免疫球蛋白e的特异性核酸配体及其作为过敏性疾病治疗的应用的制作方法

专利名称：免疫球蛋白e的特异性核酸配体及其作为过敏性疾病治疗的应用的制作方法
技术领域：
该发明主要涉及核酸领域，尤其是能够结合免疫球蛋白E(IgE)，用于治疗和诊断过敏性疾病和/或与IgE相关的其他疾病或不适的适体领域。该发明进一步涉及能够结合免疫球蛋白E(IgE)的适体的给药材料和方法。
背景技术：
适体是核酸分子，这类分子除了通过经典的Watson-Crick碱基配对作用以外还通过相互作用对分子有特异的结合亲合力。
适体，像通过噬菌体展示生产的肽或单克隆抗体(mABs)一样，能够特异的结合所选中的靶点并调节靶点活性，例如，通过结合的适体可以阻碍靶点发挥功能活性。从寡核苷酸随机序列库中通过体外筛选方法创建的适体，可以产生一百多种蛋白，其中包括生长因子、转录因子、酶、免疫球蛋白和受体。一个典型的适体，有10-15kDa大小(30-45个核苷)，通过亚纳摩尔米亲合力结合到靶点上，能够排斥密切相关的其它靶点(例如，适体通常不能结合同一个基因族的其它蛋白)。一系列的结构研究表示，适体能够使用同一类型的结合作用(例如，氢键，静电互补，疏水接触，空间排阻)，增强抗原-抗体复合物的特异性和亲合性。
适体在治疗和诊断应用中有很多理想的特性，包括高特异性和高亲合性，生物活性，和极好的药物代谢动力学属性。另外与抗体和其它制剂相比，它们能够提供特异竞争性优势，比如 1)速度和控制 适体可通过完整的体外过程产生，允许迅速产生起始引导物，包括治疗的引导物。体外筛选方法可以严格控制适体的特异性和亲和力，允许生成引导物，包括对有毒的和非免疫原性的引导物。
2)毒性与免疫性 适体已证明是一类少毒性或无毒性或无免疫原性的分子。以小鼠和鸭为实验对象，持续以高剂量适体给药(每天10mg/kg，给药90天)，通过临床、细胞学、生化测定未观察到毒性。然而由于对自身抗体的免疫应答，许多单克隆抗体疗效受到严重限制，很难得到对适体的抗体，最可能的原因是T细胞无法通过MHC递呈适体，免疫应答不能识别核酸片段。
3)给药虽然目前大多数抗体疗法是通过静脉输液(通常超过2-4小时)、适体可皮下注射(以猴科为研究对象，皮下给药，适体生物有效性＞80％，参见(Tucker等人的文献J.Chromatography B.732203-212，1999))给药。这个差异主要是由于抗体相对较低的溶解度，从而需要大量治疗性单克隆抗体mAbs。具有好的溶解度(150mg/mL)和相对低分子量(适体10-50kDa；抗体150kDa)的适体，每周的剂量可以以小于0.5mL的体积注射给药。此外，小分子的适体可以渗透进入不允许抗体或抗体片段渗透的构象收缩区，展现了基于适体治疗或预防的另一优势。
4)可测性和成本治疗性适体是化学合成的，因此容易根据生产的需求进行规模化生产。而目前规模化生产中的困难限制了一些生物制品的生产，并且大型蛋白制品工厂投资巨大，单一大型核苷酸合成仪的产量可达100公斤/年，需要一个相对适度的初期投资。与高度优化的抗体相比，目前适体合成原料的成本以千克规模计算大约500美元/克，随着工艺的不断改进，预计未来五年原料成本降低至小于100美元/克。
5)稳定性治疗性适体显示化学惰性。它们暴露于例如受热或接触到变性试剂等因素后，自身可重新获得活性，适体以冻干粉形式在室温下储存可长达一年以上。
IgE和过敏症 遗传性过敏症具有产生过敏原特异的IgE的遗传倾向，是最重要的诱发哮喘和其他过敏疾病的因素之一。遗传性过敏症疾病，如过敏性鼻炎(花粉症)、哮喘、皮炎在美国普遍流行且发病率日益上升。过敏性疾病的症状包括血管舒张、平滑肌收缩、局部炎症、血管通透性。过敏症的主要特点是环境过敏原刺激IgE水平增高。常见的过敏原包括粪便渣、花粉、食物、动物皮屑、真菌孢子。肥大细胞通过IgE介导释放各种化学介质如组氨酸、三烯、前列腺素，在过敏症的速发相反应中发挥主要作用。T淋巴细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞被认为负责诱导迟发相反应。肥大细胞和接触带有抗原的过敏原特异的IgE的嗜碱性粒细胞引起速发型超敏反应，速发型超敏反应是一个强大的哺乳动物免疫效应系统。这些IgE介导反应能导致疾病，如过敏性鼻炎、异位性皮肤炎、荨麻疹、食物过敏、气喘、而在最严重的情况下，可导致过敏性休克而死亡。
并不是有意受任何理论的约束，过敏介导IgE的反应机制已经被检测。简言之，IgE结合于肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的高亲和性IgE受体的α链，FcεRI。这些细胞类型上的FcεRI是由一条α链，一条β链，γ链同质二聚体组成的四聚体。β链和γ链是FcεRI的信号转导区。结合肥大细胞的IgE的变态合反应刺激FcεRI，激活一批信号转导通路，导致一系列炎性介质和细胞因子的释放，细胞因子包括支气管缩窄性及血管活性物质，如组织胺、白三烯等(见

图1)。IgE、FcεRI和肥大细胞的作用已经在动物过敏反应模型证实IgE加上特异性抗原的系统运输(或仅用抗IgE治疗)引起正常小鼠过敏反应，但在肥大细胞缺陷或FcεRI缺陷的小鼠中立即引发全身反应。
目前一些临床评估的治疗方法干预潜在的致过敏性病理免疫机制，比如，一种抗IgE的免疫球蛋白，它直接靶向于IgE血清抗体，从而抑制速发型超敏反应的主要机制。此外，目前人们的兴趣在于开发过敏原特异性免疫治疗方法，因为它具有治疗过敏症的潜力。但是，无论抗IgE的免疫球蛋白还是过敏原特异性免疫治疗都受到高成本、永久治疗或每个季节治疗的限制。
适体作为一种新型的治疗试剂除了具有前述的优点，还因为适体是核酸，因而能与一些基序结合，这些基序在治疗过敏症及其它免疫性疾病方面具有另人满意的免疫刺激效应。这些基序包括具有免疫调节作用CpG基序，如可以抑制II型T辅助淋巴细胞(TH2)介导的变态反应，研究表明CpG在纯化B淋巴细胞时快速诱导表达T-bet mMA的量(参见Liu等人2003发表在Nature Immun.VoI 4，no.7，p.687-693上的文献)。
因此，获得能够破坏IgE的生物功能的材料和方法将有益于治疗发病机理上与IgE有关的疾病。本发明提供材料和方法以满足这些需求和其它需求。

发明内容
本发明提供治疗，预防和/或减轻过敏症的材料和方法，在一个实施方案中，提供与PEG基团结合的包括以下序列mGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(序列号298)的适体。在一些实施方案中，聚乙二醇(PEG)基团选自由60kDa，40kDa，30kDa和20kDa组成的组。在一些实施方案中，聚乙二醇(PEG)部分区域是分支状的，而在另一些实施方案中是线性的。
在一些特别实施方案中，本发明的适体包括结构如下所示 其中～～～表示接头适体＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(序列号216)
其中mC，mG，mU和mA＝2’-OMe C，2’-OMe G，2’-OMe U和2’-OMe分别dG＝脱氧G，dI＝脱氧次黄嘌呤，s＝硫代磷酸酯骨架取代，和3T＝3’反向脱氧胸腺嘧啶。
在一些实施方案中，本发明的适体包括结构如下所示 其中～～～表示接头适体＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(序列号216)其中mC，mG，mU和mA＝2’-OMe C，2’-OMe G，2’-OMe U和2’-OMe分别dG＝脱氧G，dI＝脱氧次黄嘌呤，s＝硫代磷酸酯骨架取代，和3T＝3’反向脱氧胸腺嘧啶。
在一些实施方案中，本发明的适体包括结构如下所示 其中～～～表示接头适体＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s dGmCmU(序列号298)其中mC，mG，mU和mA＝2’-OMe C，2’-OMe G，2’-OMe U和2’-OMe分别dG＝脱氧G，dI＝脱氧次黄嘌呤，s＝硫代磷酸酯骨架取代，和3T＝3’反向脱氧胸腺嘧啶。
在一些实施方案中，本发明的适体包括结构如下所示 其中～～～表示接头适体＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(序列号298)其中mC，mG，mU和mA＝2’-OMe C，2’-OMe G，2’-OMe U和2’-OMe分别dG＝脱氧G，dI＝脱氧次黄嘌呤，s＝硫代磷酸酯骨架取代，和3T＝3’反向脱氧胸腺嘧啶。
在一些实施方案中，本发明的适体包括一个非烷基接头。在一些实施方案中，本发明的适体包括一个烷基接头。在一些实施方案中，烷基接头包括2到18个连续CH2基团，特别是2至12个连续CH2基团，更特别是3到6个连续CH2。
在一些实施方案中，本发明的适体包括结构如下所示
适体＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(序列号216)其中mC，mG，mU和mA＝2’-OMe C，2’-OMe G，2’-OMe U和2’-OMe分别dG＝脱氧G，dI＝脱氧次黄嘌呤，s＝硫代磷酸酯骨架取代，和3T＝3’反向脱氧胸腺嘧啶。
在一些实施方案中，本发明的适体包括结构如下所示 适体＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(序列号216)其中mC，mG，mU和mA＝2’-OMe C，2’-OMe G，2’-OMe U和2’-OMe分别dG＝脱氧鸟嘌呤，dI＝脱氧次黄嘌呤，s＝硫代磷酸酯骨架取代，和3T＝3’反向脱氧胸腺嘧啶。
在一些实施方案中，本发明的适体包括结构如下所示
适体＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(序列号298)其中mC，mG，mU和mA＝2’-OMe C，2’-OMe G，2’-OMe U和2’-OMe分别dG＝脱氧G，dI＝脱氧次黄嘌呤，s＝硫代磷酸酯骨架取代取代，和3T＝3’反向脱氧胸腺嘧啶。
在一些实施方案中，本发明的适体包括结构如下所示 适体＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(序列号298)其中mC，mG，mU和mA＝2’-OMe C，2’-OMe G，2’-OMe U和2’-OMe分别dG＝脱氧G，dI＝脱氧次黄嘌呤，s＝硫代磷酸酯骨架取代，和3T＝3’反向脱氧胸腺嘧啶。
在一些实施方案中，本发明的适体具有调节特别是抑制IgE或其变异体的功能。在一些实施方案中，本发明的适体在体外抑制IgE或其变异体的功能。在一些实施方案中，本发明的适体在体内抑制IgE或其变异体的功能。在一些实施方案中，本发明的适体抑制IgE结合其受体的能力。在一些实施方案中，提供了治疗预防和/或改善IgE介导的疾病的方法，包括对脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类施用本发明所得适体或其盐。
在一些实施方案中，本发明提供治疗组合物，包括有效剂量的任意上述适体或其盐。在一些实施方案中，治疗组合物可进一步包括药学可接受的载体和稀释剂。
在一个实施方案中，提供了IgE介导的疾病的治疗方法，包括对脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类施用本发明适体，特别是治疗性组合物。在一些实施方案中，治疗的疾病是过敏性疾病。在一些特殊实施方案中，治疗的疾病包括如下过敏性鼻炎、异位性皮肤炎、哮喘，急性荨麻疹，食物过敏，花生过敏，全身过敏，过敏性结膜炎、春季角结膜炎、异位性角结膜炎，巨乳头状结膜炎、嗜酸性胃肠炎。在一特别实施方案中，治疗的疾病是哮喘。
在一些实施方案中，对脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类，使用免疫刺激核酸序列与本发明抗IgE适体联合用药，所述免疫刺激核酸序列比如包括CpG基序的第二适体。
在一些实施方案中，适体给药的方式有皮下给药、鼻腔给药及静脉注射。在特殊的实施方案中，对患有或可能患有过敏症的病人通过皮下给药方式施用治疗组合物。
在一些实施方案中，诊断方法包括将本发明中与PEG连接的适体和疑似包括IgE或其变异体的组合物接触，检测IgE或其衍生物的存在或缺失。在一些实施方案中，提供了用作体外诊断的本发明适体，而在其它一些实施方案中，提供了用作体内诊断的本发明适体。在一些实施方案中，提供了用于治疗、预防和/或改善体内疾病的本发明适体。
在一些实施方案中，特异结合IgE的适体包括的核酸序列对于选自由序列11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96和98-102所组成的组中的任何一个序列都至少有80％的同源性，特别是有90％的同源性，。
在一些实施方案中，特异结合IgE的适体包括的核酸序列对于选自由序列11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50和56-89所组成的组中的任何一个序列都至少有80％的同源性，特别有90％的同源性。
在一些实施方案中，提供了特异结合IgE的适体，所述适体包括的30个比邻的核苷序列与选自由序列号11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50和56-96所组成的组中的任何一个适体酸序列的比邻的30个核苷序列是一样的。在一些特殊的实施方案中，提供了一种适体，所述适体包括的20个比邻的核苷序列，它与这些适体的独特区域的序列20个比邻的核苷序列是一样的序列号11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96，98-102。在更特殊的实施方案中，提供了一种适体，所述适体包括的8个比邻的核苷序列与这些适体的独特区域的序列中的8个比邻核苷序列是一样的序列号11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96，98-102。优选地，包括的8个比邻核苷序列与序列号为11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96，98-102的适体独特区域序列中8个临近核苷序列一致的适体特异地结合IgE，优选人类的IgE，并且在一些实施方案中调节IgE，优选人类IgE的功能。在一些实施方案中，提供了一种适体，所述适体选自由序列号11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96，98-102，119-124，126-136，139-157，158-176，178-190，194-201，206-243，247，249-259，261-267，269-290和292所组成的组。
在一些实施方案中，本发明适体是单链核酸，在一些实施方案中，本发明适体与高分子量，无免疫原性的化合物或亲脂性化合物相连。在一些实施方案中，本发明适体与聚烷基乙二醇基团，尤其是聚乙二醇基团连接。在一些实施方案中，聚乙二醇基团是分枝状的，而在另一些实施方案中是直链的。
在一些实施方案中，本发明适体包括化学修饰，所述化学修饰选自由糖基位点化学取代，磷酸盐位点化学取代，核酸碱基位点化学取代，3’端带有反向核酸序列，5’端带有反向核酸序列所组成的组。在一些实施方案中，本发明适体进一步包括免疫刺激核酸序列，如CpG基序。
在一些实施方案中，本发明适体调节特别是抑制IgE或其变异体的功能。在一些实施方案中，本发明的适体在体外抑制IgE或其变异体的功能。在一些实施方案中，本发明的适体在体内抑制IgE或其变异体的功能。在一些实施方案中，本发明的适体抑制IgE与其受体的结合。在一些实施方案中，治疗，抑制和/或改善IgE介导的疾病的方法包括对脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类施用本发明适体或其盐。
在一些实施方案中，提供了一种治疗组合物，包括有效剂量的本发明适体或它的盐，以及药剂学上可接受性载体和稀释剂。在一些实施方案中，提供了用来治疗预防和/或改善IgE介导的疾病的方法，包括对脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类施用本发明适体，优选本发明治疗组合物。
在本发明一些实施方案中，治疗的疾病是过敏症，尤其是这样一些疾病过敏性鼻炎、异位性皮肤炎、哮喘、急性荨麻疹、食物过敏、花生过敏，全身过敏，过敏性结膜炎、春季角结膜炎、异位性角结膜炎，巨乳头状结膜炎、嗜酸性胃肠炎。
在一些实施方案中，本发明抗IgE适体与免疫刺激核酸序列，比如包括CpG基序的第二适体联合用药，给药对象是脊椎动物，优选哺乳动物、更优选人类。在一些实施方案中，免疫刺激核酸序列并入或附加到本发明抗IgE的适体上。
在一些实施方案中，本发明适体通过皮下给药、鼻腔给药及静脉注射的方式对治疗对象给药。
在一些实施方案中，提供了一种诊断方法，包括将本发明适体与疑似包括IgE或其变异体的组合物接触，检测IgE或其变异体的存在或缺失。在一些实施方案中，提供了用作体外诊断的本发明适体，而在其它实施方案中，提供了用作体内诊断的本发明适体。在一些实施方案中，提供了用于治疗、预防和/或改善体内疾病的本发明适体。
本发明的另一方面，提供增加适体对靶点的结合亲和力的方法，其中，适体能够形成多聚体。在一个实施方案中，此方法包括以下步骤，由阻断集合体形成的核苷取代形成集合体的适体核苷，从而使产生的取代适体对其靶点的结合亲和力相对于母适体的结合亲和力有所增加，母适体含有相同的核苷酸序列但是没有核苷取代。在一些实施方案中，选择的用来防止集合体形成的核苷是修饰核苷。在一些实施方案中，修饰核苷是次黄嘌呤。
本发明的另一方面，提供一种增加适体对靶点亲合力方法，包括以步骤，用次黄嘌呤，在某一位置取代至少一种核苷，相对于母适体对同一靶点的结合亲合性而言，次黄嘌呤取代适体对靶点的结合亲合性有所增加，母适体有相同的核酸序列，但缺少次黄嘌呤修饰。在被提供的方法的一些实施方案中，取代步骤包括，对于四、三、二个核苷而言，取代的次黄嘌呤分别不多于四个、三个、两个，由此而得到的适体相对于母适体而言，增加了对靶点的结合亲合性。在一些实施方案中，次黄嘌呤取代的核苷是嘌呤。在一些特别的实施方案中，次黄嘌呤取代的核苷酸是鸟嘌呤核苷，在其它一些实施方案中，本发明的方法包括选自下列基团的第二个化学取代步骤糖基位点的化学取代，磷酸基位点的化学取代，碱基位点的化学取代。特别是，进一步取代适体的实施方式包括，增加了除缺少二次化学取代的适体之外，与进一步取代适体相一致的适体对靶点的结合亲和性。
在一些实施方案中，取代步骤包括用合适的取代物化学合成适体。
在一些实施方案中，次黄嘌呤取代的适体对靶点的结合亲合性，相对于母适体而言，增加至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少25倍，至少50倍，至少75倍，至少85倍，至少95倍，至少100倍，至少150倍，至少200倍。在一些实施方案中，取代步骤包括化学合成适体。
本发明的一方面，通过本发明取代的方法，提供了一种适体，这种适体对靶点具有增加的结合亲合性。在一特别的实施方案中，适体包括对IgE，尤其是人类的IgE的有增加的结合亲合性。
附图简述 图1是一个IgE介导的信号传递活动示意图。
