使用环糊精改进核酸扩增反应的特异性、灵敏度和产率的制作方法

专利名称：使用环糊精改进核酸扩增反应的特异性、灵敏度和产率的制作方法
使用环糊精改进核酸扩增反应的特异性、灵敏度和产率本发明涉及用于核酸扩增的试剂盒、组合物和方法。更具体而言，其涉及改进PCR 方法和PCR方法的变型的特异性、灵敏度和产率。聚合酶链式反应(PCR)是一种广泛用于分子生物学、遗传学、诊断、临床实验室、 法医学、环境科学、遗传性研究、亲子鉴定以及多种其他应用的技术。PCR技术的目的是从不可检出量的起始材料扩增靶核酸。PCR是一种强力且灵敏的DNA扩增技术。PCR通过使用多个循环的三步骤过程指数扩增特定的DNA序列。首先，在高温下使双链DNA模板变性。然后将序列特异性引物退火至相对两条链上目标序列侧翼的位点。热稳定性DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶延伸所述退火的引物，由此将原始DNA序列的量加倍。然后这种新合成的产物成为后续扩增循环的额外模板。将这三个步骤重复20到35个循环，使DNA浓度产生IO5-IO9倍的增加。尽管对于核酸扩增而言PCR方法和PCR相关方法是巨大的成功，仍然需要改进所述反应的特异性、灵敏度和产率以及聚合酶的性能。一些模板或靶核酸是难以扩增的和/或产生非特异性副产物如引物二聚体或寡聚体以及其他包括结合的引物的双链副产物。如果靶核酸以非常低的浓度存在，不合意的非特异性副产物的产生可能完全阻止对这种靶核酸的扩增。这在诊断试剂盒中可能是导致假阴性结果的棘手问题。扩增反应的特异性是由引物在不允许非特异性配对的优化温度下特异性退火至核酸靶而提供的。然而，出于各种原因，在进行扩增之前将反应混合物保持在低于理想退火温度的温度下。当反应混合物保持在较低温度时，引物可能不合期望地以非特异性方式结合至非靶核酸。这些副产物能够同靶核酸一起扩增或者能够完全阻止对靶核酸精确和大量的扩增。这导致背景的产生并减少特异性PCR产物的产率。物理阻断剂如蜡屏障(wax barrier)或蜡珠可以用于以热依赖性方式将反应组分分开。然而，主要的缺点是融化的屏障材料在PCR反应过程中残留在反应混合物中。常用的改进扩增反应的方法是使用HotStart DNA聚合酶的HotStart PCR0这一技术允许在PCR反应准备过程中抑制或阻断聚合酶活性。通过在PCR循环之前限制聚合酶活性，HotStart PCR减少非特异性扩增并增加PCR产物产率。HotStart PCR常常是通过使用对DNA聚合酶的可逆化学修饰或通过用特异性抗体抑制DNA聚合酶来进行的(EP O 592 035,EP O 771 870,EP O 962 526) 0在两种情况下，对DNA聚合酶的抑制都是可逆的，并且通过初始加热步骤来激活DNA聚合酶，所谓的“HotStart”在PCR循环之前进行。然而，这些技术需要使用特别制备的热稳定性DNA聚合酶和加热步骤。W02006/119419描述了在hot-start PCR中用于掩蔽试剂的物质，其中所述掩蔽剂是聚内酯基质。需要热起始(hot-start)从所述聚内酯基质释放PCR试剂。环糊精是环状寡糖，其一直是受到强烈关注的对象，主要是因为它们能够与称作 “访客(guest)”的其他分子形成所谓的“包含”复合物。环糊精通常包含能够容纳访客分子的疏水部分的腔。尽管环糊精的外表面为亲水性的，内腔却高度疏水，使它们能够与许多种较小的疏水分子形成包含复合物。所述腔取决于葡萄糖单位数而具有不同的直径。通过与各种分子或分子的部分形成包含复合物，它们能够改变所述访客分子的理化性质。这能够导致访客分子(例如活性药物分子)的溶解度增加，并增加它们的生物利用度。可以封装可溶性差的药物、迅速变质的味道、挥发性香味或有毒分子。环糊精在药品工业中用作控制药物配制剂中活性成分释放的手段。另外，环糊精能够使不稳定的分子稳定并保护它们免受光、温度、氧化、还原和水解的降解或通过降低它们的挥发性而保护它们免遭降解。因此， 环糊精在包括药理学、食品工业和美容学在内的广泛领域中得到多种应用。由于环糊精与疏水分子的包含化合物能够穿透身体组织，这可用于在特定条件下释放生物活性化合物。已经显示了环糊精或环糊精衍生物催化特定的化学反应。还发现了环糊精在分子生物学中的一些应用。W091/02040描述了用于标记配体的包含荧光团和环糊精的包含复合物。所述荧光团和环糊精的包含复合物将信号放大。将用这些包含复合物标记的引物用于核酸测序。W000/37674还描述了在测序反应中使用环糊精来扩增激基缔合物或激基复合物标签的荧光团。US 5，705, 345描述了使用环糊精制备核酸的方法和试剂盒。该文献公开了使用环糊精用于中和DNA修饰或扩增反应中的提取剂。例如，环糊精有效中和SDS和苯酚。EP 0 762 898描述了用于治疗用途的反义寡核苷酸与环糊精的包含体。 W095/32739描述了用于细胞递送系统的与环糊精复合的寡核苷酸。在分子生物学中，已将环糊精用于扩增荧光标记以及用于治疗性反义寡核苷酸的递送。然而，现有技术从未描述或提出过在核酸扩增反应中使用环糊精。现在本发明令人惊讶地证明环糊精的使用改进了 DNA扩增反应如PCR反应和PCR 反应的变型的特异性、灵敏度和/或产率。另外，环糊精还改进等温DNA扩增反应的特异性、灵敏度和/或产率。在第一个实施方案中，这种改进是通过用环糊精预处理扩增反应的组分之一来获得的，所述组分如热稳定性DNA聚合酶、dNTP或引物。引人注目的是，在另一实施方案中， 如果简单地将环糊精加入到进行了核酸扩增的最终反应混合物中，也观察到了扩增反应的改进。本发明的试剂盒、组合物和方法导致非特异性扩增产物包括引物二聚体的减少， 同时改进特异性靶核酸的产率。本发明的试剂盒、组合物和方法不需要热激活步骤(HotStart)，但是通过根据本发明加入环糊精可进一步改进HotStart PCR技术。核酸扩增反应的整体效率、灵敏度和特异性得到改进。由于可以简单地向反应混合物加入环糊精，本发明的试剂盒、组合物和方法使医师能够获得很大的灵活性。如果用环糊精对组分之一进行预处理，则该预处理包括简单的与环糊精一起温育。序列表SEQ ID No. 1 引物 FWD NUMBSEQ ID No. 2 引物 REV NUMBSEQ ID No. 3 引物 HLA-CSEQ ID No. 4 引物 HLA-CSEQ ID No. 5 引物 FWD t-PAl
SEQ ID No. 6 引物 REV t-PAl

发明内容
