4500 marker ；
[0023]图2为纯化后的PCR产物检测结果:泳道I是纯化后的PCR产物，泳道2是TAKARA公司的 DL4500 marker ο
【具体实施方式】
[0024]一种基于磁珠法纯化非特异性扩增PCR产物的方法，其特征在于:其包括以下步骤:
[0025]I)通过琼脂糖凝胶检测PCR产物，当观察到非特异性条带与目的性条带分开时，用干净的小刀将目的条带切下，放入离心管中，然后在离心管中加入工作液A，所述目的条带与工作液A的重量比为1:3，然后于50-70°C温育8-15min ；
[0026]2)加入与上述离心管中的溶液等体积的工作液B，震荡10-30s，室温放置1-1Omin后，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠；
[0027]3)往上述含有磁珠的离心管中加入0.5-1.5ml工作液C，打匀后室温静置
5-10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠；
[0028]4)往上述含有磁珠的离心管中加入30-60 μ I工作液D，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸取溶液，此溶液即为回收后的PCR产物，后续于1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测；
[0029]所述工作液A由终浓度4-8mol/L NaClOjP终浓度0.01-0.lmol/L NaAc组成，pH=5-6 ；
[0030]所述工作液B由异丙醇和磁珠混悬液按照体积比24:1混合配制而成，其中，所述磁珠混悬液由磁珠和水按照体积比1:2混合配置而成；
[0031]所述工作液C由终浓度4.3-21.4mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris),终浓度
2.1-4.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，终浓度42.9-85.7mmol/L Nacl和体积终浓度60-80%无水乙醇组成；
[0032]所述工作液D为5-10mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH = 7.0-9.0。
[0033]实施例1
[0034]一种基于磁珠法纯化非特异性扩增PCR产物的方法，其特征在于:其包括以下步骤:
[0035]I)通过琼脂糖凝胶检测PCR产物，当观察到非特异性条带与目的性条带分开时，用干净的小刀将目的条带切下，放入离心管中，然后在离心管中加入工作液A，所述目的条带与工作液A的重量比为1:3，然后于60°C温育1min ；
[0036]2)加入与上述离心管中的溶液等体积的工作液B，震荡30s，室温放置1min后，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