图2是一个示意图，代表了从由核糖核酸组成的寡聚核苷酸随机序列库中体外筛选适体(SELEXTM)的过程。用于体外筛选适体(SELEXTM)的寡聚核苷酸随机序列库由脱氧核糖核酸组成，反转录及转录步骤被省略。
图3显示一个40kDa的分支状PEG。
图4显示40kDa的已经附着到适体5’末端的分支状PEG。
图5是一个描绘各种PEG化策略的插图，表示了标准单聚乙二醇化、多聚乙二醇化，和通过聚乙二醇化完成的二聚作用。
图6是示意了序列库经过第6轮和第7轮的克隆筛选之后对h-IgE结合能力。
图7显示了对ARC445(序列号101)及其衍生物的直接结合力曲线和结合亲合力，描绘了修饰产物对h-IgE结合能力增加的比例。
图8描绘了抗IgE适体ARC445(序列号101)和其衍生物的离子交换HPLC痕量分析。
图9显示在ARC445(序列号101)中NMM荧光增加，在ARC445衍生物与ARC909-911(序列号191-193)中NMM荧光的降低，ARC909-911包括脱氧鸟嘌呤(dG)的7-脱氮-G取代物。
图10显示在ARC 183中(阳性对照)的增加，在ARC1346中(阴性对照)NMM荧光的降低。
图11显示了与其衍生物比较，ARC445(序列号101)的直接结合曲线，描述了用7-脱氮-G取代脱氧鸟嘌呤(ARC909-911(序列号191-193))明显的减少了与h-IgE结合的比例。
图12表示了与ARC1384(序列号181)，包括2′-氧-甲基和硫代硫酸盐取代物，但没有dG的次黄嘌呤取代物(序列号101)的ARC445衍生物相比较，以下适体在NMM荧光中降低ARC445衍生物ARC 1641，1642，和1666(序列号分别是212，213，和216)，它们包括dG的次黄嘌呤取代物。
图13是一种结构示意图预测rRfY，dRmY和DNA最小化适体的二级结构，DNA最小化适体表明IgE:FcεR1之间的最高结合力，该力受到FACS的抑制。图13(A)显示根据序列号91的rRfY克隆，残基是2′-F，图13(B)显示ARC445(序列号101)，一个rRfY克隆，黑色残基是2′-脱氧，灰色残基是2’-OMe，图13(C)显示ARC475(序列号151)，DNA克隆，下划线是灰色残基是2′-脱氧。
图14显示SX38细胞中，ARC445(序列号101)和ARC656(序列号157)阻碍h-IgE诱导组氨酸的释放。
图15A描述存在于人类和小鼠血浆中作为孵育功能的ARC1384和ARC1666全长的百分率。图15B描述存在于人类和小鼠血浆中作为孵育功能的ARC1384，ARC1572和ARC1573全长的百分率。
图16是表格，给出对小鼠静脉给药10毫克/公斤后PEG化抗-IgE适体ARC1785(序列号295)，ARC1787(序列号293)，ARC1788(序列号294)，和ARC1790(序列号296)的药代动力学设计。
图17是对小鼠静脉(IV)给药10毫克/公斤后，PEG化抗-IgE适体ARC1785(序列号295)，ARC1787(序列号293)，ARC1788(序列号294)，ARC1790(序列号296)的药代动力学图形。
图18是对小鼠皮下给药10毫克/公斤后，PEG化抗-IgE适体ARC1785(序列号295)，ARC1787(序列号293)，ARC1788(序列号294)，和ARC1790(序列号296)的药代动力学研究设计概括表格。
图19是对小鼠皮下(SC)给药10毫克/公斤后，PEG化抗-IgE适体ARC 1785(序列号295)，ARC1787(序列号293)，ARC1788(序列号294)和ARC1790(序列号296)的药代动力学图。
图20是一个表，总结了对小鼠静脉(IV)和皮下(SC)给药10毫克/公斤后，PEG化抗-IgE适体ARC1785(序列号295)，ARC1787(序列号293)，ARC1788(序列号294)和ARC1790(序列号296)的非划分PK参数估计。
具体实施例方式本发明一个或一个以上实施方案的细节在下面进行了完整的描述。虽然任何与这里描述的相似或相同的方法或材料可以用于实现或检测本发明，但这里描述的是优选的方法和材料。本发明的其他特点，对象和优点从说明书中显而易见。在说明书中，除非文意另有明确指出，单数形式也包括复数的形式。除非另有规定，这里使用的所有科学技术名词与本发明所属技术领域普通技术人员的通常理解具有同等的意义。如果发生冲突，以本说明书的解释为准。
SELEXTM方法 生成适体的一种合适的方法是被命名为″指数富集的配体系统进化″(″SELEXTM″)的过程，在图2中主要描述了该方法的核糖核酸筛选(使用脱氧核糖核酸序列库的筛选，图2中省略掉反转录和转录步骤的描述)。SELEXTM过程是一种与靶分子有高特异结合能力的核酸分子体外进化的方法，在文献，例如1990年6月11日提交，现已放弃的美国专利申请第07/536,428号，美国第5,475,096号名为“核酸配体”的专利和美国第5,270,163号(也可参见WO91/19813)名为″核酸配体″专利中所述。每种SELEXTM鉴定的核酸配体，如每种适体，都是给定靶点化合物或分子的一种特异配体。SELEXTM过程是基于这样一种独特观点，即核酸足够能形成多种二维或三维结构，且其单体具有足够的多功能性，可以用作几乎各种化学化合物，不管是单体还是聚合体的配体。任何大小的分子或组合物都可作为靶点。
SELEXTM依赖于包括随机核酸序列的单链寡核苷酸库上的起始点。寡核苷酸可以是被修饰或未被修饰的DNA，MA或DNA/MA杂和体。在一些实施方案中，核苷酸库包括100％随机或部分随机的寡核苷酸。在另一些实施例中，核苷酸库包括的随机或部分随机寡核苷酸中含有至少一个被加入到随机化序列中的固定序列和/或保守序列。在另一些实施例中，核苷酸库包括的随机或部分随机寡核苷酸在5’和/或3’端含有至少一个固定序列和/或保守序列，在该固定序列或保守序列中含有与寡核苷酸库中其他分子相同的序列。固定序列是寡核苷酸库中的常见序列，在寡核苷酸库中加入固定序列是为了实现预筛选目的，如下面进一步描述的CpG基序，PCR引物杂交位点，MA聚合酶启动子序列(如T3，T4，T7和SP6)，限制位点，或例如聚A或聚T尾的同聚序列，催化核心，选择性结合亲和柱的位点，和其他便于寡核苷酸克隆的序列和/或与之有利害关系的序列测序。保守序列是一种与上述的固定序列不同的序列，是许多能与同一靶点结合适体的共有序列。
序列库中的寡核苷酸优选地包括随机化序列部分和有效扩增所必需的固定序列。典型的，起始序列库的寡核苷酸包含固定的5′和3′末端序列，所述末端序列在内部区域与30-50随机核苷侧面相接。这个随机化的核苷可通过多种方法产生，包括化学合成和从随机被清除的核酸中的大小筛选。检测核酸的序列变化可在反复筛选/扩增之前或之中通过突变被引入或增加。
寡核苷酸的随机序列部分可以是任意长度，并且可包括核苷酸和/或脱氧核苷酸，还可包括修饰或非天然核苷或核苷类似物。参见美国专利第5,958,691号；美国专利第5,660,985号；美国专利第5,958,691号；美国专利第5,698,687号；美国专利第5,817,635号；美国专利第5,672,695号；和PCT刊物WO92/07065号。使用本领域已知的固相寡核苷酸合成技术从磷酸二脂键连接的核苷中合成随机寡核苷酸。参见Froehler等人在Nucl Acid Res.145399-5467(1986)上发表的文献和Froehler等人在Tet.Lett.275575-5578(1986)上发表的文献。也可使用溶液方法如三酯合成法合成随机寡核苷酸。参见例如Sood等人在Nucl.Acid Res.42557(1977)上发表的文献和Hirose等人在Tet.Lett.，282449(1978)上发表的文献。在自动DNA合成仪器中进行的经典合成产生了1014-1016个独立的分子，数量上足够进行大多数SELEXTM实验。序列设计中随机序列足够大的区域增加了每个被合成分子代表特异序列的可能。
通过在DNA合成仪上自动化学合成寡核苷酸起始序列库。为了合成随机化序列，在合成过程中，在每个核苷填加步骤中加入四种核苷的混合物，使得核苷加入随机化。如上所述，在一种实施方案中，随机寡核苷酸包括全部的随机序列；但是在其他实施方案中，随机寡核苷酸包括非随机或部分随机序列的延长链。部分随机序列可通过在每个添加步骤中加入不同比率的四种核苷而合成。
寡核苷酸起始序列库可能是MA，DNA或MA/DNA杂和体。在MA库作为起始序列库的情况下，MA库通常是通过的T7 MA聚合酶或经修饰的T7 MA聚合酶在过体外转录DNA并纯化而获得的。然后，MA或DNA库与靶点在适宜于结合的条件下混合，并使用同样的筛选方案经过反复的结合，分离或扩增以符合结合亲和力和选择性的理想标准。更具体的，当以包含核酸起始序列库的混合物开始时，SELEXTM方法包括步骤(a)混合物与靶点在适宜于结合的条件下接触(b)从与靶分子特异结合的核酸中分离出未结合核酸；(c)分离核酸-靶点复合物；(d)扩增从核酸-靶点复合物分离出的核酸，产生富集配体的核酸混合物；(e)多次循环重复结合，分开，分离，和扩增步骤以产生对靶分子具有高特异性高亲和力的核酸配体。在MA适体被筛选的情况下，SELEXTM进一步包括步骤(i)步骤(d)中的扩增之前，反转录从核酸-靶点复合物中分离出的核酸；(ii)重新开始过程之前转录步骤(d)中扩增的核酸。
在含有许多可能序列和结构的核酸混合物中，对给定的靶点的结合力在一个很大的范围内。如包括20个核苷的随机化片段的核酸混合物，有420种可能。对靶点有较高亲和力常数的最可能结合到靶点上。分开，分裂和扩增之后，产生了又一核酸混合物，富集于较高亲和力的核酸。另外进行几轮筛选进一步优化最适配体直到产生的核酸混合物主要由一个或少数序列组成。这些核酸作为纯配体或适体可被克隆，测序并逐个检测其结合亲和力。
重复筛选和扩增循环直到达到所需目的。在最常规的情况下，重复筛选/扩增，一直到循环所得物的结合强度没有明显的改善为止。这种方法典型的用于接近1014个不同核酸种类的样品，也用于1018个不同的核酸种类的样品。通常，核酸适体要经过5-20轮筛选。在一种实施方案中，异质只是在初始的筛选阶段被引入，并不是在整个复制过程中都发生。
SELEXTM的一种实施方案中，筛选过程对分离那些与选定靶点有最强结合能力的核酸配体非常有效，因此只需要一个筛选或扩增循环。这种有效的筛选可能发生在例如色谱分析过程，其中，核酸与柱上固定的靶点有结合能力，通过这种操作方式，柱子有效的分开或分离具有最高亲和力的核酸配体。
在很多情况下，并不需要进行SELEXTM的重复步骤直到鉴定出单一的核酸配体。靶特异核酸配体溶液可能包括核酸结构或基序族，在此族中有很多保守序列和许多可被替换或增加而不明显影响核酸配体和靶点结合的序列。提前结束SELEXTM过程，确定核酸配体溶液家族中许多成员的序列是可能的。
已知存在多种多样的核酸一级结构，二级结构和三级结构。非Watson-Crick型相互作用最常见的结构或基序被称为发夹环，对称或不对称的凸出，假扭结结构和无数相同结构的结合。几乎所有含有这种基序的情况都表明他们可在不超过30核苷的核酸序列内形成。因此，伴有相邻随机化片段的SELEXTM优选由20-50个核苷的随机化片段引发。在一些实施方案中是由30大约40个核苷引发。在一个实施例中，5′被固定随机3′被固定的序列包含大约30-50核苷的随机序列。
核心SELEXTM方法被修改以获得许多特异目标。例如，美国专利第5,707,796号描述了联合使用SELEXTM和凝胶电泳筛选结构特异的核酸分子，如，弯曲DNA。美国专利第5,763,177号；描述了基于SELEXTM的方法，筛选含有反应基团的核酸配体，该反应基团能结合靶分子，和/或交叉连接到靶分子，和/或激活靶分子。美国专利第5,567,588号和第5,861,254描述了基于SELEXTM的方法，高效分离与靶点有高亲和力和低亲和力的寡核苷酸。美国专利第5,496,938描述了SELEXTM过程进行之后获取改进核酸配体的方法。美国专利第5,705,337号描述了将配体共价结合靶点的方法。
SELEXTM可用于获得与靶分子有一个以上结合位点的核酸配体，和获得包括非核酸类与靶点结合的核酸配体。SELEXTM提供了用于分离和鉴定能与任何可预见靶点结合的核酸配体的方法，所述可预见靶点包括大或小的生物分子，如核酸结合蛋白和未知的作为它们部分生物功能的蛋白质以及协同因子和小分子。如，美国专利第5,580,737号揭示了通过SELEXTM鉴定的核酸序列，SELEXTM能高亲和力的结合到咖啡因并与类似物，如茶碱密切相关。
Counter-SELEXTM是一种通过减少能与一个或多个非靶点分子发生交叉反应的核酸配体序列从而改进核酸配体和靶点特异性的方法。Counter-SELEXTM的步骤包括步骤(a)制备核酸侯选混合物(b)侯选混合物与靶点结合，其中相对于侯选混合物，对靶点有增加的亲和力的核酸，可能从侯选混合物的剩余物中分离出来；(c)从候选混合物的剩余物中分离出亲和力增加的核酸；(d)从靶点中分离出亲和力增加的核酸；(e)将亲和力增加的核酸与一个或一个以上非靶分子相互接触，对非靶点分子有特异亲和力的核酸配体可被清除掉；和(f)扩增只对靶分子有特异亲和力的核酸产生核酸混合物，富集于对靶分子有相对较高亲和力和特异性的核酸序列。如上述对SELEXTM的描述，筛选和扩增的循环数不断被重复直到达到目的。
使用核酸作为药物和疫苗遇到的一个可能问题是磷酸酯形式的寡核苷酸在显示作用前，在体液中可被细胞内酶和细胞外酶如核核酸内切酶和核酸外切酶迅速降解。因此SELEXTM方法包括含有修饰核苷的高亲和力核酸配体的鉴定，所述修饰核苷能改变配体特性，比如改变了体内稳定性或改善运输特性。这种修饰的例子包括核糖和/或磷酸和/或碱基的化学取代。SELEXTM鉴定含有修饰核苷的核酸配体都有描述，如在美国专利第5,660,985号中描述到的寡核苷酸含有在核糖2’位，嘧啶5位，嘌呤8位化学修饰的核苷衍生物，在美国专利第5,756,703号中描述的寡核苷酸包含了嘧啶2’位的各种修饰，在美国专利第5,580,737号中描述的寡核苷酸能是高亲和力的特异核酸配体含有一个或多个2’-氨基(2′-NH2)，2’-氟(2′-F)和/或2’-OMe(2′-OMe)的核苷修饰 本发明中预期核酸配体的修饰包括，但不限于，那些能够提供其他化学基团的修饰，这些化学基团能增加核酸配体碱基或核酸配体整体额外电荷，极化性，疏水性，氢键，静电作用和流动性。产生抗核酸酶的寡核苷酸混合物的修饰包括一个或多个核苷间连接的取代，修饰的糖基，修饰的碱基，或它们的组合。这种修饰包括，但不限于，2′位糖修饰，5-位嘧啶修饰。8-位嘌呤修饰，环外氨基修饰，4-硫尿(嘧啶核)苷取代修饰，5-溴或5-碘尿嘧啶修饰；骨架修饰，硫代磷酸或烷基磷酸盐修饰，甲基化物，和非正常碱基对组合如等碱基异胞苷和异鸟粪素。修饰还包括3’和5’修饰如帽子。
在一种实施方案中，提供的寡核苷酸中P(O)O基团被P(O)S(″硫代″)，P(S)S(″丁酰胺″)，P(O)NR2(″乙咪酯″)，P(O)R，P(O)OR′，CO或CH2(″甲酰基″)或3′-氨基(-NH-CH2-CH2-)取代，其中R或R′是单独的H或被替换的或未被替换的烷基。连接基团可通过-O-，-N-，或-S-联接接连接到临近的核苷。并不是寡核苷酸中所有的联接都需要相同。
在进一步的实施方案中，寡核苷酸包括修饰的糖基，如，一个或一个以上羟基被卤素基团，脂肪族基团或有酯或氨基功能的基团所取代。在一个实施方案中，2′位的呋喃糖残基被O-甲基，O-烷基，O-烯基，S-烷基，S-烯基，或卤素基团任意一个取代。2′修饰的糖的合成方法在例如，即，Sproat，等人的文献Nucl.Acid Res.19733-738(1991)；cotton等人的文献Nucl.Acid Res.192629-2635(1991)和Hobbs等人的文献Biochemistry 125138-5145(1973)中进行了描述。另一些修饰对本领域普通技术人员是已知的。这种修饰可能是pre-SELEXTM过程修饰或post-SELEXTM过程修饰(前面鉴定未修饰配体的修饰)或通过向SELEXTM中加入修饰。
Pre-SELEXTM过程的修饰作用和向SELEXTM过程加入的修饰作用产生的核酸配体对SELEXTM靶点有特异亲和力，和改善了的稳定性，如在体内的稳定性。对核酸配体Post-SELEXTM过程修饰也可能改善稳定性，如体内稳定性，而且对核酸配体结合能力没有负面影响。
SELEXTM方法将筛选的寡核苷酸与其他筛选的寡核苷酸和非寡核苷酸功能单位连接起来，如在美国专利第5,637,459号和第5,683,867号中描述。The SELEXTM方法进一步包括将筛选的核酸配合和诊断或治疗中的亲脂的或非免疫原性的高分子化合物连接起来，如美国专利第6,011,020号和第6,051,698号和PCT刊物第WO98/18480号中叙述。这些专利和申请指导我们各种形状和特性的结合，结合寡核苷酸有效扩增和复制的特性，和其他分子的理想特性。
通过SELEXTM方法对小灵活肽核酸配体的鉴定也进行了研究。小肽有灵活的结构通常在溶液中以多种结构的平衡状态存在，因此起初认为由于结合灵活肽而减小的构象熵会限制结合亲和力。但是在溶液中鉴定小肽核酸配体的可行性在美国专利第5,648,214号中有说明。在这项专利中，鉴定出了底物P，一种11氨基酸多肽的高亲和力MA核酸配体。
对本发明靶点有特异性和高亲和结合力的适体通过这里描述的SELEXTM过程进行筛选。然后，作为SELEX过程的一部分，筛选出的结合靶点的适体任选的最小化以确定有理想结合亲和力的小序列。被选出的序列和/或最小化的序列通过随机或定点突变任选的进行修饰以增加结合亲和力或确定序列中结合活性的必需序列。另外，通过加入修饰核苷进行筛选以使适体分子对体内的降解更稳定。
2’修饰的SELEXTM 为了使适体适合用作治疗，优选廉价合成适体，并使其在体内的安全和稳定。由于他们的敏感性，易被核酸酶降解，野生型MA和脱氧核糖核酸适体在体内通常并不稳定。通过修饰2’位可大大增加抗核酸降解的能力。
氟基和氨基已成功并入寡核苷酸库中，随后从此寡核苷酸库中筛选适体。但是，这些修饰费用大大增加由此合成的适体的成本。同时，因为在修饰寡核苷酸的降解和随后将苷酸作为DNA合成的底物的过程中，修饰寡核苷酸可能被循环进入宿主DNA同，从而引起在某些情况下的安全问题。
这里提供的含有2′-氧-甲基(″2′-OMe″)核苷的适体克服了上述很多弊端。含有2’-氧-甲基核苷的寡核苷酸可抵制核酶降解，廉价合成。虽然2’-氧-甲基核苷在生物系统中普遍存在，天然聚合酶在生理条件下不接受2’-氧-甲基NTPs作为底物，因此对循环的2’-氧-甲基核苷酸进入宿主的DNA后，没有安全上的顾虑。产生2′-修饰适体的SELEX方法已作描述，例如，2002年12月3日提出的美国临时专利申请编号第60/430,761号，2003年7月15日提出的美国临时专利申请编号60/487,474；2003年11月4日提出的美国临时专利申请编号60/517,039；美国专利申请编号10/729,581；2004年7月21日提出的美国临时专利申请编10/873,856标题″体外筛选2′-氧-甲基取代核酸的方法″，这里提到的每个专利通过在此引证全部并入本文。