本发明涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其中所述扩增反应在包含至少一种环糊精的最终反应混合物中进行。在第一种实施方案中，本发明涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、 灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤a)将含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的样品与含有至少一种环糊精的扩增反应混合物接触；b)对步骤a)中获得的反应混合物进行扩增反应。在第二种实施方案中，本发明涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、 灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤a)将环糊精与至少一种选自热稳定性DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP和引物的组分接触；b)将含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的样品与含有至少一种来自步骤a) 的组分的扩增反应混合物接触；c)对步骤b)中获得的反应混合物进行扩增。在第三种实施方案中，本发明涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、 灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤a)将所述样品与环糊精接触以获得样品和环糊精的混合物；b)将所述样品和环糊精的混合物与扩增反应混合物接触；c)对步骤b)中获得的反应混合物进行扩增反应。在第四种实施方案中，本发明涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、 灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤a)将所述样品与扩增反应混合物接触；b)加入至少一种环糊精；c)对步骤b)中获得的反应混合物进行扩增反应。优选地，包含在所述反应混合物中的环糊精的浓度为0. l_50mM。优选地，所述反应混合物包含0. 01-0. 2单位/ μ 1的热稳定性DNA聚合酶。优选地，所述反应混合物至少包含样品、环糊精、热稳定性DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP和至少一种引物。优选地，所述环糊精选自下组α -环糊精、β -环糊精、Y -环糊精和它们的衍生物。更优选地，所述环糊精选自下组单丙二胺-β -环糊精、6-0- α -D-麦芽糖基-β 环糊精、羟乙基-β -环糊精、羟丙基-β -环糊精和2-羟丙基-β -环糊精。本发明的另一目的是一种用于改进由DNA聚合酶催化的核酸体外合成的特异性和/或产率的方法，包括将单链核酸与DNA合成反应混合物接触，所述DNA合成反应混合物包含DNA聚合酶、引物、dNTP和至少一种环糊精。优选地，所述用于改进由DNA聚合酶催化的核酸体外合成的特异性和/或产率的方法，包括使所述引物退火至所述单链核酸并在所述引物的3’端掺入互补的dNTP。优选地，包含在最终反应混合物中环糊精的浓度为0. 5-50mM,所述最终反应混合物包含单链核酸和所述DNA合成反应混合物。本发明还涉及用于扩增样品中靶核酸的试剂盒，其在同一容器中包含至少一种环糊精和至少一种选自下组的组分热稳定性DNA聚合酶、用于核酸扩增的反应缓冲液、dNTP 和寡核苷酸引物。在一些实施方案中，所述试剂盒在同一容器中或另外的容器中包含逆转录酶。发明详述本发明涉及用于改进通过DNA聚合酶催化的核酸体外合成的特异性、灵敏度和/ 或产率的方法，其包括将单链核酸与DNA合成反应混合物接触，所述DNA合成反应混合物包含DNA聚合酶、引物、dNTP和至少一种环糊精。测序，以及任何其他涉及引物退火继以使用 DNA聚合酶的引物延伸的反应，当在至少一种环糊精存在下进行该反应时均得到改进。变性、退火和延长/延伸步骤可以重复期望的次数以扩增样品中的靶核酸。因此， 在优选的实施方案中，本发明提供使用环糊精扩增核酸的方法。本发明还涉及包含环糊精的试剂盒和组合物。有利地，本发明提供用于核酸扩增的试剂盒和组合物。这些试剂盒和组合物通常意图用于研究或用于体外诊断应用。术语“扩增”指增加样品中靶核苷酸序列拷贝数的体外方法。扩增反应通常由允许连续变性、退火和引物延伸循环的多轮重复温度循环组成。然而，等温扩增方法也在本发明的范围内。本发明提供用于进行PCR或PCR反应的变型如等温扩增的方法、组合物和试剂盒。这些方法在文献中描述并且是本领域技术人员熟知的。通常，PCR反应涉及一系列重复20-35次的热循环，所述循环包括变性步骤、引物退火步骤和延伸/延长步骤。该反应常常以5-100μ 1的反应体积在小反应管中于热循环仪中进行。变性步骤在大约94°C-95°C的温度使核酸能够完全变性。这一步骤产生单链DNA。 引物退火步骤通常在比引物-靶序列DNA双链体的解链温度低大约5°C的温度下进行。在此步寡核苷酸引物特异性结合于单链靶序列。延伸步骤在约72°C进行，但这依赖于所用的 DNA聚合酶。例如Taq DNA聚合酶的最佳条件为72°C。在此步DNA聚合酶通过在5，到3， 方向上添加dNTP的引物延伸来合成与靶链互补的新DNA链。本发明涉及DNA或RNA靶核苷酸的扩增。对于RNA靶的扩增，使用逆转录酶来获得DNA模板。本发明的方法、试剂盒和组合物可用于经典PCR、常规解决方案的DNA/RNA定量 (routine solution DNA/RNA quantification)、逆转录酶 PCR( —步和两步)、Real-Time PCR(单标记探针，双染料探针，Molecular Beacon探针，Scorpions探针，plexor引物，FRET 探针，Padlock探针；仅在与双链DNA结合时发射荧光的dsDNA结合性荧光体(如STOrGreen 染料))、基于核酸序列的扩增(NASBA)、高分辨率DNA熔解曲线分析(HRM)、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)、嗜热解旋酶依赖性扩增(tHDA)的实时监测、引物延伸、cDNA末端的快速扩增(RACE)、巢式PCR、免疫聚合酶链式反应(免疫PCR)、牵涉滚环复制(RCA)的方法、芯片上的染色质免疫沉淀(芯片上的ChIP)、使用邻位连接技术用于检测蛋白质、生物分子相互作用和单拷贝病原体的应用以及基于固相的核酸测定法。