本发明包括可结合到IgE和调节IgE功能的适体，其中IgE能包含修饰的核苷(如有2′位修饰)，从而使寡聚核苷酸比未修饰的寡核苷酸在酶降解、化学降解、热降解和物理降解方面更稳定。虽然文献里有一些包含2′-OMe适体的例子(参见，例如，Green等人在Current Biology 2，683-695，1995上发表的文献)，这些都是通过修饰转录混合物体外筛选产生的，修饰混合物中C和U残基是2’-氟(2′-F)取代的，A和G残基是2′-OH。一旦每个功能序列都被鉴定出，测试每个A和G残基对2′-Ome取代的耐受力，重新合成的适体，所述适体含有的所有A和G作为2’-氧-甲基残基能容受2’-氧-甲基取代。大多数两步法生成的A和G残基能容受2’-氧-甲基残基的取代，尽管平均20％不能容受。因此这种方法产生的适体一般含有2-4个2′-OH残基，因此合成的稳定性和成本比较恰当。通过向产生稳定化处理寡核苷酸的转录反应中加入修饰核苷，本发明的方法减少了稳定化处理被筛选适体寡核苷酸的必要(例如，通过使用修饰核苷重新合成适体寡核苷酸)，稳定化处理的寡核苷酸用于使用SELEX筛选和富集的寡核苷酸转录混合物(和/或其衍生物或改进产物，包括在此描述的这些适体)。
在实施方案中，本发明提供由2′-OH，2′-F，2′-脱氧和2’-OMe修饰的ATP，GTP，CTP，TTP以及UTP核苷酸的混合物组成的适体。在另一些实施方案中，本发明提供由2′-OH，2′-F，2′-脱氧，2′-OMe，2′-NH2，和2′-甲基修饰的ATP，GTP，CTP，TTP以及UTP核苷酸的混合物组成的适体。在另一个实施方案中，本发明提供由56个2′-OH，2′-F，2′-脱氧，2′-OMe，2′-NH2和2′-甲基修饰的ATP，GTP，CTP，TTP以及UTP核苷酸混合物组成的适体。
发明的2′修饰适体是由经修饰过的聚合酶创建的，如，经修饰过的T7聚合酶能结合呋喃糖2′位被大量取代的修饰碱基，其结合速率比野生型聚合酶高。例如，突变体T7聚合酶(Y639F)的639位的酪氨酸残基突变为苯丙氨酸，该酶很容易利用2′-脱氧，2′-氨基和2′-氟-核苷三磷酸作为底物，已被广泛应用于合成修饰MAs，开拓了广阔的应用前景。但是，据现有报道，这种突变体T7聚合酶还不能利用(即，并入)2′位被2′-OMe或2′-叠氮(2′-N3)大量取代的核苷三磷酸作为底物。突变体T7聚合酶(Y639F/H784A)，除了发生上述Y639F突变外，还在784位组氨酸突变为丙氨酸残基。该酶已被用于限制条件下嘧啶核苷三磷酸的结合。参见Padilla，R.和Sousa，R.的文献Nucleic Acids Res.，2002，30(24)138.描述了突变体T7聚合酶(H784A)在784位将组氨酸突变为丙氨酸残基。Padilla等人Nucleic Acids Research，2002，30138。突变体T7聚合酶Y639F/H784A和H784A在其突变位点都变为更小的氨基酸残基。正是这种变化使其结合了更多的核苷底物，如2’-OMe取代的核苷酸底物。
通常，在此公开的条件下，Y693F突变体可用于结合2’-OMe取代的除GTP外核苷三磷酸NTPs，Y639F/H784A突变体可用于所有2’-OMe取代的包括GTP在内的NTPs。可以预见，在此公开的条件下，突变体H784A与Y639F和突变体Y639F/H784A性质相似。
2′修饰的寡核苷可完全由经过修饰的核苷合成或用一部分经修饰过核苷的合成。修饰可相同的可不同的。所有的核苷均可被修饰，所有的核苷都可能含有相同的修饰。所有的核苷均可被修饰，但包含不同的修饰，比如，所有含有相同碱基的核苷都只有一种修饰，而含有其他碱基的核苷则可能有其他的类型的修饰。所有的嘌呤核苷可能只有一种类型的修饰(或不被修饰)，而所有的嘧啶核苷酸则含有另外类型的修饰，或没有被修饰。这样，转录进行或转录产物的形成的过程中，可以利用任何修饰组合，例如包括嘧啶核苷(2′-OH)，脱氧嘧啶核苷(2′-脱氧)，2′-F和2′-氧甲基核苷。包含2’-OMe C和U与2′-OH A和G的转录混合物被称为″rRmY″复合物，被其选择的适体因而称为″rRmY″适体。包含脱氧A和G与2′-OMe U和C的转录复合物被命名为″dRmY″复合物，相应的被选择适体命名为″dRmY″适体。包含2′-OMe A，C，和U与2′-OH G的转录复合物被命名为″rGmH″复合物，相应的被选择适体命名为″rGmH″适体。包含2′-OMeA，C，U和G与2′-OMe A，U和C以及2′-F G的转录复合物被命名为″备选混合物″，相应的被选择适体命名为″备选混合物适体″。包含2′-OMe A，U，C，和G，其中10％以上的核苷酸是G′s，转录复合物被命名为″r/mGmH″复合物，相应的被选择适体命名为″r/mGmH″适体。包含2′-OMe A，U，和C与2′-F G的转录复合物被命名为″fGmH″复合物，相应的被选择适体命名为″fGmH″适体。包含2′-OMe A，U和C与脱氧G的转录复合物被命名为″dGmH″复合物，相应的被选择适体命名为″dGmH″适体。包含脱氧A与2′-OMe C，G和U的转录复合物被命名为″dAmB″复合物，相应的被选择适体命名为″dAmB″适体。只包含2′-OH核苷的转录复合物被命名为″m″复合物，相应的被选择适体命名为″m″或″rRrY″适体。″mRmY″适体则是只包含2′-O-甲基核苷，通常从r/mGmH寡核苷由post-SELEXTM置换而获得，也可以将2′-OH Gs用2′-OMe Gs取代来获得。
优选的实施方案包括任何组合的2′-OH，2′-脱氧和2′-OMe核苷。较好优选实施方案包括任何组合2′-脱氧和2′-OMe核苷。更优选实施方案包括任何组合的2′-脱氧，和2′-OMe核苷，其中嘧啶2′-OMe如(dRmY，mRmY或dGmH)。
在筛选过程之前(如，pre-SELEXTM过程修饰)要完成修饰碱基与发明中适体的结合。另外，在pre-SELEXTM修饰过程中与修饰碱基相结合的本发明的适体还可以通过post-SELEXTM修饰过程进一步修饰(如pre-SELEXTM修饰之后post-SELEXTM过程修饰)。Pre-SELEXTM产生特异结合于SELEXTM靶点的经修饰过的核酸配体，并且改进了在体内的稳定性。Post-SELEXTM过程修饰(对先前鉴定的含有通过pre-SELEXTM过程修饰加入的的核苷的配体进行切断，敲除，替换或添加核苷修饰)进一步改进了在体内的稳定性，而并不严重影响含有通过pre-SELEXTM过程修饰结合的核苷的核酸配体结合容量。
在聚合酶接受2′位修饰的NTPs的条件下，为了获得2′位修饰(例如2′-OMe)的MA转录产物，优选聚合酶是Y693F/H784A突变体或Y693F突变体。另外一些聚合酶，尤其是能耐受2′位大量被取代的聚合酶也可用于本发明。通过检测在此公开的转录条件下结合修饰核苷的能力可以获得这些聚合酶的结合能力。
有许多因素被确定为对在此公开的方法使用的转录条件有重要作用。比如当前导序列与在DNA转录模板5′末端的固定序列结合后，观察到经修饰的转录产量增加，合成的转录物至少前6个残基都是嘌呤。
影响获得结合修饰核苷转录物的另一个重要因素是2′-OH GT的存在或其浓度。转录可以分为两个阶段第一个阶段是起始，在此阶段，NTP加入到GTP的3′-羟氧基端(或另一个取代鸟苷)生成二核苷酸，之后延伸为10-12个核苷；第二阶段是延长，在此阶段，转录产物远远超过最开始加入的10-12个核苷。加入到含有过量2’-氧-甲基GTP的转录复合物中的少量的2’-氧-甲基GTP足可使聚合酶引发2′-OH GTP参与的转录，但当转录进入延长阶段，由于2’-氧-甲基和2′-OH GTP的差别减弱，2’-氧-甲基GTP多于2′-OH GTP，使得转录结合的主要是2’-氧-甲基GTP。
影响2’-氧-甲基取代核苷渗入转录物的另一个重要因素是转录混合物中的二价镁和锰。已有发现氯化镁和氯化锰以不同的浓度组合影响2′-氧-甲基转录的产量，氯化镁和锰的最适浓度取决于其在含有二价金属离子以NTPs转录反应混合物的浓度。为了获取2′取代的氧甲基化转录物的最大产量(即所有的A，C和U和大约90％G核苷)，当每种NTP的浓度是0.5mM时，优选的氯化镁的浓度大约是5mM，而优选的氯化锰的浓度大约是1.5mM。当每种NTP的浓度是1..0mM时，优选的氯化镁的浓度大约是6.5mM，而优选的氯化锰的浓度大约是2.0mM。当每种NTP的浓度是2.0mM时，优选的氯化镁的浓度大约是9.6mM，而优选的氯化锰的浓度大约是2.9mM。在任何情况下，非二倍浓度的情况下仍然能显著提高修饰转录产物的量。
GMP或鸟苷引发的转录也很重要。这种效应是由于聚合酶对起始核苷的特异性引起的。因而这种方式产生的任何转录的5′-末端核苷都可能是2′-OH G。GMP或鸟苷的优选浓度是0.5mM，甚至更优选浓度1mM。还发现在转录反应中，含有PEG最好是PEG-8000，有利于最大程度的结合修饰核苷。
为使2′-氧甲基ATP(100％)，UTP(100％)，CTP(100％)和GTP(～90％)(″r/mGmH″)最大程度结合到转录物中，下为优选条件HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl25mM(6.5mM其中每种2′-OMe NTP的浓度是1.0mM)，MnCl2 1.5mM(2.0 mM其中每种2’-氧-甲基NTP的浓度是1.0mM)，2’-氧-甲基NTP(每种)500μM(更优选是1.0mM)，2′-OH GTP 30μM，2′-OH GMP 500μM，pH7.5，Y639F/H784A T7 MA聚合酶15units/mL，无机焦磷酸酶5units/mL，至少8个核苷长的全嘌呤引导序列。在此使用的一个单位的Y639F/H784A突变体T7 MA聚合酶(或在此特定任何其他T7 MA聚合酶)定义为1nmole2′-氧甲基NTPs结合如转录物中所需要的酶的量。在此使用的一单位的无机磷酸酶定义为在pH7.2和25℃条件下释放每分钟释放1.0摩尔无机磷酸盐所需要酶的量。
为了使2′-氧甲基ATP，UTP和CTP(″rGmH″)最大程度结合到转录物中，下为优选条件HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，TritonX-1000.01％(w/v)，MgCl25mM(9.6mM当每种2’-氧-甲基NTP的浓度是2.0mM)，MnCl21.5mM(2.9mM当每种2′-OMeNTP的浓度是2.0mM)，2’-氧-甲基NTP(每种)500μM(更优选2.0mM)，pH7.5，Y639F T7 MA聚合酶15units/ml，无机磷酸酶5units/mL，至少8个核苷长的全嘌呤引导序列。
为了使2′-氧甲基UTP和CTP(″rRmY″)最大程度结合入转录物种，下列为优选条件HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，Triton X-1000.01％(w/v)，MgCl25mM(9.6mM当每种2’-氧-甲基NTP的浓度是2.0mM)，MnCl21.5mM(2.9mM当每种2’-氧-甲基NTP的浓度是2.0mM)，2′-OMe NTP(每种)500μM(2.0mM更佳)，pH7.5，Y639F/H784A T7 MA聚合酶15units/mL，无机磷酸酶5units/mL，至少8个核苷长的全嘌呤引导序列。
为了使脱氧ATP和GTP和2′-氧甲基UTP和CTP(″dRmY″)100％最大结合到转录物中，优选以下条件HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，精胺2mM，亚精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl29.6mM，MnCl22.9mM，2’-氧-甲基NTP(每种)2.0mM，pH7.5，Y639F T7 MA聚合酶15units/mL，无机磷酸酶5units/mL，至少8个核苷长的全嘌呤引导序列。
为了使脱氧2′-氧甲基ATP，UTP和CTP和2′-FGTP(″fGmH″)100％最大结合到转录物中，优选以下条件HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-8000 10％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl29.6mM，MnCl2 2.9mM，2′-OMe NTP(每种)2.0mM，pH7.5，Y639F T7 MA聚合酶15units/mL，无机磷酸酶5units/mL，至少8个核苷长的全嘌呤引导序列。
为了使脱氧脱氧ATP，2′-氧甲基UTP和GTP和CTP(″dAmB″)100％最大结合到转录物中，优选以下条件HEPES缓冲液200mM，DTT 40mM，亚精胺2mM，PEG-800010％(w/v)，Triton X-100 0.01％(w/v)，MgCl29.6mM，MnCl2 2.9mM，2’-氧-甲基NTP(每种)2.0mM，pH7.5，Y639F T7 MA聚合酶15units/mL，无机磷酸酶5units/mL，至少含有8个核苷的全嘌呤引导序列。
对于上述每种情况(a)转录优选在20℃到50℃，优选于30℃到45℃，更优选37℃进行至少两个小时(b)50-300nM的双链DNA转录模板被使用(在第一轮反应中使用200nM模板用以增加多样性(300nM的模板用于dRmY转录))，在随后几轮反应中大约50nM，以1/10的比例稀释用来优化PCR反应，使用在此所述的条件。优选DNA转录模板如下(其中ARC254和ARC256在全2′-氧甲基的条件下转录而ARC255在rRmY的条件下转录)。
SEQ ID NO 1 ARC2545’-CATCGATGCTAGTCGTAACGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’SEQ ID NO 2 ARC2555’-CATGCATCGCGACTGACTAGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’SEQ ID NO 3 ARC2565’-CATCGATCGATCGATCGACAGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’
在本发明m转录条件下，转录反应混合物由2′-OH腺苷三磷酸(ATP)，2′-0H鸟苷三磷酸(GTP)，2′-OH胞苷三磷酸(CTP)和2′-OH尿苷三磷酸(UTP)组成。使用本发明中m转录混合物产生的修饰寡核苷酸完全由2′-OH腺苷，2′-OH鸟苷，2′-OH胞啶，2′-OH尿苷组成。在m转录优选实施方案中，本发明产生的修饰寡核苷酸组成一个序列，至少80％的腺苷是是2′-OH腺苷，至少80％的鸟苷是2′-OH鸟苷，至少80％的胞苷是是2′-OH胞苷，至少80％的尿苷是是2′-OH尿苷。m转录更优选实施方案中，本发明产生的修饰寡核苷酸组成一个序列，至少90％的腺苷是2′-OH腺苷，至少90％的鸟苷是2′-OH鸟苷，至少90％的胞苷是是2′-OH胞苷，至少90％的尿苷是是2′-OH尿苷。在m转录的更优选实施方案中，产生的修饰寡核苷酸组成一个序列，该序列至少100％的腺苷是是2′-OH腺苷，至少100％的鸟苷是2′-OH鸟苷，至少100％的胞苷是是2′-OH胞苷，至少100％的尿苷是是2′-OH尿苷。
本发明rRmY转录条件下，转录反应混合物由2′-OH腺苷三磷酸(ATP)，2′-OH鸟苷三磷酸(GTP)，2′-氧-甲基胞苷三磷酸(CTP)和2′-氧-甲基尿苷三磷酸(UTP)组成。由本发明中由rRmY转录混合物中产生的修饰寡核苷酸完全由2′-OH腺苷，2′-OH鸟苷，2′-氧-甲基胞苷，2′-氧-甲基尿苷组成。优选实施方案产生的修饰寡核苷酸组成一个序列，该序列至少80％的腺苷是是2′-OH腺苷，至少80％的鸟苷是2′-OH鸟苷，至少80％的胞苷是是2′--氧-甲基胞苷，至少80％的尿苷是是2′--氧-甲基尿苷。更优选实施方案中，产生的修饰寡核苷酸组成一个序列，至少90％的腺苷是是2′-OH腺苷，至少90％的鸟苷是2′-OH鸟苷，至少90％的胞苷是是2′--氧-甲基胞苷，至少90％的尿苷是是2′--氧-甲基尿苷。m转录的更优选实施方案中，产生的修饰寡核苷酸组成一个序列，至少100％的腺苷是是2′-OH腺苷，至少100％的鸟苷是2′-OH鸟苷，至少100％的胞苷是是2′--氧-甲基胞苷，至少100％的尿苷是是2′-氧-甲基尿苷。
本发明dRmY转录条件下，转录反应混合物由2′-脱氧腺苷三磷酸(ATP)，2′-脱氧鸟苷三磷酸(GTP)，2′-氧-甲基胞苷三磷酸(CTP)和2′-氧-甲基尿苷三磷酸(UTP)组成。由本发明中使用dRmY转录混合物中产生的修饰寡核苷酸完全由2′-脱氧腺苷，2′-脱氧鸟苷，2′-氧-甲基胞苷，2′-氧-甲基尿苷组成。优选实施方案中产生的修饰寡核苷酸组成一个序列，至少80％的腺苷是是2′-脱氧腺苷，至少80％的鸟苷是2′-脱氧鸟苷，至少80％的胞苷是是2′--氧-甲基胞苷，至少80％的尿苷是是2′--氧-甲基尿苷。更优选实施方案中，产生的修饰寡核苷酸组成一个序列，该序列至少90％的腺苷是是2′-脱氧腺苷，至少90％的鸟苷是2′-脱氧鸟苷，至少90％的胞苷是是2′--氧-甲基胞苷，至少90％的尿苷是是2′--氧-甲基尿苷。最优选实施方案中，产生的修饰寡核苷酸组成一个序列，该序列至少100％的腺苷是是2′-脱氧腺苷，至少100％的鸟苷是2′-脱氧鸟苷，至少100％的胞苷是是2′--氧-甲基胞苷，至少100％的尿苷是是2′-氧-甲基尿苷。
本发明rGmH转录条件下，转录反应混合物由2′-OH鸟苷三磷酸，2′-氧-甲基胞苷三磷酸，2′-氧-甲基尿苷三磷酸和2′-氧-甲基腺苷三磷酸组成。由本发明中使用rGmH转录混合物中产生的修饰寡核苷酸完全由2′-OH鸟苷，2′-氧-甲基胞苷，2′-氧-甲基尿苷和2′-氧-甲基腺苷组成。优选实施方案中产生的修饰寡核苷酸组成一个序列，该序列至少80％的鸟苷是2′-OH鸟苷，至少80％的胞苷是是2′--氧-甲基胞苷，至少80％的尿苷是是2′--氧-甲基尿苷，至少80％的腺苷是是2′-氧-甲基腺苷。更优选实施方案中，产生的修饰寡核苷酸组成一个序列，该序列至少90％的鸟苷是2′-OH鸟苷，至少90％的胞苷是是2′--氧-甲基胞苷，至少90％的尿苷是是2′--氧-甲基尿苷，至少90％的腺苷是是2′-氧-甲基腺苷。最优选实施方案中，产生的修饰寡核苷酸组成一个序列，该序列至少100％的鸟苷是2′-OH鸟苷，至少1 00％的胞苷是2′--氧-甲基胞苷，至少100％的尿苷是2′--氧-甲基尿苷，至少100％的腺苷是2′-氧-甲基腺苷。
本发明r/mGmH转录条件下，转录反应混合物由2′-氧-甲基腺苷三磷酸，2′-氧-甲基胞苷三磷酸，2′-氧-甲基鸟苷三磷酸和2′-氧-甲基尿苷三磷酸组成。由本发明中使用r/mGmH转录混合物中产生的修饰寡核苷酸完全由2′-氧-甲基腺苷，2′-氧-甲基胞苷，2′-氧-甲基鸟苷和2′-氧-甲基尿苷组成，其中鸟苷三磷酸中2′-OH鸟苷的最大含量是10％。优选实施方案中产生的r/mGmH修饰寡核苷酸组成一个序列，该序列至少80％的腺苷是2′-氧-甲基腺苷，至少80％的胞苷是2′--氧-甲基胞苷，至少80％的鸟苷是2′--氧-甲基鸟苷，至少80％的尿苷是2′-氧-甲基尿苷，所有腺苷酸中2′-OH腺苷不超过10％。更优选实施方案中，产生的修饰寡核苷酸组成一个序列，该序列至少90％的腺苷是2′-氧-甲基腺苷，至少90％的胞苷是2′--氧-甲基胞苷，至少90％的鸟苷是2′--氧-甲基鸟苷，至少90％的尿苷是是2′-氧-甲基尿苷，所有鸟苷酸中2′-OH鸟苷不超过10％。更优选实施方案中，产生的修饰寡核苷酸组成一个序列，该序列至少100％的腺苷是2′-氧-甲基腺苷，至少100％的胞苷是2′--氧-甲基胞苷，至少100％的鸟苷是2′--氧-甲基鸟苷，至少100％的尿苷是2′-氧-甲基尿苷，所有鸟苷酸中2′-OH鸟苷不超过10％。