本发明的试剂盒、组合物和方法适用于包括靶核酸的扩增和测序的测定法。本发明的试剂盒、组合物和方法特别用于诊断目的，用于基因分型和用于SNP研究。含有或疑似含有靶核苷酸序列的核酸可以标记或附接至固相支持物如珠或固体表面。也可以将寡核苷酸引物标记或附接于多种支持物包括珠。在本发明中，反应中环糊精的目的不是扩大标记或标志物的信号，举例而言例如标记的荧光。通常，环糊精不包括任何标记或标志物。在本发明的方法或试剂盒中，将环糊精用于增加扩增反应或DNA合成反应的产率、灵敏度和/或特异性。本发明的试剂盒、组合物和方法提供用于靶核酸的扩增。在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒和组合物包含环糊精和至少另一种核酸扩增所需的试剂。本发明还涉及在用于核酸扩增的方法中使用环糊精以改进该反应的产率、特异性和/或灵敏度。环糊精是一个环式环状寡糖家族。常见的环糊精由5个或更多个通过1- > 4糖苷键连接的α-D-吡喃葡糖苷单位构成。环糊精是技术人员熟知的并且可以例如通过酶转化手段从淀粉产生。令人惊讶的是，环糊精的添加改进核酸扩增反应的特异性、灵敏度和产率。任何环糊精、修饰的环糊精或它们的任何混合物均可以在本发明的试剂盒、组合物和方法中使用。α -环糊精(六元糖环分子)、β -环糊精(七糖环分子)、Y -环糊精(八糖环分子)或它们的衍生物是优选的。α -环糊精、β -环糊精设Y -环糊精的通式在下文显示。这些天然环糊精能够充当支架，在其上可以装配官能基和其它取代基。取代的环糊精或环糊精衍生物可以在本发明的方法、试剂盒和组合物中使用。可以通过用疏水模块或用“效应基团”例如糖或肽对羟基进行的任意取代或官能化来修饰环糊精。修饰的环糊精的化学式如下所示，其中R 是有机基团。通式修饰的β -环糊精，其中R是有机基团任何环糊精或环糊精衍生物，只要对扩增反应或对核酸合成反应具有期望的效果，均可用于本发明的试剂盒、组合物或方法中。在α -环糊精中，优选的环糊精包括(2-羟丙基)-α -环糊精和3Α_氨基_3Α_脱氧-(2AS，3AS) - α -环糊精水合物。
在β-环糊精中，优选的环糊精包括单丙二胺-β-环糊精(6' -(3-氨基-丙胺基)-6 ‘-脱氧-环麦芽七糖)>6-0- α -D-麦芽糖基-β -环糊精、2，6- 二 _0_甲基-β -环糊精、羟乙基-β-环糊精、(2-羟丙基)-β-环糊精(β环糊精2-羟丙基醚)、3Α_氨基-3Α-脱氧-(2AS，3AS) - β -环糊精水合物和羟丙基-β -环糊精。在优选的实施方案中，使用2-羟丙基-β -环糊精，甚至更优选使用取代程度为每个葡萄糖单元0. 5至0. 7个羟丙基基团的2-羟丙基-β -环糊精。最优选使用取代程度为每个葡萄糖单元0. 67个羟丙基基团的2-羟丙基-β -环糊精。 在γ -环糊精中，优选的环糊精包括(2-羟丙基)-γ -环糊精和3Α-氨基-3Α-脱氧-(2AS，3AS)-γ-环糊精水合物。用于核酸扩增的试剂或组分，包括寡核苷酸引物、三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)、热稳定性DNA聚合酶和合适的反应缓冲液，在文献中描述并且为本领域普通技术人员所知。可以在本发明的试剂盒、组合物或方法中使用任何DNA聚合酶。优选热稳定性DNA 聚合酶。优选的、可以用于本发明的方法的热稳定性DNA聚合酶包括获得自各种栖热菌属 (Thermus)细菌菌种或来自其他微生物来源的聚合酶。优选的热稳定性DNA聚合酶是从水生栖热菌(Thermus aquaticus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、黄栖热菌(Thermus flavus)或激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、沃氏火球菌(Pyrococcus woseii)禾口附岸热球菌(Thermococcus litoralis)获得的那些。这些聚合酶优选产生并纯化自含有编码所述DNA聚合酶的基因的重组大肠杆菌。本发明的试剂盒、组合物和方法也可以使用上至少两种热稳定性DNA聚合酶或热稳定性DNA聚合酶与其他酶的组合，所述其他酶如尿嘧啶-N-糖基化酶、DNA酶或核酸外切酶如3’ -5’校正读码核酸外切酶。这些酶或酶组合对于长的核酸分子的扩增特别有用。另外，本发明的试剂盒、组合物和方法可以使用所谓的HotStart DNA聚合酶，所述 HotStart DNA聚合酶已经通过例如化学处理或通过特异性单克隆抗体而可逆地失活。这些 DNA聚合酶需要在90°C -95°C进行5_10分钟的初始热激活步骤。一些试剂或组分可以作为浓缩储液提供，在制备扩增反应混合物用于进行反应时将所述浓缩储液稀释。组分也可以以干固体的形式提供，意图将其重悬于水中或适当的缓冲液中以制备储液。术语“反应缓冲液”指在其中进行酶促核酸扩增的缓冲性溶液。所述反应缓冲液可以作为浓缩储液提供，通常为^、切或IOx浓度。在本发明中，所述反应缓冲液可以含有在用于核酸扩增的缓冲液中使用的任何已知化学品。例如，所述溶液可以含有Tris以供进行缓冲。反应缓冲液通常还含有一价阳离子(KCl)、二价阳离子(MgCl2、MgS04)和非离子洗涤剂(TritonX-100、Tween 20、NP40)。所述缓冲液也可以含有提高PCR产率的试剂，比如举例而言(NH4)2SO4、海藻糖、DMS0、BSA、甘油、MgCl2、EDTA、甜菜碱等。所述反应缓冲液也可以含有任何热稳定性DNA聚合酶所需的辅助因子。这些试剂可以在同一容器中提供或在分开的容器中提供。例如，标准IOX PCR 缓冲液可以包含150-750mM Tris-HCl pH 8-8.8、 50-200nM(NH4) 2S04、100-500mM KCl、0_20mM MgCl2、0. 1% Tween-20 和 0.01% 明胶。
术语“储存缓冲液”指将酶如热稳定性DNA聚合酶储存于其中的缓冲性溶液。这种缓冲性溶液可以使酶能够在-20°C或在4°C储存数周或数月。通常，所述储存缓冲液含有甘油以供在-20°C储存酶。例如标准Ix储存(缓冲液)可以包含Tris 20mM、EDTA 0. ImM, KCllOOmM, DTT 1-lOmM、Nonidet P40 0. 50 Tween-20 0. 10-0. 50 %、甘油 0-50 %、磷酸钾 (k-phospate) IOmM, Triton X-100 0. 10%, PMSF 0. 5mM 和 Ig印alCA-630 0.50%。dNTP包括dATP、dCTP、dTTP和dGTP。本发明的试剂盒、组合物和方法也可以使用经修饰的或经标记的dNTP或核苷。dNTP可以作为预混合的dATP、dCTP、dTTP和dGTP的平衡储液提供。例如预混合的dNTP是2’ -脱氧-腺苷-5’ -三磷酸、2’ -脱氧-胞苷_5’ -三磷酸、2’ -脱氧-鸟苷-5’ -三磷酸、2’ -脱氧-胸苷-5’ -三磷酸各5mM的水溶液。本发明的试剂盒、组合物和方法也可以使用dUTP。例如预混合的dNTP/dUTP溶液含有 dATP、dCTP、dGTP 各 5mM 和 IOmM 2，-脱氧-鸟苷 _5，-三磷酸(dUTP)。术语“引物”指具有或含有与靶核酸互补的序列的寡核苷酸或其衍生物。所述引物与变性的靶核酸通过碱基配对杂交以起始由DNA聚合酶催化的延伸反应。本发明的试剂盒、组合物和方法优选使用至少两种寡核苷酸引物，所述引物在靶核酸侧翼并与核酸的相对链杂交。本发明的试剂盒、组合物和方法也可以使用标记的或修饰的寡核苷酸。术语“扩增反应混合物”指包含进行反应所需的组分中的一些或全部但不含样品的溶液。这种扩增反应混合物通常称作“MasterMix”。MasterMix由进行反应所需的组分中的一些或全部组成，但不含样品。MasterMix通常包含反应缓冲液、dATP、dCTP、dTTP和 dGTP的平衡混合物、热稳定性DNA聚合酶和引物。术语“反应混合物”或“最终反应混合物”指包含包括样品在内的进行反应所需的全部组分的溶液。所述反应混合物通常通过将确定体积的扩增反应混合物与确定体积的样品混合来制备。所述最终反应混合物包含含有或疑似含有靶核酸的样品和扩增反应混合物二者。所述最终反应混合物通常含有5-100 μ 1的体积。PCR反应或更概括而言扩增反应也可以在dsDNA结合性荧光体存在下进行，所述 dsDNA结合性荧光体仅在与双链DNA结合时发出荧光(如STOrGreen染料)。这对于实时 PCR应用或定量PCR特别有用。术语“样品”指含有或疑似含有靶核酸的任何固体或液体材料。所述样品可以是纯化的核酸、生物样品如组织样品、生物流体样品或细胞样品。所述样品可以例如是血液、 尿液、血清或唾液。所述样品可以含有人、植物、动物、细菌或病毒来源的固体或液体材料。用于核酸扩增的反应组分通常商品化为包含至少一种或多种进行靶核酸扩增所必需的试剂/组分的试剂盒。本发明的第一个目的是一种改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/ 或特异性的方法，其中所述扩增反应在包含至少一种环糊精的反应混合物中进行。本发明涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括将含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的样品与含有环糊精的扩增反应混合物接触的步骤。可以将所述环糊精和其他核酸扩增所需的试剂/组分分别加入样品以构成在其中进行扩增的最终反应混合物。或者，可以将环糊精与用于核酸扩增的其他组分预混合，然后再将其与样品接触以进行扩增反应。或者，可以在加入其他用于核酸扩增的组分之前将样品与环糊精接触。在另一实施方案中，将环糊精用于预处理核酸扩增组分。可以用环糊精预处理热稳定性DNA聚合酶、寡核苷酸引物或dNTP。将经预处理的组分用于制备含有环糊精的扩增反应混合物或用于直接制备含有环糊精的最终反应混合物。本发明涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤a)将含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的样品与含有至少一种环糊精扩增反应混合物接触；b)对步骤a)中获得的最终反应混合物进行扩增反应。本发明还涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤a)将环糊精与至少一种选自热稳定性DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP和引物的组分接触；b)将含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的样品与含有至少一种来自步骤a) 的组分的扩增反应混合物接触；c)对步骤b)中获得的最终反应混合物进行扩增反应。本发明还涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤a)将所述样品与环糊精接触以获得样品和环糊精的混合物；b)将所述样品和环糊精的混合物与扩增反应混合物接触；c)对步骤b)中获得的最终反应混合物进行扩增反应。本发明还涉及用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤a)将所述样品与扩增反应混合物接触；b)加入至少一种环糊精；c)对步骤b)中获得的反应混合物进行扩增反应。在根据本发明的方法中，由样品和扩增反应混合物组成的所述反应混合物中环糊精的浓度优选包括0. 1至50mM，更优选0. 5至50mM。优选在0. 1,0. 5、l、2、4、5mM至10、15、 20、25、30、40和50mM。环糊精的适当浓度可以依赖于根据本发明的方法中使用的环糊精。 如本申请所述的方法可以用于评价使扩增方法的灵敏度、特异性和/或产率得到改进的环糊精的最佳浓度。在优选的实施方案中，环糊精选自下组α-环糊精、β-环糊精、Y-环糊精和它们的衍生物。还更优选地，环糊精选自下组单丙二胺-β -环糊精、6-0- α -D-麦芽糖基-β 环糊精、羟乙基-β -环糊精、羟丙基-β -环糊精和2-羟丙基-β -环糊精。热稳定性DNA聚合酶的浓度是可能决定核酸扩增方法的灵敏度、特异性和产率的另一因素。在一个优选的实施方案中，包含样品和扩增反应混合物的所述最终反应混合物包含 0.01、0. 02,0.03,0. 04 单位 / μ 1 至 0. 05,0. 075,0. 1 和 0. 2 单位 / μ 1 的热稳定性 DNA 聚合酶。将一个单位定义为在72°C在30分钟内向酸性不溶材料掺入IOnmol dNTP所需的酶量。根据本发明的方法可以进一步包括加热步骤以将核酸变性和/或激活“Hot Start'DNA聚合酶。如果所述热稳定性DNA聚合酶通过化学修饰或通过单克隆抗体进行了可逆失活，则需要这一额外步骤。有利地，本发明的方法不需要在95°C的加热步骤/激活步骤。在根据本发明的方法中，所述扩增反应混合物可以包含经环糊精预处理的热稳定性DNA聚合酶。