本发明fGmH转录条件下，转录反应混合物由2′-氧-甲基腺苷三磷酸，2′-氧-甲基尿苷三磷酸，2′-氧-甲基胞苷三磷酸和2′-F鸟苷三磷酸组成。由本发明中使用fGmH转录混合物中产生的修饰寡核苷酸完全由2′-氧-甲基腺苷，2′-氧-甲基尿苷，2′-氧-甲基胞苷和2′-F鸟苷组成。优选实施方案产生的修饰寡核苷酸组成一个序列，该序列至少80％的腺苷是2′-氧-甲基腺苷，至少80％的尿苷是是2′--氧-甲基胞苷，至少80％的胞苷是2′--氧-甲基胞苷，至少80％的鸟苷是2′-F尿苷。更优选实施方案中，产生的修饰寡核苷酸组成一个序列，该序列至少90％的腺苷是2′-氧-甲基腺苷，至少90％的胞苷是2′--氧-甲基尿苷，至少90％的鸟苷是2′--氧-甲基胞苷，至少90％的尿苷是2′-F鸟苷。更优选实施方案中，产生的修饰寡核苷酸组成一个序列，该序列至少100％的腺苷是2′-氧-甲基腺苷，至少100％的胞苷是2′--氧-甲基尿苷，至少100％的胞苷是2′--氧-甲基胞苷，至少100％的鸟苷是2′-F鸟苷。
本发明dAmB转录条件下，转录反应混合物由2′-脱氧腺苷三磷酸，2′-氧-甲基胞苷三磷酸，2′-氧-甲基鸟苷三磷酸和2′-氧-甲基尿苷三磷酸组成。由本发明中使用dAmB复转录混合物产生的修饰寡核苷酸完全由2′-脱氧腺苷，2′-氧-甲基胞苷，2′-氧-甲基鸟苷和2′-氧-甲基尿苷组成。优选实施方案的修饰寡核苷酸组成一个序列，该序列至少80％的腺苷是2′-脱氧腺苷，至少80％的胞苷是2′-氧-甲基尿苷，至少80％的鸟苷是是2′-氧-甲基鸟苷，至少80％的尿苷是2′--氧-甲基胞苷。更优选实施方案中，产生的修饰寡核苷酸组成一个序列组成，该序列至少90％的腺苷是2′-脱氧腺苷，至少90％的胞苷是2′-氧-甲基尿苷，至少90％的鸟苷是2′-氧-甲基鸟苷，至少90％的尿苷是2′--氧-甲基胞苷。更优选实施方案中，产生的修饰寡核苷酸组成一个序列，该序列至少100％的腺苷是2′-脱氧腺苷，至少100％的胞苷是2′-氧-甲基尿苷，至少100％的鸟苷是2′-氧-甲基鸟苷，至少100％的尿苷是2′--氧-甲基胞苷。
在每种情形下，转录产物用于SELEXTM过程的混合物以鉴定出能与给定靶点特异结合的适体和/或确定与给定靶点特异结合的保守基序序列。产生的序列已被部分稳定化处理，从过程中除去这一步从而得到一种修饰的适体序列和一种更稳定的适体。2’-氧-甲基SELEXTM过程的另一个优点是产生的序列中可能有更少的序列所必需的2′-OH核苷，甚至可能没有。2′OH核苷仍存在的程度时，可通过post-SELEXTM修饰除去。
如下所述，在非上述的优化条件的其他条件下，可以获得完全结合了2′取代的核苷少量有用的复制产物。上述转录条件的改变包括
HEPES缓冲液的浓度范围为0到1M。本发明也考虑使用其他pKa值介于5-10的缓冲液试剂。例如，Tris-羟甲基-氨基甲烷。
DTT浓度范围介于0-400mM。本发明的方法也提供了其他还原试剂的使用方法，包括，巯基乙醇。
亚精胺和/或精胺浓度范围为0-20mM。
PEG-8000浓度范围为0到50％(w/v)。本发明的方法也提供了亲水聚合体使用方法，包括其他分子量的PEG或其他亲水的聚乙二醇。
Triton X-100浓度范围为0到0.1％(w/v)。本发明的方法也提供了非离子去垢剂的使用，包括其他去垢剂和其他Triton-X去垢剂。
MgCl2的浓度范围为0.5mM到50mM。MnCl2的浓度范围为0.15mM到15mM。MgCl2和MnCl2必须在此所述的范围内，在优选实施方案中MgCl2∶MnCl2的比例在大约10到3左右，优选的，MgCl2∶MnCl2的比例是大约3-5∶1，更优选MgCl2∶MnCl2的比例是大约3-4∶1。
2’-氧-甲基NTP浓度(每种NTP)范围为5μM-5mM。
2′-OH GTP浓度范围为0μM-300μM。
2′-OH GMP浓度范围为0-5mM。
pH范围为pH6到pH9。本发明的方法在大多数聚合酶保持能结合修饰核苷活性的pH范围内操作，而且，本发明的方法也提供了在转录反应条件螯合试剂的任选使用方法，比如EDTA，EGTA，和DTT。
适体医药化学
适体医药化学是一种适体改进技术，通过化学方法合成多组变异适体。这些变异体由于引入了单一取代基而不同于母适体，由于取代基的位置不同彼此也不相同。比较这些适体变异体之间的差异，以及与母适体的差异。性能上可能有了很大的改进，以至于达到某一特定的治疗标准是很有必要将单个取代基包含入内。
另外，从单取代变异适体获得的信息可进一步通过同时引入一个以上的取代基来设计其他组的变异适体。其中一种设计方案是将所有的单取代的适体变异体分类，选出前四个，并将这四个适体变异体尽可能以双倍(6)，三倍(4)和四倍(1)的形式组合，合成组合物并检测。在第二个设计策略中，最好的单取代适体变异体做为母体，合成并检测所有可能的双取代适体变异体，包括最高级单取代适体变异体。也可以使用其他策略，这些策略可能重复被使用，随着不断对进一步的改进适体变异体的鉴定，取代的数目逐渐增加。
适体的医药化学尤其用于探究在局部而非全部引入取代基团。因为适体是在转录产生的的序列库中发现的，任何SELEXTM过程引入的取代基必定是整体引入。比如，想要在核苷之间引入硫代磷酸酯联接，那么只能在每个A(或者每个G，C，T，U等)引入(整体取代)。如果适体需要在某些A(或每个G，C，T，U等)(局部取代)中引入硫代磷酸酯联接，但又不允许其他的A之间引入，那么就不能通过该过程实现。
适体的医药化学过程中所用的取代种类仅受到其做为固定相合成试剂产生取代的能力和将其引入低聚物合成方案能力的限制。该过程不仅限于核苷。适体的医药化学方案包括引入空间排阻，憎水性，亲水性，疏水性，疏油性，正电荷，负电荷，中性电荷，兼性离子，极化性，抗核酸酶性，构象刚性，构象灵活性，蛋白结合特性，聚集等集团。适体医药化学方案可能包括碱基修饰，糖修饰或磷酸连接修饰。
在治疗学适体中考虑有用的取代基种类，引入下面一种或多种取代基都可取得理想的效果。
在体内已经出现了取代基团，比如2′-脱氧，2′-核糖，2′-氧甲基嘌呤或嘧啶或5-氧-甲基胞嘧啶。
取代基团已经成为被批准的治疗剂的一部分，比如与硫代磷酸连接的寡核苷酸。
能水解或降解成上述两种类型之一的取代基团，例如与甲硫代磷酸连接的寡核苷酸。
本发明的抗-IgE适体包括在此叙述的通过适体医药化学形成的适体与IgE特异结合的适体
本发明的材料包括一系列20-50核苷长的核酸适体，能特异结合IgE，并且在一些实施方案中有效的调节，如阻断，IgE在体内的活性和/或其在功能检测，如基于细胞的检测中的活性。
这里描述了能特异结合并调节IgE的适体。这些适体提供了一种低毒性，安全有效的形式来治疗和/或预防过敏疾病或不适，已知所述过敏性疾病或不适是由IgE引起或与其有关，例如过敏性鼻炎(花粉症)，过敏性皮炎，哮喘，急性风疹(水泡-和-皮肤红肿发炎)，食物过敏和系统性过敏反应。
提供了用于治疗和/或诊断的特异性结合IgE的适体的例子，包括如下序列序列号11至15，18至19，21，29，33，41至44，46，50，56至96，98至102，119至124，126至136，139至176，178至190，194至201，206至243，247，249至259，261至267，269至290，292至295和296；尤其是从如下组中选出的序列序列号29，33，41至44，46，50，98至102，157至176，178至190，194至201，206至219，293至295和296；更尤其是从如下组中选出的序列序列号101，157，181，216，293至295和296。
其他与IgE结合的适体如实施例1-4例中叙述。
这些适体包括在此所述的修饰，包括与亲脂性复合物或PEG高分子量复合物相连接，加入CpG基序，加入封端结构，与修饰核苷结合，磷酸骨架中的取代。
在本发明的实施方案中提供了能与IgE结合的分离出的非自然产生的适体。在一些实施方案中，这种分离出非自然发生的适体对少于100μM，少于1μM，少于500μM，少于50nM，少于1nM，少于500pM，少于100pM，少于50pM或少于1pM的IgE有一个解离常数(″KD″)。在发明的一些实施方案中，这个解离常数取决于在实施例1所述条件下使用人IgE滴定的斑点杂交试验。在特别实施方案中，这个解离常数取决于标准斑点杂交试验，在室温下，在Dulbecco′s PBS(含有Mg++和Ca++)和0.1mg/mL BSA中滴定人IgE 30分钟。
在另一个实施方案中，本发明的适体调节IgE的功能。另一个实施方案中，本发明的适体阻碍IgE发挥功能。还有其他发明实施方案中，适体结合和/或调节IgE衍生物的功能。这里所用的IgE衍生物包括和与IgE功能完全相同的衍生物，尤其包括那些结构基本相同的衍生物，在一些优选实施方案中包括至少70％的氨基酸序列与IgE氨基酸序列一致的衍生物，更优选实施方案中80％序列一致，更优选是90％的序列一致，甚至更优选实施方案至少95％的氨基酸序列与IgE氨基酸一致。本发明的一些实施方案中，通过下述的BLAST法确定靶点衍生物序列的一致性。
文章里出现的关于核苷酸或蛋白质序列的术语″序列一致性″或″一致性％″指的是在使用下面一种序列对比运算方法或靠视觉观测来比较或比对最大吻合度时，两个或多个序列或子序列其氨基酸残基序列或核苷酸序列相同，或有一定比例的序列相同。序列对比时，通常，其中一个序列作为参照序列，其他序列与之进行对比。当用到一种数列对比运算方法时，参照序列和检测序列输入计算机，如有必要还可设定子序列对等物，还可设定序列运算法则程序中的参数。序列对比运算法则然后计算出检测序列相对于参照序列的的相同序列百分比。可对要比较序列做最佳比对，如通过Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)中的局部同源比对，通过NeedIeman & Wunsch，J MoI.Biol.48443(1970)中同源比对运算法则，通过Pearson & Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 852444(1988)的相似方法研究和这些运算法则的计算机化(Wisconsm GeneticsSoftware Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA)或通过视觉观测(参见Ausubel等人的文献，同上)。
适合于确定序列同源百分比的其中一种运算法则，应用于基本局部比对工具(后引用为″BLAST″)，参见Altschul等人的文献J MoI.Biol.215403-410(1990)和Altschul等人的文献Nucleic Acids Res.，153389-3402(1997)。BLAST分析所用的软件可从国家生物技术信息中心获取(后文中引用为″NCBI″)。从NCBI中获得的软件在确定序列同源时使用默认参数。例如，BLASTN(对于核苷酸)和BLASTP(对于氨基酸序列)都在McGmnis等人的文献Nucleic Acids Res.，32W20-W25(2004)中有所描述。
发明中的另一个实施方案中，适体与IgE结合的能力与任何一种依照序列号11至15，18至19，21，29，33，41至44，46，50，56至96，98至102，119至124，126至136，139至176，178至190，194至201，206至243，247，249至259，261至267，269至290，292-295和296的适体的结合能力相同。在发明的另一个实施方案中，适体的结构，和/或与IgE结合的能力与包括任何一种序列号11至15，18至19，21，29，33，41至44，46，50，56至96，98至102，119至124，126至136，139至176，178至190，194至201，206至243，247，249至259，261至267，269至290，292至295和296的适体相同。在特定的实施方案中，提供依照任何一种序列号11至15，18至19，21，29，33，41至44，46，50，56至96，98至102，119至124，126至136，139至176，178至190，194至201，206至243，247，249至259，261至267，269至290，292至295和296的适体。在一些特殊实施方案中，提供了依照任一种序列号101，157，181，216，293至295和296的序列。在另一个实施方案中，发明中的适体用做药物成分中的活性剂。在另一个实施方案中，组成本发明适体的适体或组合物用于治疗遗传性过敏性疾病或功能不适，如过敏性鼻炎(花粉症)，遗传性过敏性皮炎，哮喘，急性风疹，食物过敏，花生过敏，系统性过敏反应，过敏性结膜炎，春天角膜结膜炎，遗传性过敏性结膜炎，巨大乳头结膜炎和嗜曙红细胞肠胃炎。
在一些实施方案中，本发明的适体治疗剂与靶点有很强的亲和力和特异性，同时适体治疗剂能在病人或研究主体体内分解，则会降低非自然作用取代的核苷毒副作用。在一些实施方案中，包含本发明适体治疗剂的治疗性组合物没有氟化核苷，或有少量的氟化核苷。
本发明的适体可通过使用任何寡核苷酸合成技术合成，技术包括工艺上已广为人知固相寡核苷酸合成技术(参见Froehler等人的文献Nucl.Acid Res.145399-5467(1986)和Froehler等人的文献Tet.Lett.275575-5578(1986))和的里斯雅特合成方法的液相合成法(参见Sood等人的文献Nucl.Acid Res.42557(1977)和Hirose等人的文献Tet.Lett.，282449(1978))。
含有免疫基序的适体
本发明提供了与IgE结合并调节其生物学功能的适体。本发明尤其提供了能干扰IgE与IgE受体，FcεRI结合的适体，因而阻碍了IgE介导的过敏反应。这类适体的治疗效果可通过筛选与IgE结合并含有免疫应答或免疫调节基序的适体而进一步加强，也可以通过处理结合到IgE上的适体进一步得到加强，与适体相连的IgE与靶点上的免疫应答和/或免疫调节序列相结合。
脊椎动物免疫系统对细菌性DNA的识别是基于对特定序列背景下未甲基化CG二核苷酸的识别(″CpG基序″)。识别这种基序的一个受体是Toll样受体9(″TLR9″)，是Toll样受体家族的成员(大约10个成员)内之一。Toll样受体通过识别特异细菌性成分参与先天免疫应答。TLR9与未甲基化寡核苷酸(″ODN″)CpG序列以一种序列特异方式结合。CpG基序的识别触发了引起先天免疫反应防御机制，最终获得了免疫应答。例如，激活小鼠体内TLR9将引发抗原呈现细胞的激活，I和II类MHC分子的上调以及重要共调节分子和细胞激酶包括IL-12和IL-23等的表达。这种激活都直接或介接加强了B和T细胞应答，包括TH1细胞激酶IFN-γ的有力上调。全体的，对CpG序列的应答引起抵御感染疾病，改进对疫苗的免疫反应，对哮喘有效应答，改进抗体依赖细胞介导的细胞激酶。因此CpG ODNs可抵抗感染性疾病，起到免疫辅助作用或癌症治疗作用(单独疗法或与或其他药物联合疗法)，并能减少哮喘和过敏反应。
本发明的适体包括一个或更多个CpG或其它免疫触发序列，使用在此叙述的SELEXTM过程可通过多种策略鉴定或生成。通常，这些策略可分为两组。对第一组而言，策略是针对鉴定或生成含有CpG基序或其他免疫触发序列以及与靶点相结合的位点的适体。该靶点(之后用做″非CpG靶点″)不是已知的识别CpG基序或其他免疫触发序列的并一旦结合了CpG基序就激发免疫反应的靶点。一些发明的实施方案中，非CpG靶点是IgE。本组的第一种策略包括进行SELEXTM获得对特定的非CpG靶点，优选例如IgE靶点的适体，其中免疫反应与疾病的发展有关，使用的是CpG基序已经被加入到其每一个成员中，作为或者部分作为固定区域的寡核苷酸库，例如在某些实施例中，寡核苷酸库成员的随机区域包括已加入了CpG基序的固定区域，以及识别包括了CpG基序的适体。本组的第二种策略包括进行SELEXTM以获得对特定的非Cp靶点，优选例如IgE靶点的适体，这里免疫应答与疾病发展相关，随后将CpG基序选择增加到5′和/或3′封端或将CpG基序通过工程学方法添加到适体的一个区域，优选非必需区域。本组的第三种策略包括进行SELEXTM以获得对特定的非CpG靶点，优选IgE靶点的适体，在这里免疫应答与疾病发展相关，其中在合成文库的过程中，不同核苷酸的摩尔比偏向于一种或更多种核苷酸加入步骤，因此库中每一成员随机化区域富集CpG基序，以及识别包括了CpG基序的适体。本组的第四种策略包括进行SELEXTM以获得对特定的非CpG靶点，优选IgE靶点的适体，在这里免疫应答与疾病发展相关，以及识别包括了CpG基序的适体。本组的第五种策略包括进行SELEXTM获得对特定的非CpG靶点，优选IgE靶点的适体，在这里免疫应答与疾病发展相关，以及识别不包括CpG基序，但在结合后，能够刺激免疫反应的适体。
第二组中，策略是针对鉴定或生成包括CpG基序和/或其他被CpG基序的受体(如，TLR9或其他toll形受体)结合的并触发免疫应答的序列的适体。本组的第一种策略包括进行SELEXTM获得对已知能与CpG基序或其他免疫触发序列相结合并刺激免疫应答发生的靶标的适体，使用CpG基序已经被加入到每一个成员中作为或者部分作为其固定区域的寡核苷酸库，例如在某些实施例中，寡核苷酸库成员的随机区域包括加入了CpG基序的固定区域，以及识别包括了CpG基序的适体。本组的第二种策略包括进行SELEXTM获得对已知可与CpG基序或其他免疫触发序列相结合的靶标的适体，这种结合一旦发生能够刺激免疫反应，然后将CpG基序添加到适体5′和/或3′末端或将其工程构造到适体的一种区域，优选非必需区域中。本组的第三种策略包括进行SELEXTM获得对已知与CpG基序或其他免疫触发序列相结合的靶标的适体，这种结合一旦发生能够刺激免疫反应，其中，在寡核苷酸库的合成过程中，不同核苷酸的摩尔比偏向一种或多种核苷酸添加步骤，使库中每一成员的随机化区域富集CpG基序，以及识别包括了CpG基序的适体。本组的第四种策略包括进行SELEXTM获得对已知与CpG基序或其他免疫触发序列相结合的靶标的适体，这种结合一旦发生能够刺激免疫反应，以及识别包括了CpG的适体。本该组的第五种策略包括进行SELEXTM以获得对已知与CpG基序结合或与其他免疫触发序列结合的靶标的适体，以及识别适体，该适体虽不包括CpG基序，但是，一旦结合就刺激免疫应答。
已经被鉴定出许多不同类的CpG基序，每个只要被识别出来就会触发多种不同的反应，细胞因子和其他分子的释放，某种细胞类型的激活。参见文献CpG Motifs m Bacterial DNA and Their Immune Effects，Annu.Rev.Immunol.2002，20709-760，该文献通过在这里引证全部并入本文。随后的美国专利还揭示了其他的免疫触发基序，每个文献都通过在此引证全部并入本文美国专利第6,207,646号；美国专利第6,239,116号；美国专利第6,429,199号；美国专利第6,214,806号；美国专利第6,653,292号；美国专利第6,426,434号；美国专利第6,514,948号和美国专利第6,498,148号。任何这些CpG基序和其他免疫触发基序都可结合到适体中。适体的选择由治疗的疾病或功能紊乱来决定。优选的免疫触发基序如下(从左到右是5′至3′)，其中″r″指的是嘌呤，″y″指的是嘧啶，″X″指任意的核苷AACGTTCGAG(序列号4)；AACGTT；ACGT，rCGy；rrCGyy，XCGX，XXCGXX，和X1X2CGY1Y2，其中X1是G或A，X2不是C，Y1不是G和Y2优选T。