在本发明的方法中，所述扩增反应混合物可以包含经环糊精预处理的dNTP。在本发明的方法中，所述扩增反应混合物可以包含经环糊精预处理的至少一种引物。用环糊精预处理扩增反应混合物的试剂/组分通过将所述组分与足够浓度的环糊精温育来进行。这种温育可以在室温或优选在4°C进行。温育一小时通常足以获得环糊精对所述试剂的充分预处理。或者，可以使用环糊精来制备要加入样品的扩增反应混合物或制备最终反应混合物以供进行反应。在一个优选的实施方案中，所述扩增反应混合物包含环糊精、热稳定性DAN聚合酶、反应缓冲液、dNTP和寡核苷酸引物。用于靶核酸扩增的方法在文献中描述并且为本领域技术人员所知。PCR是用于核酸扩增的标准技术但PCR方法的变型也可用于根据本发明的方法。本发明的方法可以进一步包括在94-95°C进行的初始变性步骤以供核酸的初始和完全变性。加热步骤通常要1、2、3或5-10分钟。这种初始步骤也可以充当用于HotStart DNA聚合酶的加热激活步骤。本发明的试剂盒、组合物和方法改进核酸扩增反应的特异性、灵敏度和/或产率。 其他已知的方法可以与本发明组合使用以进一步改进反应。一些试剂如DMSO、BSA、甘油、 海藻糖、甜菜碱据报道可改进反应。进一步的改进可以通过使用所谓的HotStart DNA聚合酶来获得。本发明还涉及含有环糊精和至少一种用于核酸扩增的试剂的组合物。本发明的组合物可以是一旦加入样品便可即刻用于进行反应的扩增反应混合物。或者，如果根据本发明的组合物包含酶，其可以是浓缩储液或浓缩储存溶液的形式。本发明提供用于通过DNA聚合酶催化的体外DNA合成的包含环糊精和至少一种选自下组的组分的组合物DNA聚合酶、用于体外DNA合成的反应缓冲液、dNTP和引物。本发明还涵盖用于样品中靶核酸扩增的组合物，其包含环糊精和至少一种选自下组的组分热稳定性DNA聚合酶、用于核酸扩增的反应缓冲液、dNTP和寡核苷酸引物。在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含环糊精和热稳定性DNA聚合酶。优选地，根据本发明的组合物包含环糊精、热稳定性DNA聚合酶和储存缓冲液。所述储存缓冲液适用于在4°C或-20°C储存热稳定性DNA聚合酶。概括而言，为了改进核酸扩增的产率、灵敏度和/或特异性，优选以充分的浓度提供环糊精。本发明还涉及包含环糊精和至少一种dNTP的组合物。优选地，所述组合物包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP的平衡混合物。例如所述组合物是包含dNTP的平衡预混物和环糊精的浓缩储液。或者，所述组合物可以包含dATP、dCTP、dGTP、dUTP和环糊精。另外，本发明涉及包含环糊精和用于核酸扩增的反应缓冲液的组合物。在另一实施方案中，所述组合物包含环糊精和至少一种引物。优选地，所述组合物包含环糊精和在靶核酸的5’和3’端与相对链杂交的至少两种引物。在一个优选的实施方案中，所述组合物包含环糊精、热稳定性DNA聚合酶、dNTP和用于核酸扩增的反应缓冲液。所述组合物可以进一步包含含有靶核酸或疑似含有靶核酸的样品。在所述组合物中，更具体而言在由样品和扩增反应混合物组成的所述最终反应混合物中，环糊精的浓度优选包括0. 1至50mM，更优选0. 5至50mM。优选在0. 1、0. 5、1、2、4、 5mM 至 10、15、20、25、30、40 和 50mM。在所述组合物中，更具体而言在由样品和扩增反应混合物组成的所述最终反应混合物中，热稳定性DNA聚合酶的量优选包括0. 01,0. 02,0. 03,0. 04单位/ μ 1至0. 05、 0. 075,0. 1 和 0. 2 单位 / μ 1。在另一实施方案中，所述组合物是用于扩增样品中靶核酸序列的试剂盒的一部分。本发明的另一个目的是试剂盒，其在相同或分开的容器中包含环糊精和至少一种选自下组的组分DNA聚合酶、用于体外DNA合成的反应缓冲液、dNTP和引物。优选地，所述试剂盒用于核酸扩增。在一个优选的实施方案中，本发明涉及试剂盒，其在相同或分开的容器中包含环糊精和至少一种选自下组的组分热稳定性DNA聚合酶、用于核酸扩增的反应缓冲液、dNTP 和寡核苷酸引物。在另一优选的实施方案中，本发明涉及用于样品中靶核酸扩增的试剂盒，其在同一容器中包含至少一种环糊精和至少一种选自下组的组分热稳定性DNA聚合酶、用于核酸扩增的反应缓冲液、dNTP和寡核苷酸引物。在本发明的试剂盒中，将不同的试剂在分开的容器中提供或作为包含几种组分的预混物提供。所述组分可以作为浓缩储液提供，所述浓缩储液在核酸扩增之前必需经混合和稀释。所述组分还可以以意图在水中或在合适的缓冲液中重悬的脱水的、冻干的或任何其他干固体形式提供。所述试剂盒可进一步包含用于DNA聚合酶的任何辅助因子。所述试剂盒还可包含dsDNA结合性荧光体，其仅当与双链DNA结合时发出荧光 (如 SYBRGreen)。在第一实施方案中，根据本发明的试剂盒在同一容器中包含环糊精和热稳定性 DNA聚合酶。优选地，根据本发明的试剂盒在同一容器中包含环糊精、热稳定性DNA聚合酶和储存缓冲液。所述储存缓冲液特别意图用于且适于热稳定性DNA聚合酶的储存。保持在含有环糊精的储存缓冲液中的热稳定性DNA聚合酶通常在进行核酸扩增之前进行稀释。在第二实施方案中，根据本发明的试剂盒在同一容器中包含环糊精和至少一种dNTP。优选地，所述容器包含环糊精以及dATP、dCTP、dGTP和dTTP的平衡浓缩预混物。在核酸扩增前稀释这种含有环糊精的dNTP预混物。或者，所述容器包含环糊精以及dATP、 dCTP、dGTP和dUTP的混合物。在另一实施方案中，根据本发明的试剂盒在同一容器中包含环糊精和用于核酸扩增的反应缓冲液。优选地，所述容器含有浓缩的反应缓冲液和环糊精。将这种储液稀释以制备扩增反应混合物和在其中进行核酸扩增的最终反应混合物。在另一实施方案中，根据本发明的试剂盒在同一容器中包含环糊精和至少一种引物。优选地，所述容器可以包含环糊精和在待扩增的靶核酸序列的5’和3’端与相对链杂交的至少两种或更多种引物。在另一实施方案中，根据本发明的试剂盒在同一容器中包含环糊精、仅当与双链 DNA结合时发出荧光的dsDNA结合性荧光体。在另一实施方案中，所述试剂盒在同一容器中包含与靶核酸杂交的标记的探针和环糊精。本发明的试剂盒提供用于DNA和RNA 二者的扩增。因此，本发明的试剂盒还可包含逆转录酶。将所述逆转录酶或RNA依赖性DNA聚合酶用于从RNA模板合成cDNA ；之后扩增所得的cDNA。优选的逆转录酶包括Mu-MLV逆转录酶和AMV逆转录酶。在一些实施方案中，本发明的试剂盒提供用于等温扩增。所述试剂盒因此可包含解旋酶。在本发明的试剂盒中，所述环糊精可以作为浓缩储液在单独的容器中提供或作为与其他组分或试剂的混合物提供。在一个优选的实施方案中，最终反应混合物中环糊精的终浓度优选包括0. 1至50mM，更优选0. 5至50mM，并且还更优选0. 1,0. 5、l、2、4、5mM至10、 15、20、25、30、40 和 50mM。根据本发明的试剂盒可以含有溶液或干固体形式的环糊精，所述干固体形式用于在水中或合适的缓冲液中重悬。环糊精可以作为与其他组分的预混物或浓缩储液提供。所述试剂盒也可包含用于制备具有合适浓度环糊精的扩增反应混合物的说明。环糊精可以直接添加至用于制备扩增反应混合物的其他试剂。或者，可以使用环糊精预处理反应组分之一，例如热稳定性DNA聚合酶、dNTP或寡核苷酸引物。在另一实施方案中，可以将环糊精添加至含有或疑似含有所述靶核酸的样品。优选地，在扩增反应混合物中使用提供良好特异性、产率和灵敏度的适量的热稳定性DNA聚合酶。优选地，最终反应混合物中热稳定性DNA聚合酶的量包括0. 01,0. 02、 0. 03,0. 04 单位 / μ 1 至 0. 05,0. 075,0. 1 和 0. 2 单位 / μ 1。本发明的试剂盒上通常可以不包含核酸扩增所需的全部组分。一些组分如弓I物和样品可以由试剂盒的最终用户提供。本发明的试剂盒也可包含内部阳性对照(IPC)。所述内部阳性对照包含引物和/ 或特异性探针和对照DNA模板。这种IPC也可以含有环糊精。本发明还涉及试剂盒的用途，所述试剂盒包含环糊精和在同一容器或在别的容器中的至少一种用于核酸扩增的试剂。


图1 测试Taa聚合酶+SAl (环糊精)1 =IOng gDNA, Taq R-POL-PO1 lx+SAl 4mM ；2 :0ng gDNA，TaqR-POL-POl lx+SAl 4mM ；3 :10ng gDNA, Taq R-P0L-P01 稀释 10x+SA14mM ;4 :0ng gDNA, Taq R-POL-POl 稀释 ΙΟχ+SAl 4mM ；5 :10ng gDNA，Taq R-P0L-P01 lx+dH20 ；6 :0ng gDNA，Taq R-P0L-P01 lx+dH20 ；7 1 OnggDNA, Taq R-P0L-P01 稀释 10x+dH20 ；8 :0ng gDNA, Taq R-P0L-P01 稀释 10x+dH20 ；9 :10ng gDNA, GoldStar+SA14mM ；10 :0ng gDNA, GoldStar+SAl 4mM ；11 :10ng gDNA, GoldStar+dH20 ； 12 :0ng gDNA, GoldStar+dH20 ；L :用于小片段的 Smart Ladder。Ml :用HLA-C引物测试Taq+SAl (环糊精)L Smart Ladder ；1 :2ng gDNA, TAQ,无 SAl ；2 :NTC，TAQ,无 SAl ；3 :2ng gDNA, TAQ+SA1 4mM 终浓度；4 :NTC，TAQ+SA1 4mM 终浓度；Ml I gnatov 等中通过 PCR 扩增的 HLA-CMi 使用含SAl (环糊精)和SAR(环糊精)的Taq聚合酶制备物的测试L. Smart Ladder1. Taq R-Pol-POl 与 IOng gDNA ；2. Taq R-Pol-POl 与 Ing gDNA ；3. NTC 与 Taq R-Pol-POl ；4.在 9mM SAl 存在下的 Taq R-Pol-POl 与 IOng gDNA ；5.在 9mM SAl 存在下的 iTaq R-Pol-POl 与 Ing gDNA ；6.在 9mM SAl 存在下的 NTC 与 iTaq R-Pol-POl ；7.在 9mM SAR 存在下的 Taq R-Pol-POl 与 IOng gDNA ；8.在 9mM SAR 存在下的 Taq R-Pol-POl 与 Ing gDNA ；9.在 9mM SAR 存在下的 NTC 与 iTaq R-Pol-POl ；10. HotGoldStar 与 IOng gDNA ； 11. HotGoldStar 与 Ing gDNA ；12. NTC 与 HotGoldStar1. Taq R-Pol-POl 与 IOng gDNA ；2. Taq R-Pol-POl 与 Ing gDNA ；3. NTC 与 Taq R-Pol-POl ；4.在 9mM SAl 存在下的 Taq R-Pol-POl 与 IOng gDNA ；5.在 9mM SAl 存在下的 iTaq R-Pol-POl 与 Ing gDNA ；6.在 9mM SAl 存在下的 NTC 与 iTaq R-Pol-POl ；7.在 9mM SAR 存在下的 iTaq R-Pol-POl 与 IOng gDNA ；8.在 9mM SAR 存在下的 iTaq R-Pol-POl 与 Ing gDNA ；9.在 9mM SAR 存在下的 NTC 与 iTaq R-Pol-POl ； IOHotGoldStar 与 IOng gDNA ； 11. HotGoldStar 与 Ing gDNA ；12. NTC 与 HotGoIdStar。M5 在使用不同Taq聚合酶的PCR中测试SARL. Smart Ladder SF1-7. Taq Pol R-Pol-POl 与 IOng gDNA，无 SaR2-8. Taq Pol R-PoI-POl 与 Ing gDNA，无 SaR3-9. NTC 与 iTaq Pol R-Pol-POl，无 S aR4-10. Taq Pol R-PoI-POl 与 IOng gDNA，在 9mM SaR 存在下5-11. Taq Pol R-Pol-POl 与 Ing gDNA，在 9mM SaR 存在下6-12. NTC 与 iTaq Pol R-Pol-POl，在 9mM SaR 存在下13-19. EGT GoldStar 与 IOng gDNA，无 SaR14-20. EGT GoldStar 与 Ing gDNA，无 SaR15-21. NTC 与 EGT GoldStar, ^ SaR16-22. EGT GoldStar 与 IOng gDNA，在 9mM SaR 存在下17-23. EGT GoldStar 与 Ing gDNA，在 9mM SaR 存在下18-24. NTC 与 EGT GoldStar，在 9mM SaR 存在下
15图6 在使用不同Taq聚合酶的PCR中测试SAR L.Smart Ladder SF