在CpG基序与适体结合的实施例中，适体结合到特异的靶点上而不是已知的与CpG基序结合的靶点(非CpG靶点)，这种引发免疫应答，CpG优选位于适体的非必需区域。适体的非必需区域可通过定点突变，删除分析和/或取代分析来确定。然而，任何不明显的影响适体与非CpG靶点结合能力的定位方法都可使用。CpG基序除了位于适体内部序列也可是增加到5′和3′或附着于适体上。只要适体结合到非CpG靶点的能力没有受到显著的改变，可以以任何方式定位附着。
在此使用的，“免疫应答的刺激”的意思可以是(1)特异应答的诱导(例如ThI应答的诱导)或者是某个分子产生的诱导；或(2)特定反应(阻止或抑制Th2应答)或某些分子的阻止或抑制。
药物组合物 发明也包括含有能与IgE结合的适体分子的药物组合物。在一些实施方案中，这些组合物更适于内用，包括有效剂量的本发明的有药物活性的化合物，单独或同一个或多个药学可接受载体组合使用。尤其是由于化合物的低毒性使得其非常有用。
本发明的组合物可用于治疗，预防和/或改进病理，比如疾病或功能紊乱，也可以减轻这些疾病患者的症状。比如本发明的组合物可用于治疗，预防和/或改进与遗传性过敏性疾病相关的疾病或功能紊乱，如由IgE引起或者与其相关的疾病过敏性鼻炎(花粉热)，遗传性过敏性过敏性皮炎，哮喘，急性风疹，食物过敏，花生过敏，系统性过敏反应。
发明的组合物可以用于对患有(或倾向于)某种疾病或功能紊乱的患者给药，这种疾病或功能紊乱和特异结合了发明适体的靶点有关或是有其引起的。发明的组合物作为治疗有病变的病人或主体的一种方法，方法涉及到给予病人或主体一个与IgE结合的适体或含有适体的组合物，适体结合了IgE改变了靶点的生物学功能从而治疗了病变。
有病变的患者或主体，即，发明方法处理的病人或主体可以是脊椎动物，尤其是哺乳动物，尤其是人。
实际上，适体或其药物容受盐都是在其足可以发挥生物学活性的剂量下给药，即抑制IgE适体与受体IgE结合。
发明的一方面包括了和其他治疗IgE介导的功能紊乱的疗法一起使用的本发明适体组合物。适体成分可能包括一种以上的适体。在一些实施例中，包含本发明一种以上适体的组合物与另一种组合物一起给药，比如抗炎试剂，免疫抑制剂，抗滤过性病原体试剂或类似的试剂。总之，当前已知治疗试剂的可用的剂量形是合适的。
“联合治疗”(或“共疗法”)包括本发明适体化合物的给药和至少另一种试剂的给药。这种试剂作为特异治疗方案的一个部分，目的在于提供这些药物试剂共同作用的有益作用。联合治疗的有益作用包括但不是只限于由于药物试剂联合使用而引起的药代学或药效。这些药物试剂联合给药都在规定的期限内执行的(通常是依据所选定的组合确定的分钟，小时，日或周)。
“联合疗法”一般不是但是倾向于将两种或以上这些治疗试剂作为单独疗法方案的一部分，从而导致了本发明的联合治疗。联合治疗包括这些治疗试剂按次序给药，即，每种治疗试剂在不同的时间给药，或这些试剂，至少两种试剂同时给药。同时给药是可以一个实现的，如给研究主体一个每种治疗试剂都是按照固定比率配好的胶囊，或给多个胶囊，每个胶囊含有一种治疗试剂。
每种治疗试剂连续的充分的给药受到任何合适途径的影响，包括但不限于局部给予，口服，静脉给予，肌肉给予和通过黏膜组织的直接的吸收。治疗剂量可通过相同的途径或不同的途径给药。比如，所选组合的第一种治疗试剂可可通过注射方式给药，而组合的其他治疗试剂可通过局部给药。
另外，所有的治疗试剂都可能局部给予或者通过注射给予。治疗试剂的给药顺序并不是非常严格除非有特别注释。“联合治疗”也包括上述治疗试剂的给药和与其他生物学活性成分的联合给予。当联合治疗还包括非药物治疗时，非药物治疗可以在任何合适的时间实施，只要非药物治疗联合治疗试剂共作用可以产生有益作用。比如，在一些实施例中，当非药物治疗暂时从治疗治疗试剂中去掉之后仍然有效，可能持续几天甚至几周。
本发明的治疗成分或药理成分一般包括有效剂量治疗的活性成分，溶于或分散于药理可容受的介质中。药理可容受的介质或载体还包括任何的或所有的溶剂，分散介质，衣层，抗细菌或真菌试剂，等张试剂或吸收延长试剂，或一类。人们很了解适合于这种药理活性物质的介质或试剂的使用工艺。增加的活性成分也可以加入到本发明的治疗成分中。
鉴于这里的披露，本领域技术人员非常清楚制药学或药理学组合物的制备。典型的，这些组合物可以制备成血管注射剂，或者液体溶液或者悬浮液；适合注射前能溶解或悬浮于液体的固体试剂；口服的片剂或其他固体试剂；缓释胶囊；或当前使用的其他形式，包括滴眼液，乳液，洗液，药膏，吸入剂或类似的。外科大夫，内科大夫或卫生健康工作者消毒方法的使用，比如盐洗的，处理特定的手术区可能尤为重要。组合物也可以通过微型装置，微粒或纱布来给药。
治疗试剂将按照与处方剂量相一致的方式，在能起到药理学作用的剂量下给药。方案可以很容易地以多种不同剂型的实施，如上述可注射溶液类型，但也可以使用药物缓释胶囊或类似类型。
在这种背景下，活性成分的量和给予的组合物的体积取决于要处理的宿主动物。给药所需活性化合物需要的精确的量取决于执行者所做的判断并因个体不同而有差异。
通常使用分散活性化合物所需要的最小的体积的组合物。虽然适宜的给药方案也不同，但典型的给药方案是先执行化合物给药并监测结果然后再按一定的时间间隔上进一步控制药物剂量。
例如，对片剂或胶囊(例如明胶胶囊)形式的口服给药，活性药物成分可以与乙醇，甘油，水或这类能口服的非毒性药理学可容受的内载体一起给药。而且，根据需要还可在混合物中添加合适的连接物，润滑剂，崩解剂和着色剂。合适的连接物包括淀粉，硅酸锰铝，淀粉糊，明胶，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮，例如葡萄糖和beta-乳糖的天然糖，玉米甜料，天然或合成树脂，如阿拉伯胶，黄芪胶或藻酸钠，聚乙烯乙二醇，蜡或此类。在这些剂型中所使用的润滑剂包括油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，安息香酸钠，醋酸钠，氯化钠，无水硅石，滑石，硬脂酸及其镁或钙盐和/或聚乙二醇，和此类。崩解剂包括，但不止限于，淀粉，甲基纤维素，琼脂，黏土，黄原胶树脂淀粉，藻酸及其钠盐，或生泡混合物，和此类。稀释剂包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，甘露糖，山犁糖，纤维素和/或氨基乙酸。
发明的组合物可以是口服剂型给药，如定时释放和持续释放片剂或胶囊，药丸，药粉，颗粒，酊剂，悬浮液，糖浆和乳剂。栓剂可从脂肪乳剂或悬浮液中制备。
有药理活性的组合物可是已灭菌的和/或包含辅剂，如防腐剂，稳定剂，湿剂或乳化剂，促溶剂，调节渗透压的盐和/或缓冲液。另外，药物成分也包含其他有药理学作用的物质。药物组合物按传统方法混合，粒化，包衣进行制备，活性成分典型的是占0.1％至75％，优选是占0.1％至75％。
液体，尤其是可注射组合物可通过例如溶解，分散等来制备。活性组合物溶解于或混合于制药学上的纯溶剂，如，水，盐溶液，葡萄糖液，甘油，乙醇等，从而形成可注射溶液或悬浮液。另外，还可制成适合在注射前溶解于液体中的固体。
本发明的组合物可在静脉内(大丸药和灌输)，腹腔内，皮下或肌肉内注射的形式给药。这几种形式都是药学上为人熟知的普通技术。血管注射剂可按照传统的方式，以液体溶液的方式或悬浮液的形式来进行制备。
非肠胃给药通常用于皮下注射，肌肉注射或静脉注射和灌输。另外，非肠胃给药的一种方法使用了缓慢释放或持续释放系统的灌输，保证了药物维持在一个恒定的浓度，依据美国专利第3,710,795号所述，在这里该专利通过引证并入全文。
此外，本发明的优选组合物可以使用本领域普通技术人员已知的方式通过适当的鼻用工具，吸入器鼻部局部给药，或通过透皮贴剂形式由真皮途径鼻内给药。皮肤贴剂通过透皮途径给药，在该领域里都是为人熟知的技艺。使用真皮运输系统的形式给药，整个剂量方案中剂量给药应该是连续的而不是间断。另一些优选的局部制剂包括乳剂，药膏，洗剂，气雾剂和凝胶体，其中活性成分典型的浓度在0.01％至15％，w/w或w/v范围内。
对于固体组合物，赋形剂包括甘露糖，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖化钠，滑石粉，纤维素，葡萄糖，蔗糖，碳酸镁和其他。上文所定义的活性组合物可以使用栓剂作为栽体，聚二醇就使用栓剂作为载体，例如丙二醇。在一些实施方案中，栓剂很容易从脂肪酸乳剂和悬浮液中制备。
本发明组合物也可以通过脂质体传递系统给药，比如小单囊泡，大单囊泡，多囊泡。脂质体可通过多种磷脂形成，包括胆固醇，硬脂醇或卵磷脂。在一些实施方案中，脂质组合物薄膜与药物的水溶液结合形成脂质层包裹药物，在美国专利第5,262,564中有此描述。比如，在此描述的适体分子可与通过使用为人熟知的方法构造的亲脂性化合物或非免疫原性高分子量化合物相连形成复合物。在美国专利第6,011,020中提供了一个核酸相关复合物的例子。
本发明的组合物也可作为靶向性药物载体与可溶性聚合物相连。这样的聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮，吡喃共聚物，聚羟丙氨-甲基丙烯酰胺-苯酚，多羟基乙氨基苯酚残基取代的聚乙烯赖氨酸。此外，本发明的组合物可连接到一类能生物降解的聚合物上，有利于实现药物的控制释放，比如，聚乳酸，聚ε-己内酯，多羟基酪酸，聚原酸酯，聚缩醛(树脂)，聚二羟基吡喃，聚丙烯酸脂和交联的或两性的凝胶共聚物。
所给的药物组合物也可以包括小量的无毒副作用物质，如湿剂，乳化剂，pH缓冲试剂，和其他的例如醋酸钠和三羟乙基胺油酸盐的底物。
所使用适体的配药方案是依据一系列因素来选择的，包括类型，种类，年龄，重量，性别和病人的体检状况；需要治疗的严重程度；给药途径；病人的肝功和肾功；使用的特定适体和盐。一位普通的技术熟练的医师或兽医可以很容易确定并指出治疗，预防，预测或拖延病情需要药物的有效剂量。
本发明的口服剂量如果用于表明药物作用则在每天口服0.05-7500mg的范围内。组合物优选地以标记片剂的形式提供，其中含有0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，25.0，50.0，100.0，250.0，500.0和1000.0mg的活性成分。灌输用量，鼻内用量和真皮吸收用量在0.05-7500mg/day范围内。皮下，静脉和腹腔膜的用量则在0.05-3800mg/day范围内。
本发明化合物的有效血浆水平在0.002mg/mL至50mg/mL范围内。
本发明的化合物以每日一次的剂量形式给药，或将每日总剂量分为两次，三次或四次给药。
适体治疗试剂的药代动力学和生物分布调节
很重要的一点是，对于所有基于包括适体在内的寡核苷酸的治疗，其药代动力学特性应与期望的药物应用相匹配。针对细胞外靶点的适体不涉及细胞内运输相关的困难(抗过敏和基于MAi的治疗就是例子)，这类适体仍然能分散于靶器官或组织，或在一端时期内留在体内(未经修饰)，与理想的定量给药方案一致。
本发明提供了影响适体成分药代动力学的物质和方法，特别是提供了调节适体药代动力学的能力。适体药代动力学的调节能力(即，调整能力)可通过将修饰基团(如PEG共聚体)结合到适体和/或结合修饰核苷(如2’-氟或2’-氧-甲基)以改变核苷酸的化学成分来获得。调节适体药代动力学的能力用于改进现有药物应用，或者新药物应用的发展。例如，在一些药物的实际应用中，如在需要快速清除药物的抗新生或紧急护理处置中，减少适体在循环中的滞留时间是非常需要的。另外，在一些药物的实际应用中，如，需要药物系统循环的维持疗法，增加适体在循环中的维持时间很有必要。
此外，适体药代动力学的调节能力也用于调节适体药物在研究主体体内的生物分布。例如，在一些药物的应用中，需要改变适体药物在体内的生物分布以靶向于特定的组织或器官(或一组器官)。在这些应用中，适体药物在特定组织或器官积聚。在另一些药物的应用中，需要靶向于呈现出细胞标记物或与疾病相关症状的靶组织，有细胞损伤或其他病变的靶组织，这样有利于适体药物在受到影响的组织中聚积。如在2004年3月5日提出的美国临时申请第60/550790号命名为“适体治疗剂药代动力学和生物分布的控制调节”和2005年3月7日提出的美国非临时申请号10/---，---名为“适体治疗剂药代动力学和生物分布的控制调节”中描述适体药物的PEG化产物(如，连接一个20kDa PEG聚合体的PEG化产物)用于靶向于炎性组织，从而有利于PEG化的适体药物在炎性组织中的聚积。
为确定适体药物(如适体连接体或含有发生化学修饰的适体，如修饰核苷)的药代动力学和生物分布图象，监测了各种参数。这些参数包括，例如，适体治疗剂的半衰期(t1/2)，血浆清除率(Cl)，分布体积(Vss)，浓度-时间曲线下面积(AUC)，最大血清浓度或血浆浓度(Cmax)，和平均滞留时间(MRT)。其中″AUC″指的是适体药物血浆浓度-适体给药后时间图象下面积。AUC值用于估计生物利用度(即，适体药物给药后适体药物在循环中的百分比)和所给适体药物的总清除率(Cl)(即，适体药物从循环中清除的比率)。分布体积将适体药物血浆浓度与体内适体总量联系起来。Vss越大，越容易在血浆中找到适体。
本发明提供了以控制方式调节体内经稳定化处理过的适体组合物的药代动力学和生物利用度的材料和方法，通过将适体连接到调节基团上，如小分子物质，肽，或聚合物末端基团，或填加修饰核苷到适体中。在此所说到的连接修饰基团和/或改变核苷化学成分从根本方面改变了适体在循环中的滞留时间和在组织中。
寡苷核酸药物除了被核酸酶修饰清除也通过肾脏过滤来清除。因此抗核酸酶的寡苷核酸的给药通常是静脉注射，如果过滤不受到阻碍，其显示的体内半衰期小于10分钟。可以通过促进血流快速分布入组织或增加寡苷核酸分子表面积使其超过肾小球有效截面来实现阻碍过滤。下述的将小分子药物连接到PEG聚合物上(PEG化产物)可以显著的延长适体在循环中的滞留时间，因而减少了给药次数并加强对血管靶点的效力。
适体可以连接多种修饰基团-高分子量聚合物，如，PEG，肽，例如破伤风抗毒素(HIV破伤风抗毒素蛋白的13个氨基酸片段(Vives，等人(1997)，J.Biol.Chem.272(25)16010-7))，Ant(来自果蝇触角基因同源蛋白第三个螺旋一个16个氨基酸序列(Pietersz，等人(2001)，Vaccme 19(11-12)1397-405))，疫苗19(11-12)1397-405))和精氨酸7(一个短的带阳性电荷的可渗透入细胞的肽，由聚精氨酸(Arg7)组成)(Rothbard，等人(2000)，Nat.Med.6(11)1253-7；Rothbard，J等人(2002)，J.Med.Chem.45(17)3612-8))，和小分子，如亲脂混合物胆固醇。上述这些多种连接物，由于PEG基团的复合作用使得适体在体内的特性都发生了很大的变化。例如，2′F和2’-氧-甲基修饰的与20kDa PEG聚合物连接的适体阻碍了肾脏的滤过，促进了健康组织和炎性组织的分布。而且20kDa PEG聚合物-适体连接体与40kDa PEG聚合物-适体连接体在经过肾脏被滤出时所起到的阻止作用几乎是一样的。尽管PEG化产物的一个作用在于对适体的清除上，但由于20kDa基团的出现延长了适体在系统中的滞留时间，从而促进了适体在组织中的分布，尤其是高灌注器官和炎性部位。20kDa PEG聚合物连接体将适体定向运输到炎性部位，PEG化的适体就很容易在炎性组织中积聚。在一些例子中，20kDa PEG化的适体连接体能到达细胞内部，如肾脏细胞内部。
修饰核苷可用于调节适体的血浆清除率。如，与未经修饰的适体相比，结合了2′-F和2′-OMe稳定化学物质的而未连接的适体(由于在体内和体外都显示了很高的核酸酶稳定性，是目前该代适体的典型代表)显示能快速从血浆清除(即，快速血浆清除率)并快速分布入组织，尤其是肾组织。
PEG衍生的核酸
如上述，带有高分子量的非免疫原聚合物的核酸衍生物有改变核酸的药代动力学和药效特性的潜力，使其成为有效的治疗剂。活性上有益的变化包括增加增加了抵抗核酸酶降解的能力，减少了肾脏的滤过作用，减少了在免疫系统中的出现，改变了药物在体内的生物分布。
发明的适体组合物可从聚醚类(″PAG″)衍生而来。PAG衍生核酸的例子可在2003年11月21日提出的专利申请第10/718,833号中找到，该申请在这里通过引证全文并入本文。发明中使用代表性聚合物包括聚乙二醇(″PEG″)，也被认为是聚乙烯氧化物(″PEO″)，和聚丙烯乙二醇(包括聚异丙基乙二醇)。另外，在多种应用中，可随机或阻断不同烃基氧化物(如乙烯氧化物和丙烯氧化物)的共聚物。最常见的形式，聚二醇(如聚乙二醇)是一个线形聚合物，每个末端终止于烃基HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH。这个聚合物α-，Ω-二羟聚乙二醇，可用HO-PEG-OH代表，其中PEG-形式代表下列结构单位-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，其中n的取值范围是4到10,000。
PEG分子是双功能的，有时被称为PEG二醇。PEG分子末端部分相对的非反应羟基基团(-OH)，可被基活或转化为功能基团，便于PEG或其他组合物在复合物中的反应位点连接。这种激活的PEG二醇在此称为双激活PEGs。例如，通过使用N-羟基琥珀酰亚胺中琥珀酰亚胺活性酯基团取代相对的非反应羟基基团(-OH)，PEG二醇的末端基团被激活，起到与氨基酸基团选择反应活性碳酸酯的作用。
在很多应用中，需要在PEG分子必需非反应基团端加帽使的PEG分子成为单功能(或单激活)。蛋白质药物对激活的PEGs通常显示多个反应位点，双功能激活的PEGs导致广泛的交叉连接，产生很少的功能基团。为生成单激活PEGs，PEG二醇分子末端的羟基由非反应甲基端基团-OCH3取代。PEG分子的未加帽端转化为反应端，可被激活以便于蛋白质分子在表面的反应位点连接。
PAGs是在水溶液和有机溶液中有良好溶解性，无毒性，无免疫原性的聚合物。PAGs可将聚合体共价连接到不溶性分子上使PAG-分子连接体变成可溶的。例如，水溶性药物紫杉醇连接到PEG上就变成水溶性的。Greenwald等人，J.Org.Chem.60331-336(1995)。PAG连接体不仅用于增加溶解性和稳定性也用于延长分子在血液循环中的半衰期。
本发明的聚烷基化合物代表性的大小在5-80kDa之间，尽管可以使用任意大小，但是还是要根据适体和应用来确定。发明的另一些PAG复合物大小在10-80kDa之间。还有其他发明的PAG复合物大小在10-60kDa之间。例如，一个PAG聚合体大小可能至少是10，20，30，40，50，60，或80kDa。这种聚合体可以是线形化的或分支的。在一些实施方案中，聚合体是PEG。在一些实施方案中，聚合体是分支PEG。在另一些实施方案中，如图3所述，聚合物是40kDa的支链PEG。在一些实施方案中，如图4所述，40kDa的支链PEG连接到适体的5′端。