1-7.EGT HotGoldStar 与 IOng gDNA，无 SaR
2-8.EGT HotGoldStar 与 Ing gDNA，无 SaR
3-9.NTC 与 EGT HotGoldStar,无 SaR
4-10.EGT HotGoldStar 与 IOng gDNA，在 9mM SaR 存在下
5-11.EGT HotGoldStar 与 Ing gDNA，在 9mM SaR 存在下
6-12.NTC 与 EGT HotGoldStar,在 9mM SaR 存在下
13-19.Roche FastStart 与 IOng gDNA，无 SaR
14-20.Roche FastStart 与 Ing gDNA，无 MR
15-21.NTC 与 Roche FastStart, ^ SaR
16-22.Roche FastStart 与 IOng gDNA，在 9mM SaR 存在下
17-23.Roche FastStart 与 Ing gDNA，在 9mM SaR 存在下
18-24.NTC 与 Roche FastStart，在 9mM SaR 存在下图7 测试dNTP+SAM缓冲液+SAl
A(未修饰的 Taq R-P0L-P07-GoIdStar Cycling)
1.人gDNA IOng-Numb
2.人gDNA Ing-Numb
3.NTC-Numb
B.(未修饰的Taq R-P0L-P07-HotGoIdStar Cycling)
4.人gDNA IOng-Numb
5.人gDNA Ing-Numb
6.NTC-Numb
C.(dNTP+SAl IOmM 于最终反应中-GoldStar Cycling)
1.人gDNA IOng-Numb
2.人gDNA Ing-Numb
3.NTC-Numb
D.(dNTP+SAl IOmM 于最终反应中-HotGoldStar Cycling)
4.人gDNA IOng-Numb
5.人gDNA Ing-Numb
6.NTC-Numb
E.(缓冲液反应物+SAl
1.人gDNA IOng-Numb
2.人gDNA Ing-Numb
3.NTC-Numb
F.(缓冲液反应物+SAl
4.人gDNA IOng-Numb
5.人gDNA Ing-Numb
6.NTC-Numb
IOmM 最终-GoldStar Cycling)
IOmM 最终-HotGoldStar Cycling)
G.
1.
2.
3.
H.
4.
5.
6.
S
A丨
1.
2.
3.
B.
4.
5.
6.
C.
1.
2.
3.
D.
4.
5.
6.
Ε.
1.
2.
3.
F.
4.
5.
6.
G.
1.
2.
3.
H.
4.
人 gDNA IOng-Numb
6. NTC-Numb
图8 测试dNTP+SAM缓冲液+SAl A(未修饰的 Taq R-P0L-P07-GoIdStar Cycling) 人 gDNA 10ng-tPAl 人 gDNA Ing-tPAl NTC-tPAl
(未修饰的 R-P0L-P07-HotGoIdStar Cycling) 人 gDNA 10ng-tPAl 人 gDNA Ing-tPAl NTC-tPAl
(dNTP+SAl IOmM 于最终反应中-GoldStar Cycling) 人 gDNA 10ng-tPAl 人 gDNA Ing-tPAl NTC-tPAl
(dNTP+SAl IOmM 于最终反应中-HotGoldStar Cycling) 人 gDNA 10ng-tPAl 人 gDNA Ing-tPAl NTC-tPAl
(缓冲液反应物 +SAl IOmM 最终-GoldStar Cycling) 人 gDNA 10ng-tPAl 人 gDNA Ing-tPAl NTC-tPAl
(缓冲液反应物 +SAl IOmM 最终-HotGoldStar Cycling) 人 gDNA 10ng-tPAl 人 gDNA Ing-tPAl NTC-tPAl
(HotGoldStar-GoldStar Cycling) 人 gDNA 10ng-tPAl 人 gDNA Ing-tPAl NTC-tPAl
(HotGo1dStar-HotGoIdStar Cycling) 人 gDNA lOng-tPAl
5.人 gDNA lng-tPAl6. NTC-tPAl图9 无初始加热步骤的PCR 使用Taq P08，Taq P08+6mM环糊精和Hot GoldStar 的扩增
实施例实施例1 基因、引物和特异件PCR产物1. NUMB引物序列Numb弓I物 FWD:gag gtt cct aca ggc acc tgc cca g弓丨物 REV:caa aat cac ccc tea cag tac tct g这些引物的所述三个碱基能够杂交在一起并在低温下得到引物二聚体。NCBI 参考所述靶在NCBI数据库中标识为NT_(^6437. 11 (序列位置54742877至 54743182)。扩增子长度306bp2. HLA-CHLA-C 禾口 PCR 片段记载于 “K. B. Ignatov, A. I. Miroshnikov, V. M. Kramarov, Russian Journal of Bioorganic Chemistty, 2003, vol. 29 (4),368-371.”引物序列HLA-C弓 I物 3 :gca agg att aca tcg ccc tga acg ag弓丨物 4:cat cat age ggt gac cac age tcc aa难以扩增的模板和非常长的PCR产物NCBI 参考所述靶在NCBI数据库中标识为ΝΤ_07592· 14。扩增子长度1230bp3. t-PAl引物序列t-PAl弓丨物 FWD:aga cag tac age cag cct ca弓 I物 REVl :gac ttc aaa ttt ctg ctc ctc在PCR过程中，在一些条件下，这些引物能够产生引物二聚体的形成。NCBI 参考所述靶在NCBI数据库中标识为NT_007995. 14。扩增子长度:374bp实施例2 测试Taa聚合酶+SAl (环糊精)gDNA 人基因组 DNA，Roche引物Numb ；扩增子=3(^bpGoldStar+ 来自 Eurogentec 的试剂盒 Ref :ME-0064-05 (5U/ μ 1)
Taq 聚合酶R-P0L_P01 (自制 Taq)2X储存缓冲液-Tris 40mM ；pH 8-EDTA 0. 2mM-KCl 0. 2M-DTT 2mM-Nonidet P40 1% (ν/ν)-Tween-20 1%环糊精SAlC45H78N2CXM+2HC1 :单丙二胺-β-环糊精*或6' _(3_氨基-丙基氨基)_6'-脱氧-环麦芽七糖(Chlorohydrated形式)。1. DNA 制备物gDNA 制备物
样品储液浓度[ng/μ 1]稀释成具有IOng/μ 1的工作浓度人 gDNA2001 μ 1 gDNA 储液 +19 μ 1 H2O PCR 级对于测试，加入1 μ 1/25 μ 1的反应对于NTC (阴性对照)，加入1 μ 1的H2O PCR级/25 μ 1的反应2.聚合酶制备物· Taq R-POL-POl+SAla.不稀释的Taq30 μ 1 Taq+30 μ 1 SAl 200mM在4 °C振荡并温育1小时b. IOx 稀释的 Taq3 μ 1 Taq+27 μ 1 储存缓冲液 2Χ+30 μ 1 SAl 200mM在4 °C振荡并温育1小时·单独的 iTaq R-P0L-P01c.不稀释的Taq5 μ 1 Taq+5 μ 1 H2Od. IOx 稀释的 Taq1 μ 1 Taq+9 μ 1 储存缓冲液 2Χ+10 μ 1 H2O· GoldStar(5U/μ 1)+SAlL 25 μ 1 GoldStar+3. 75 μ 1 储存缓冲液 2Χ+5 μ 1 SAl 200mM在4 °C振荡并温育1小时0. 625U/ μ 1·单独的 GoldStar (5U/ μ 1)L 25 μ 1 GoldStar+3. 75 μ 1 储存缓冲液 2Χ+5 μ 1 H2O0. 625U/ μ 1
对于测试和NTC，力口入1 μ 1的酶/25 μ 1反应3. Mastermix 制备物
权利要求
1.一种用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其特征在于所述扩增反应在包含至少一种环糊精的反应混合物中进行。
2.根据权利要求1的用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤a)将含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的样品与含有至少一种环糊精的扩增反应混合物接触；b)对步骤a)中获得的反应混合物进行扩增反应。
3.根据权利要求1的用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤a)将环糊精与至少一种选自热稳定性DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP和引物的组分接触；b)将含有所述靶核酸或疑似含有所述靶核酸的样品与含有至少一种来自步骤a)的组分的扩增反应混合物接触；c)对步骤b)中获得的反应混合物进行扩增反应。
4.根据权利要求1的用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤a)将所述样品与环糊精接触以获得样品和环糊精的混合物；b)将所述样品和环糊精的混合物与扩增反应混合物接触；c)对步骤b)中获得的反应混合物进行扩增反应。
5.根据权利要求1的用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其包括下述步骤a)将所述样品与扩增反应混合物接触；b)加入至少一种环糊精；c)对步骤b)中获得的反应混合物进行扩增反应。
6.根据权利要求1-5中任一项的用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其中包含在所述反应混合物中的环糊精的浓度为0. l-50mM。
7.根据权利要求1-6中任一项的用于改进样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和 /或特异性的方法，其中所述反应混合物包含0. 01-0. 2单位/ μ 1的热稳定性DNA聚合酶。
8.根据权利要求1-7中任一项的用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其中所述反应混合物至少包含样品、环糊精、热稳定性DNA聚合酶、反应缓冲液、dNTP和至少一种引物。
9.根据权利要求1-8中任一项的用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其中所述环糊精选自下组α-环糊精、β-环糊精、Y-环糊精和它们的衍生物。
10.根据权利要求1-9中任一项的用于改进对样品中靶核酸的扩增反应的产率、灵敏度和/或特异性的方法，其中所述环糊精选自下组单丙二胺-β -环糊精(monopropane diamino-β -eyelodextrin) ,6-0- α -D-麦芽糖基-β环糊精、羟乙基-β -环糊精、羟丙基-β -环糊精和2-羟丙基-β -环糊精。
11.一种用于改进由DNA聚合酶催化的核酸体外合成的特异性和/或产率的方法，包括将单链核酸与DNA合成反应混合物接触，所述DNA合成反应混合物包含DNA聚合酶、引物、 dNTP和至少一种环糊精。
12.根据权利要求11的用于改进由DNA聚合酶催化的核酸体外合成的特异性和/或产率的方法，包括使所述引物退火至所述单链核酸并在所述引物的3’端掺入互补的dNTP。
13.根据权利要求9-12中任一项的用于改进由DNA聚合酶催化的核酸体外合成的特异性和/或产率的方法，其中包含在最终反应混合物中环糊精的浓度为0. l_50mM，所述最终反应混合物包含单链核酸和所述DNA合成反应混合物。
14.一种用于扩增样品中靶核酸的试剂盒，其在同一容器中包含至少一种环糊精和至少一种选自下组的组分热稳定性DNA聚合酶、用于核酸扩增的反应缓冲液、dNTP和寡核苷酸引物。
15.根据权利要求14的用于扩增样品中靶核酸的试剂盒，其在同一容器中或另外的容器中还包含逆转录酶。
16.一种用于扩增样品中靶核酸的组合物，其包含环糊精、热稳定性DNA聚合酶和储存缓冲液。
全文摘要
本发明涉及使用环糊精通过DNA聚合酶进行的体外DNA合成方法。本发明还涉及包含环糊精的方法、组合物和试剂盒以供核酸的扩增。环糊精的使用改善了扩增反应的特异性、灵敏度和/或产率。本发明更具体地涉及包含环糊精的用于进行PCR反应的试剂盒、组合物和方法。
文档编号C12Q1/68GK102317472SQ200980156656
公开日2012年1月11日 申请日期2009年12月14日 优先权日2008年12月12日
发明者A.古鲁卡亚, A.维塔尔, E.科利特, M-C.贝克斯, P.克罗内特 申请人:欧洲基因技术股份有限公司