与生物蛋白药物相比，核酸药物典型的是从激活的单核苷化学合成的。PEG-核酸连接体可通过使用反复单体合成方法结合PEG来制备。例如，通过转化成脱氧核苷亚磷酰胺形式激活PEGs，然后加入到固相寡核苷酸合成中。或者，寡核苷酸合成是通过在特异位点加入反应PEG结合位点。最常见的是通过在5′-末端加入主要的自由氨基酸(在固相合成最后连接步骤中使用修饰脱氧核苷亚磷酰胺而加入)。通过这种方式，反应PEG(激活后将与氨基酸反应形成连接键)连接到纯化的寡核苷酸上，连接反应在溶液中进行。
PEG连接体改变药物生物分布的能力与很多因素有关，包括连接体的表面大小(用术语水力半径来测量)。大的连接体(＞10kDa)已知能有效阻止肾脏滤过，从而增加小的高分子血浆半衰期(即肽，抗过敏寡核苷酸)。PEG连接体阻止滤过的能力被证实随着PEG大小增加到50kDa左右而增加(进一步的增加只有很少的有益作用，半衰期变成由巨噬细胞介导的新陈代谢决定而不是肾脏的清除决定)。
高分子量PEGs(＞10kDa)的生成是困难的，效率低下，且价格昂贵。作为合成高分子量PEG核酸连接体的一条途径，先前的工作目的集中于生成更高的分子量激活的PEGs。生成这种分子的一种方法包括形成激活的分支PEG，其中两个或多个PEGs连接到带有激活基团的中心核。这些高分子量PEG分子的末端部分，如相对的非反应羟基(-OH)，可以激活或转化为功能基团，以便于一个或多个PEGs连接到其他组合物的反应位点上。分支的活化的PEGs可以多于两个作用位点。当两个或多个末端被激活，这种激活的高分子量PEG分子在此称为多激活PEGs。在一些情况中，分支的PEGs分子中并不是所有的作用位点都被激活。在任意两个位点都被激活的情况下的PEG分子被称为双激活PEGs。在只有一个位点激活的情况下，这种PEG分子被称为单激活PEGs。这种途径的一个例子是，通过连接单甲氧基PEGs到赖氨酸中心来制备激活PEG，该中心被激活以利于随后的反应(Harris等人，Nature，vol.2214-221，2003)。
本发明提供了另一种合成高分子量PEG-核酸连接体(优选，适体)的经济有效的路线，包括多PEG化核酸。本发明也包括PEG-连接的万用寡核苷酸，如二聚化适体。本发明与高分子量组合物相关，该组合物中PEG经稳定化处理的基团作为接头将适体按照不同比例分开。如PEG连接在一个适体序列内，高分子量适体组合物的线形组合是核酸-PEG-核酸(-PEG-核酸)n，其中n大于等于1。
发明的高分子量组合物包括分子量至少10kDa的组合物。代表性的组合物分子量大小在10到80kDa之间。发明的高分子量组合物至少是10，20，30，40，50，60，或80kDa大小。
稳定化处理的基团是一个分子或分子的一部分，改进了本发明高分子量适体的药代动力学和药效学特性。在一些情况中，稳定化处理的基团是一个分子或分子的一部分，能将两或多个适体或适体区域相互接近，或减少发明高分子量适体组合物的总转动自由度。一个稳定化处理的基团可以是聚烃基乙二醇，例如聚乙二醇，这种聚乙二醇可以是线形的或分支的，均聚物或杂聚物。另一些稳定化处理的基团包括肽例如肽核酸(PNA)。寡核苷酸可以是稳定化处理的基团；这种寡核苷酸可包括修饰核苷，和/或硫代磷酸脂类的修饰联接。一个稳定化处理的结构可以是一个适体组合物的完整的一部分，即共价连接到适体上。
发明的组合物包括高分子量适体组合物，其中两或多个核酸基团共价连接到至少一个聚烃基乙二醇基团上。聚烃基乙二醇基团起到稳定基团的作用。在组合物中聚烃基乙二醇基团任意一端共价连接到适体，这样聚烃基乙二醇基团将核酸在一个分子中连接起来。有人说聚烃基乙二醇基团是一个连接基团。在这样的组合物中，共价分子的基本结构包括线形排列的核酸-PAG-核酸。包含基本结构核酸-PAG-核酸的组合物就是一个例子。另一个例子是线形排列的核酸-PEG一核酸-PEG-核酸。
为了生成核酸-PEG-核酸连接体，先合成核酸，这样就提供了一个反应位点(即单激活)。在优选实施方案中，该反应位点是5′末端的一个氨基酸基团，它是通过在寡核苷酸固相合成最后一步填加修饰脱氧核苷亚磷酰胺而引入的。脱保护和纯化修饰寡核苷酸后，在高浓度的能减少激活的PEG自发水解的溶液中再生成。在优选实施方案中，寡核苷酸浓度是1mM，再生溶液浓度包含200mM缓冲液和NaHCO3缓冲液，pH8.3.连接体的合成通过缓慢的加入高度纯化的双激活PEG引发。在优选实施方案中，PEG二醇通过在两端琥珀酰亚胺丙酸盐的衍生而激活。反应后，PEG核酸连接体通过凝胶电泳或液相色谱纯化分离出完全连接体，部分连接体和非连接体。多PAG分子(随机或阻断共聚体)或小PAG链可被连接以获取不同的长度(或分子量)。非PAG接头可用于不同长度的PAG链之间。
2′-O-甲基，2′-氟和其他经修饰的核苷修饰物稳定了适体抵抗核酸酶降解的能力，延长了体内半衰期。3′-3′-dT帽也增加了核酸外切酶的抵抗力。参见美国专利第5,674,685号；第5，668,264号；第6,207,816号和第6,229,002号，其中每个都被在此引证而全文合并于本文。
反应性核酸的PAG衍生物
高分子量PAG-核酸-PAG连接体可通过单功能激活的PEG与含有多个反应位点核酸的反应来制备。在实施方案中，核酸是双反应的或双激活的含有多个反应位点通过传统的脱氧核苷亚磷酰胺合成方法引入到寡核苷酸上的一个5′-氨基酸基团和一个3′-氨基酸基团，例如在图5所示的3′，5′二PEG化产物。在另一些实施方案中，可在内部引入反应位点，如在嘧啶的第5位，嘌呤的第8位，或核糖的2′位点引入主要氨基酸的结合位点。在这些实施方案中，核酸可有几个激活的或反应位点，有人说可被多激活。合成和纯化后，在促进与寡核苷酸反应选择性反应同时也减少了自发水解的条件下，修饰寡核苷酸与单位点激活的PEG连接。在优选实施方案中，单甲氧化PEG由羟基琥珀酰亚胺丙酸盐激活，连接反应在pH8.3进行。为了促进双取代PEG的合成，提供了相对于寡核苷酸计量过量的PEG。反应之后，PEG-核酸连接体经凝胶电泳或液相色谱分离出完全，部分和非连接样本。
在这里供连接的连接区域可有一个或一个以上聚二醇基团。这种PAGs可有不同的长度，也可用于合适的连接体中以获得理想的不同分子大小的组合物。
特定接头的效应可受到其化学成分和长度的影响。一个很长，很短的或与IgE形成不宜的空间结构和/或离子键的接头是适体与IgE形成复合体的前提。接头如果长于核苷酸之间的距离可通过减少配体的有效浓度而降低连接的稳定性。因此，常有必要优化接头成分和长度以使适体最大程度的连接到靶点上。
所有在此引用的专利和刊物都被在此引证而全部合并与本文，就如同每个专利文件和刊物都被分别明确逐个的引证而合并于本文。引用刊物和专利文件并不表明其是现有技术文献，也不表明对其内容或日期的认可。本发明已通过书面描述的方式进行描述，本领域技术人员将意识到本发明可在多种不同实施方案中实践。前面的描述和下面的实施例都是用以阐述的而不是对所附权利要求的限制。
实施例实施例1适体筛选和测序实施例1A″rRfY″IgE适体的h-IgE筛选
从人骨髓瘤血浆中纯化而来的人IgE(此后为″h-IgE″)，是从雅典技术研究中心(雅典，GA)购买的。表达并纯化T7MA聚合酶(Y639F)。2′-F嘧啶核苷和2′-OMe嘌呤嘧啶寡核苷均购自TriLmk BioTechnologies(San Diego，CA)。其他普通反应试剂是商业购买的。使用2′-OH嘌呤和2′-F嘧啶寡核苷酸(rRfY)库中从中筛选出并鉴定与h-IgE结合的适体。进行针对h-IgE的筛选并生成h-IgE的高亲和力适体。
序列库制备使用ABI EXPEDITETMDNA合成仪合成序列5′-GGGAAAAGCGAATCATACACAAGAN4OGCTCCGCCAGAGACCAACCGAGAA-S′(序列号5)，采用标准方法去保护。模板采用引物5′TAATACGACTCACTATAGGGAAAAGCGAATCATACACAAGA 3′(序列号6)和5′TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGC 3′(序列号7)进行扩增，扩增产物作为模板(Y639F)使用T7 MA聚合酶进行体外转录。转录条件为40mM Tris，40mM DTT，1mM亚精胺，0.002％TritonX-100，4％PEG-8000，12mM MgCl2，3mM 2′-F-CTP，3mM 2′-F-UTP，3mM GTP，3mMATP，0.01units/mL无机核苷酸焦磷酸酶，和T7聚合酶(Y639F)，和0.5μM左右的模板DNA。
筛选。筛选开始室温下将2×1014分子的2′-F嘌呤修饰的ARC212序列库(5′GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGA-N40-GCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAA 3′)(序列号8)和100 pmoles的h-IgE蛋白质在终体积100μL筛选缓冲液中(1X SHMCK20mM Hepes，120mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl2，1mM CaCl2，pH7.4)培育一小时。MA-蛋白质复合物与未结合MA的分子使用0.45微型硝化纤维旋转柱(Schleicher&Schuell，Keene，NH)来分离开。柱子要提前用1mL IXSHMCK的缓冲液洗涤，然后向柱子中加入含有混合物IgE复合物的溶液洗涤并1500×g离心2分钟。滤过器用400μL IXSCHMK洗涤两次以除去非特异结合物(轮，2×400μL IX SHMCK；后面几轮中，2×500μL IX SCHMK)。加入2×200μL洗涤缓冲液(7M脲，100mM醋酸钠，3mMEDTA，预热到95℃)洗涤MA。后面几轮中，MA用2×100μL洗涤缓冲液洗涤。
洗涤的蛋白质从MA混合物中用苯酚氯仿萃取，沉淀MA库(2μL肝糖，1体积异丙醇)。使用序列号7的3′引物按照使用说明使用ThermoScript RT-PCRTM(Mvitrogen，Carlsbad，CA)进行MA反转录。使用PCR(20mM Tris pH8.4，50mM KCl，2mM MgCl2，0.5μM 5′引物(序列号6)，0.5μM 3′引物(序列号7)，0.5mM每种dNTP，0.05units/μL Taq聚合酶(New Engl和Biolabs，Beverly，MA))扩增cDNA。PCR产物使用QIAquick PCR纯化仪器(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化。使用CX32P ATP大量标记在37℃下过夜，转录模板(4％PEG-8000，40mM Tris pH8.0，12mM MgCl2，1mM亚精胺，0.002％Triton x-100，3mM 2′OH嘌呤，3mM2′-F CTP和UTP，25mM DTT，无机核苷酸焦磷酸酶，T7MA聚合酶(Y639F)5μCi α32P ATP)。按照说明手册使用Centrisep柱(Prmceton Separations，Adelphia，NJ)使反应物脱盐，并用1.5mm的变性聚丙烯酰胺凝胶进行纯化(8M尿素，10％丙烯酰胺；19∶1丙烯酰胺∶双丙烯酰胺)。
随后的几轮按照第一轮的方法重复，但增加了在阴性筛选这一步。在培育蛋白质靶点前，MA库经过0.45微米硝化纤维过滤柱除去与滤过器连接的序列，滤液进入阳性筛选步骤。
在互换轮时，MA库经凝胶纯化。加入50mM EDTA结束转录反应，乙醇沉淀，然后使用变性聚丙烯酰胺凝胶进行纯化。MA库经凝胶电泳在Elutrap(Schleicher和Schuell，Keene，NH)装置中除去，电压225V在IX TBE(90mM Tris，90mM硼酸0.2mM EDTA)一小时。洗涤的物质通过加入300mM醋酸钠和2.5体积的乙醇沉淀。
整个筛选中MA浓度要保持高于h-IgE。在开始2轮中蛋白质浓度是1μM，在随后的轮中降到更低的浓度(表1)。在第四轮中开始将浓度是0.1mg/niL竞争性tMA加入连接反应液中。当筛选进行了10轮后，混合物分成两份。第11a轮同时进行阳性筛选，混合物与h-IgE的浓度比是10∶1。第11b和12b的MA和h-IgE浓度比是100∶1。这样做用以增加严格性筛选出更高亲和力的结合物。表1包含了筛选细节，包括MA混合物的浓度，蛋白质浓度，和每一轮的tMA浓度，所用到的阴性筛选以及在4％琼脂糖凝胶获得单一条带所需要的PCR循环数(Mvitrogen，Carlsbad，CA)，该条带强度和100bp DNA梯度(-48ng of DNA mass)对照物100bp的条带强度相同，上样时按照推荐的使用说明(New Engl和Biolabs，Catalog#N323 IL，Beverly，MA)。
筛选过程通过测定在阳性筛选步骤中从硝化纤维过滤中洗涤出MA混合物的百分比来监测。
表1筛选每一轮所使用(rRfY)的条件
h-IgE结合分析整个筛选中采用斑点杂交试验来监测序列库中蛋白质的亲和力。微量32P标记的MA库与h-IgE结合，并在室温下，在终体积是25μL的1X SHMCK缓冲液和0.1mg/mL tMA中培育30mm。混合物应用于(自上而下)装有硝化纤维，尼龙和凝胶斑点膜斑点吸印器(Schleicher和Schuell Mmifold-1 Dot Blot，Acrylic)。与蛋白质结合的MA可通过硝化纤维过滤获得，而未与蛋白质结合的MA则在尼龙上过滤获得。当观察到有h-IgE存在时相对于无h-IgE存在时MA结合的阳性比率，依据使用说明使用TOPO TA克隆仪(Mvitrogen，Carlsbad，CA)克隆混合物。克隆和测序11a轮序列库模板，在1-点斑点杂交(+/-20nM h-IgE)中检测到8个特异克隆。克隆和测序12b混合物，在1-点斑点杂交(+/-20nM h-IgE)中检测到与蛋白质结合的4个特异克隆。检测的每个克隆与20nM h-IgE的结合百分比(背景信号)列于下表最右栏中。下表3列出了这12个克隆的序列。基于1-点斑点杂交，选出几个克隆确定KD。克隆的转录产物5′端标记γ-32P ATP。连接反应是在上述检测混合物亲和力的条件下进行微量32P标记的克隆与h-IgE滴定相结合，并在室温下终体积是25μL的IX SCHMCK缓冲液和0.1mg/mL tMA中培育30分钟。使用斑点杂交试验确定所有特异序列的KD值，这些特异序列在初始检测中代入公式(amp1.1/(1+KD1/[h-IgE])+amp1.2/(1+KD2/[h-IgE]))+background+/-h-IgE结合比率大于2；其中amp1.1和amp1.2代表两阶段浸润结构两相的稳定水平值，KDI和KD2每种产生所得数据作用的解离常数，蛋白质结合特征的结果制成表2。
表2克隆结合活性


N.T.＝未检测N.B.＝未观察到明显的结合
下表3中给出已经鉴定的rRfY适体的核酸序列。每个适体的特异序列开始于核苷25，后面的序列是GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGA(序列号9)一直到与3′固定核苷酸序列GCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAA(序列号10)。
除非有特别注释，下面列出的每个序列代表的都是5′到3′方向并在rRfY SELEXTM条件下筛选，其中嘌呤(A和G)是2′-OH，嘧啶(U和C)是2’-氟。在一些实施方案中，发明包含下面表3描述的核酸序列。在另一些实施方案中，表3中描述的适体核酸序列另外还包括3′帽子(即，一个3′反向dT(3T))，和/或一个5′胺(NH2)修饰，以便于化学结合，和/或连接到高分子量非免疫原性组合物(即，PEG)。
表3rRfY适体的序列信息
h-IgE筛选(11a轮)SEQ ID NO 11GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACGUCGCCAGAUUGAGUGUCGUGGUUCGGGUUGAGGCGGAAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 12GGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGUCGCGAUAGAUUGCUUGUGAAUGGUUUUGGUGGAAGCGGGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 13GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGUCGCUAGAUUGCUAGUGUAUGGUUUAUCUAAAGGCGGCCGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 14GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGGUCUUACAGAUCCUGUGUAGUGGUUCGAUACAUGCGGGGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 15GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACGUGAGCAUAUCAUUGAGUGUAGUGGUUCCGGAGUAAGUCGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 16GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGCACCUUGACUGUGAUUCGCGGGUGUGAGUCGUGCGAAGGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 17GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGUGCAAGAAGUGCAUUGCUGUGUCUGGUUCUUGGCGAUGUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 18GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAUCCGAGGGUGGGCAAUAGGCUCACAAGGGUUUCGCGUGAUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAAh-IgE 筛选(12b轮)SEQ ID NO 19GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGUGCCGAGGCAUUGCUUGGUAUGGUUCCGGUCUUGUCGGGGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 20GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACGUCGCCAGAUUGAGUGUGGUGGUUCGGGUUGAGGCGGAAGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 21GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACGUCAGUAAGAUUGAGUGUAUGGUUCCUGGUGGACAAUAAUGGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAASEQ ID NO 22GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGAGAGUGGAGGAGGUAUGUAUGGUUUGUGCGUCUGGUGCGGUGCUCCGCCAGAGACCAACCGAGAA实施例1BdRmY IgE适体的筛选
进行筛选以鉴定含有脱氧-A，G和2′O-甲基C，U残基的IgE适体(dRmY组合物)。这是直接针对固定于硅化离心板上的h-IgE。这种筛选产生了大量富集于h-IgE粘合物的混合物(相对于未被选择的混合物)。
序列库制备使用ABI EXPEDITETMDNA合成仪合成序列5′-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN30CGCTGTCGATCGATCGATCGATG-S′(序列号23)，并采用标准方法对其去保护。模板使用5′引物5′GGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC-3′(序列号24)和3′端引物5′-C ATCGATCGATCGATCGACAGC-S′(序列号25)扩增，并用做转录模板使用T7 MA聚合酶(Y639F)体外转录。转录使用200mM Hepes，40mM DTT，2mM亚精胺，0.01％TritonX-100，10％PEG-8000，9.6mM MgCl2，2.9mM MnCl2，30μM GTP，2mM mCTP，2mM mUTP，2mM dGTP，2mM dATP，2mM GMP，2mM亚精胺，0.01units/ul无机焦磷酸酶，和T7聚合酶(Y639F)。
筛选筛选的每一轮都是通过室温下将20pmoles 100μL在1 XPBS中的h-IgE固定于Nunc Maxisorp(RoChester，NY)硅化离心板表面上一小时引发的。除去上清液并用120μL洗涤缓冲液冲洗五次(1 X PBS，0.1mg/mL tMA和0.1mg/mL ssDNA)。在第一轮中，100 pmoles MA混合物(6×10 unique molecules)在100μL的连接缓冲液(1 X PBS，0.1mg/mL tMA和0.1mg/mL ssDNA)中室温下培育1小时，连接缓冲液置于含有固定化靶蛋白的孔中。除去上清用120μL洗涤缓冲液将孔洗涤五次。随后的几轮中都包含了阴性筛选步骤；MA混合物同样在室温下空孔中培育1小时，以在阳性筛选步骤之前从混合物中除去任何可结合的序列。从第3轮开始，要进行第二次阴性筛选以进一步筛选出非特异结合物；混合物于室温下在之前用100μl封闭缓冲液(1 X PBS，0.1mg/mL tMA，0.1mg/mL ssDNA和0.1mg/mL BSA)封闭的孔中培育1小时。第3轮以后，在进行阳性筛选前，靶-固定化孔在100μl封闭缓冲液(1 X PBS，0.1mg/mL tMA，0.1mg/mL ssDNA和0.1mg/mL BSA)室温下封闭1小时。每种情况下，与固定的h-IgE相结合的MA混合物在加入RT混合物(3′引物(序列号25)和Thermoscript RT，Mvitrogen)并在65℃下培育1小时后直接在筛选板上反转录。产生的cDNA用做PCR(Taq polymerase，New Engl和Biolabs)模板。″Hot start″PCR条件和68℃退火温度用于尽量减少引物二聚体。PCR扩增需要进行的循环数(下表4最后一栏)，以4％琼脂糖凝胶(Mvitrogen，Carlsbad，CA)获得单一条带。上样时，依照推荐使用说明(New England Biolabs，编目号N3231L，Beverly，MA)，该条带强度和100 bp DNA梯度(-48 ng of DNA mass)对照物100 bp的甬道的强度相同。依据推荐使用条件，使用Micro Bio-Spm column(Bio-Rad，Hercules，CA)对扩增的混合物模板DNA脱盐，脱盐后的模板用于筛选的下一轮MA混合物的转录。每一轮的转录混合物在10％聚丙烯酰胺上纯化。下表4显示了每一轮dRmY适体筛选所使用的条件表4使用dRmY组合物进行的每轮筛选使用的条件
h-IgE结合分析使用夹层滤过结合试验来监测筛选进程。5′-32P-标记的MA混合物(微量浓度)与h-IgE，IX PBS加0.1mg/mL tMA，0.1mg/mL ssDNA和0.1mg/mL BSA室温下培育30分钟，并应用于斑点印迹器(Schleicher和Schuell)中硝化纤维和尼龙滤过夹层。在第6和7轮后采用七点检测法(0.25nM，0.5nM，1nM，4nM，16nM，64nM和128nM h-IgE，也有非靶点控制)后计算MA混合物连接到硝化纤维上的比例。使用上述的蛋白质滴定和斑点印迹器来测量混合物KD测量值。
筛选第6轮后，相对于自然序列库，dRmY h-IgE富集以与h-IgE连接。在第6和7轮后，序列库的KD接近于4nM。使用TOPO TA克隆仪(Mvitrogen)克隆第6轮混合物，产生了31个序列。31个序列中8和3是其中的两个主要代表序列，和21单件。图6显示是显示第6和7轮混合物相对于h-IgE浓度的结合比率图。
克隆筛选。为了确定KD，23个特异序列的每个克隆转录产物都在5′端标记γ-32P ATP。在斑点杂交试验中(0-300nM h-IgE，3倍连续稀释)，使用八点检测来确定KD值，缓冲液条件1X Dulbecco′s PBS；1.0mg/mL tMA；0.1mg/mL被修剪的蛙鱼精DNA；和0.1mg/mL BSA。将数据代入公式MA结合比率＝amplitude/(1+KD/[h-IgE])+background估计解离常数(KDs)。在这些结合条件下，23个中有20个特异序列不显示明显的结合。与序列号43和序列号46序列一致的克隆显示解离常数分别为87.7nM和109.7nM。
23个特异克隆随后在不同的实验条件下重新测定与h-IgE的结合力。使用标准化学合成方法和加强保护方法来综合生成克隆。微量5′-32P-标记的适体与人7中浓度逐渐降低的IgE结合，以300nM(3倍稀释)开始并且无蛋白质样品在室温下dPBS(含有Mg++和Ca++)和0.1mg/mL BSA中培养30分钟。使用如前述的斑点杂交试验来确定KD值。每个克隆重复三次检测。对每种蛋白质浓度计算平均结合百分比，代入公式((A+P+K)-sqrt((A+P+K)^2-4*A*P))/2A+B中计算平衡解离常数，其中A代表总适体浓度，P代表总蛋白浓度，B代表背景信号。
在这些检测条件下，与核酸序列序列号43和序列号46一致的克隆在和h-IgE结合力上显示出很大的改进。其中23个特异序列中，另有6个克隆在低毫微摩尔范围内显示了和h-IgE的高亲和力。蛋白质结合特性结果列在表5A中，生成的22个克隆的序列列在下面表5B中。
表5A在dPBS(含有Ca++和Mg++)的0.1mg/mL BSA中dRmY克隆结合活力
表5B中的每个适体的特异序列开始于核苷23，之后的序列为GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC(序列号26)，一直到3’固定核酸序列CGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG(序列号27)。
除非有特别注释，下列出的每个序列都代表5’到3’方向，并在dRmY SELEXTM条件下筛选，其中嘌呤(A和G)是脱氧的，嘧啶(U和C)是2’-氧-甲基化的。在一些实施方案中，发明包括含有下表5B中所描述核酸序列的适体。在另一些实施方案中，含有下表5B中所描述核酸序列的适体的核酸序列还包括了3’帽子(即，3’反向dT(3T))，和/或5’胺(NH2)修饰以便于化学结合，和/或连接到高分子量非免疫原组合物(即，PEG)。
表5B第6轮混合物的特异序列(所有的都是dRmY组合物)SEQ ID NO 28GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAUUAGCAGGGAGGGAGAGUGCGAAGAGGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 29GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACACUCUGGGGACCCGUGGGGGAGUGCAGCAACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 30GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAGGUGAGGGUCUACAAUGGAGGGAUGGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 31GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCCGCAGCAUAGCCUGNGGACCCAUGNGGGGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 32GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACUGGGGGGCGUGUUCAUUAGCAGCGUCGUGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 33GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGCAGCGCAUCUGGGGACCCAAGAGGGGAUUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 34GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGGGAUGGGUAGUUGGAUGGAAAUGGGAACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 35GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAGGUGUAGGGAUAGAGGGGUGUAGGUAACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 36GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGAGUGGAGCUACAGAGAGGGUUAGGGGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 37GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGGAUGUUGGGAGUGAUAGAAGGAAGGGGAGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 38GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACUUGGGGUGGAAGGAGUAAGGGAGGUGCUGAUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 39GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGUAUUAGGGGGGAAGGGGAGGAAUAGAUCACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 40GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGGAGAGAGUGUUGAGUGAAGAGGAGGAGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 41GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAUUGUGCUCCUGGGGCCCAGUGGGGAGCCACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG
SEQ ID NO 42GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAGCAGCCCUGGGGCCCGGAGGGGGAUGGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 43GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGCAGUUCUGGGGACCCAUGGGGGAAGUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 44GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCAACGGCAUCCUGGGCCCCACAGGGGAUGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 45GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAGUGGAUAGGGAAGAAGGGGAGUAGUCACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 46GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCCGCAGCAUAGCCUGGGGACCCAUGGGGGGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 47GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGGUCGCGUGUGGGGGACGGAUGGGUAUUGGUCGCUGUCNAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 48GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGGGGUUACGUCGCACGAUACAUGCAUUCAUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 49GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACUAGCGAGGAGGGGUUUUCUAUUUUUGCGAUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGSEQ ID NO 50GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAAGCAGUUCUGGGGACCCAUGGGGGAAGUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG实例1CrRmY h-IgE适体的筛选
进行筛选的目的是鉴定出含有2′-ribo G和A和2’-氧-甲基C和U残基(rRmY组合物)的h-IgE适体。这是针对固定于疏水板上的h-IgE的直接筛选。相对于天然未经筛选的序列库，筛选得到了大量富集于h-IgE粘合物的序列库。
序列库制备采用ABI EXPEDITETMDNA合成仪合成序列5′-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN3OCGCTGTCGATCGATCGATCGATG-S′(序列号51)并用标准方法去保护。使用5′引物5′-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC-S′(序列号52)和3′引物5′-CATCGATCGATCGATCGACAGC-3′(序列号53)扩增模板，扩增产物用做模板并使用T7 MA聚合酶(Y639F)的体外转录。转录使用200mM Hepes，40mM DTT，2mM亚精按，.01％ TritonX-100，10％ PEG-8000，5mM MgCl2，1.5mM MnCl2，500μM rGTP，500μM rATP，500μM mCTP，500μM mUTP，500μM GMP，.01 units/μL无机焦磷酸酶，和T7聚合酶(Y639F)。
筛选。筛选每一轮的开始都是在室温下于100μL 1X Dulbecco′s PBS中使20pmoles h-IgE固定于Nunc Maxisorp疏水板两小时。然后除去上清，用120μL洗涤缓冲液(1 X DPBS，0.2％BSA5和.05％Tween-20)冲洗孔MA混合物加热到90℃ 3分钟然后冷却到室温下复性。在第一轮中要进行阳性筛选。简言之，1×1014molecules(.2 nmoles)1MA混合物于室温下在栽有100μL连接缓冲液(1 X DPBS和.05％Tween-20)和经固定化处理蛋白靶点的孔中培育1小时。然后除去上清并用120μL4 X的洗涤缓冲液冲洗。在随后的每一轮筛选都包括阴性筛选。阳性筛选之前，MA混合物室温下在空孔中孵化30分钟以除去混合物中的可结合序列。第4轮之后另增加2个120μl洗涤(总计6×120μl洗涤)来增加严格度。在每种情况下，通过增加RT混合液(3′引物(序列号53)和Thermoscript RT，Mvitrogen))并在65℃孵化1小时，与经固定化的h-IgE结合的MA混合物直接在筛选板上进行反转录。产生的cDNA用做PCR模板(Taq聚合酶New Engl和Biolabs)。热启动PCR并在60℃退火以减少引物二聚体的形成。扩增的混合物模板DNA依照生产商推荐条件，使用Centrisep柱(Prmceton Separations)脱去盐分并用于筛选下一轮以引导MA混合物的转录。每一轮中转录混合物在10％聚丙烯酰胺凝胶纯化。
下表6显示了每一轮rRmY筛选混合物用法
使用夹层过滤结合检验来监测筛选过程。5′-32P标记的MA混合物在90℃下复性3分钟，并在室温下冷却10分钟。下一步，MA混合物(微量浓度)室温下在h-IgE的1×DPBS和0.1mg/mL tMA中培育30分钟，然后在斑点印迹器中进行硝化纤维和尼龙过滤夹层(Schleicher和Schuell)。计算与硝化纤维结合的MA混合物的百分比并每隔三轮用单点检测(+/-25OnMh-IgE)来监测。通过使用上述的蛋白滴定和斑点印迹器来测定混合物的KD。
第4轮之后筛选物富集于在天然序列库上。筛选强度又增加了2次用120μl洗涤，筛选又多进行了两轮。在第6轮序列库KD接近于500nM。使用TOPO TA克隆仪(Mvitrogen)对序列库克隆，并获得单个克隆。第6轮序列库包含一个优势克隆。该克隆的核酸序列与序列号56一致，在测序的24个克隆中占到71％。使用12点试验(0-250nM h-IgE 2倍稀释液)检测该克隆和复制中出现过的三个克隆与h-IgE的结合情况。虽然这三个复制克隆显示了比优势克隆较高的结合力，但是，所有的KDs都接近于500nM。另外获得了一组96个序列的家族和其他8个在第一序列组不明显的序列家族，含有核酸序列与序列号56一致的优势克隆占这96个序列的40％。对另外特异序列(+/-200nM h-IgE)进行单点试验。基于单点试验，使用12点试验(0-400nM h-IgE，2倍连续稀释液)对另外24个KDs序列确定KDs。每个克隆的KDs都超过100nM，并且进一步终止这些克隆。表7显示了筛选rRmy克隆的核苷序列。
每个适体的特异序列都开始于核苷22，后面的序列是GGGAGAGGAGAGAACGUUCUA(序列号54)直到3′固定的核酸序列CGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG(序列号55)为止。
除非另有特别说明，下面列出的每个序列代表的都是5′到3′方向，并在rRmY SELEXTM条件下筛选，其中嘌呤(A和G)和嘧啶(U和C)是2′-OMe。在一些实施方案中，发明包括了含有下表7中所描述核酸序列的适体。在另一些实施方案中表7中所描述适体的核酸序列还包括3′帽子(3′反向dT(3T))，和/或5′胺(NH2)修饰，修饰后便于化学连接，和/或连接到高分子量非免疫原化合物(例如，PEG)。
表7rRmY独特克隆序列信息SEQ ID NO 56GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAUCUGGGCGAGCCAGUCUGACUGAGGAAGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 57GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGCGGUCGGGUGUGUGGAGGAAGUAGUUCGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 58GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGACGUUAAUGCAGCGGCUAGGGAUGGGCAGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 59GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGCGUGUUGGUAGGGUACGACGAGGCAUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 60GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACUGAGGGAUAAUACGGGUGGGAUUGUCUUCCCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 61GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAAAAAGAUAUGAGAGAAAGGAUUAAGAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 62GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAAGAAGAUAUGAGAGAAAGGAUUAAGAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCG
SEQ ID NO 63GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAAAAAGAUAUGAGAGAAAGGAUUAAGAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 64GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAAAAAGAUAUGAGAGAAAGGAUUAAGAGGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 65GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAAAAAGACAUGAGAGAAAGGAUUAAGAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 66GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACNAAAAAGUAUAUGAGAGAAAGGAUUAANAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 67GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAAAAAGAUAUGAGAGAAAAGGAUUGAGAGAUGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 68GGGAGAGGAGAGCACGUUCUACGAAAAAGAUAUGGAGAGAAAGGAUUAAGAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 69GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAAAAAGAUAUGAGAGAAAGGAUUAAAAGAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 70GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAANAAGAUACAUAGUAGAAAGGAUUAAUAAGACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 71GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGGCGUGUUGGUAGGGUACGACGAGGCAUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 72GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGCAAAAAUGUGAUGCGAGGUAAUGGAACGCCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 73GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGGACCUCAGCGAUAGGGGUUGAAACCGACACGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 74GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAUGGUCGGAUGCUGGGGAGUAGGCAAGGUUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 75GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGUAUCGGCGAGCGAAGCAUCCGGGAGCGUUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 76GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGUAUUGGCGCGCGAAGCAUCCGGGAGCGUUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 77GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACUUAUACCUGACGGCCGGAGGCGCAUAGGUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 78GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAUGGUCGGAUGCUGGGGAGUAGGCAAGGUUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCG
SEQ ID NO 79GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACACGAGAGUACUGAGGCGCUUGGUACAGAGUCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 80GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGAAGGUAGAAAAAGGAUAGCUGUGAGAAGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 81GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACUGAGGGAUAAUACGGGUGGGAUUGUCUUCCCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 82GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAUUGAGCGUUGAAGUUGGGGAAGCUCCGAGGCCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 83GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGCGGAGAUAUACAGCGAGGUAAUGGAACGCCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 84GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGAAGACAGCCCAAUAGCGGCACGGAACUUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 85GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCGGUUGAGGGCUCGCGUGGAAGGGCCAACACGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 86GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAUAUCAAUAGACUCUUGACGUUUGGGUUUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 87GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACAGUGAAGGAAAAGUAAGUGAAGGUGUGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 88GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGGAUGAAAUGAGUGUCUGCGAUAGGUUAAGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCGSEQ ID NO 89GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACGGAAGGAAAUGUGUGUCUGCGAUAGGUUAAGCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUGAAGGGCG实施例2适体修饰实施例2ArRfY IgE 克隆最小化
尽量使实施例1A中描述的IgE适体最小化，同时保持，优选改善适体的结合亲和力。为了鉴定h-IgE结合所必需的核心结构元件，确定了其中几个高亲和力h-IgE粘合物的3′边界。MA转录产物在5′末端以γ-32P ATP和T4多聚核苷酸激酶标记。放射性标记的配体部分碱水解并在硝化纤维过滤分开之前选择性的在溶液中连接到h-IgE 500nM。保留的寡核苷酸在8％的变性聚丙烯酰胺凝胶上被分解。最小的寡核苷酸连接到结合到h-IgE定义的3′封端。经过选择的克隆的3′封端在表8中描述。在边界实验和预测折叠视觉观测的基础上，制备部分结构并从整合DNA技术(Coralville，IA)上排序寡核苷酸片段。通过前述的夹层过滤结合试验可以检测到核酸序列与序列号11，序列号18和序列号21一致的母克隆的最小化产物显示了明显的蛋白质结合力。表8中显示小型结合数据在，而表9中显示了相应的序列。
表8小序列结合活性

*所有的测量都是在1X SHMCK和0.1mg/mL tRNA中操作
除非另有特别说明，下面列出的每个序列代表的都是5′到3′方向，并在rRmY SELEXTM条件下筛选，其中嘌呤(A和G)是2′-OH，嘧啶(U和C)是2’-氟。在一些实施方案中，发明包括了含有下表9中所描述核酸的适体。在另一些实施例中表7中所描述适体的核酸序列还包括3′帽子(例如，3′反向dT(3T))和/或5′胺(NH2)修饰，以便于化学连接，和/或连接到高分子量非免疫原组合物(即，PEG)。
表9rRfY最小化适体的序列SEQ ID NO 90GGGAAAAGCGAAUCAUACACAAGACGUCGCCAGAUUGAGUGUCGUGGUUSEQ ID NO 91GGAAUCAUACACAAGACGUCGCCAGAUUGAGUGUCGUGGUUCCSEQ ID NO 92GGAAUCAUACACAAGACGUCGCCAGAUUGAGUGUCGUGGUUSEQ ID NO 93GGAGAUCCGAGGGUGGGCAAUAGGCUCACAAGGGUUUSEQ ID NO 94GGAUCCGAGGGUGGGCAAUAGGCUCACAAGGGUCCSEQ ID NO 95GGAAUCAUACACAAGACGUCAGUAAGAUUGAGUGUAUGGUUCCSEQ ID NO 96 GGAAUCAUACACAAGACGUCAGUAAGAUUGAGUGUAUGGUU实施例2BdRmY IgE克隆最小化
尽量将实施例1B中描述的dRmY IgE适体最小化，同时保持，优选改善适体的结合亲和力。在检测与核酸序列序列号43和序列号46一致的克隆的预测折叠情况的基础上，设计了一组最小化的序列。最高亲和力的分子，ARC445(序列号101)是一个含有23个核苷并与22 nMKD的h-IgE结合。数据汇总在表10中。表11显示了ARC441到ARC447(序列号97-103)的核酸序列，源于与核酸序列序列号43和序列号46一致的克隆的部分片段。
表10最小化dRmY h-IgE粘合物

KD测量是在含有0.1mg/mL，1mg/mL tMA和0.1mg/mL ssDNA BSA的IX PBS 25℃中进行30分钟。
除非另有特别说明，下面列出的每个序列代表的都是5′到3′方向，并在rRmY SELEXTM条件下筛选，其中嘌呤(A和G)是脱氧的，嘧啶(U和C)是2’-氧-甲基嘧啶。在一些实施方案中，发明包括了含有下表11中所描述核酸序列的适体。在另一些实施方案中表7中所描述适体的核酸序列还包括3′帽子(3′反向dT(3T))，和/或5′氨基(NH2)修饰，便于化学连接，和/或连接到高分子量非免疫原组合物(例如，PEG)。
表11与核酸序列序列号43和序列号46一致的克隆部分片段。
SEQ ID NO 97(ARC441)UUCUGGGGACCCAUGGGGGAASEQ ID NO 98(ARC442)GUUCUGGGGACCCAUGGGGGAACSEQ ID NO 99(ARC443)AGUUCUGGGGACCCAUGGGGGAACUSEQ ID NO 100(ARC444)GCCUGGGGACCCAUGGGGGGCSEQ ID NO 101(ARC445)AGCCUGGGGACCCAUGGGGGGCUSEQ ID NO 102(ARC446)UAGCCUGGGGACCCAUGGGGGGCUASEQ ID NO 103(ARC447)GCCUGGGGAACCAUGGGGGGC实施例2C掺杂物再筛选ARC445
掺杂物再筛选是用来探究活性克隆或最小化物所必需的序列。掺杂物再筛选中，筛选是在已经合成的并退化的序列库中进行，序列库是基于单序列设计的。退化水平在野生型核苷70％到85％的范围内。总体上，观测到中性突变体，但在一些情况下序列的变化可引起亲和力的改变。组合物序列的信息可用于鉴定最小的结合基序，对适体医药化学也有帮助。
基于最小化的h-IgE结合序列ARC445(序列号101)(实施例2B中描述)，使用掺杂物混合物进行筛选以鉴定更高亲和力的粘合物。筛选是针对固定于疏水板表面上的h-IgE，并利用促进筛选更高亲和力适体的技术，如若干更长洗涤物的混合物(例如，30分钟，60分钟，过夜)。
序列库制备使用ABI EXPEDITETMDNA合成仪合成并用标准方法去保护序列5′-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGCCTGGGGACCCATGGGGGGCTGGTCGATCGATCGATCATCGATG-S′(序列号104)。粗体的核苷85％的可能是所指出的残基，5％的可能是其他三个核苷的一个。模板使用5′引物5′-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC-3′(序列号52)和3′引物5′-CATCGATGATCGATCGATCGACC-3′(序列号105)来扩增，扩增产物作为模板使用T7 MA聚合酶(Y639F)在体外转录。转录中使用了200mM Hepes，40mM DTT，2mM亚精胺，0.01％TritonX-100，10％ PEG-8000，9.6mM MgCl2，2.9mM MnCl2，30μM GTP，2mM mCTP，2mM mUTP，2mM dGTP，2mM dATP，2mM GMP，2mM亚精胺，0.01urits/μl无机焦磷酸酶，和T7聚合酶(Y639F)。
筛选。筛选的每一轮都是室温下于100μL 1X Dulbecco′s PBS中将20 pmoles h-IgE固定于Nunc Maxisorp疏水板表面上1小时而引发的。然后除去上清，用120μL 1 X DPBS洗涤缓冲液洗孔。加入100μL封闭缓冲液(1 X Dulbecco′s PBS，0.1mg/mL tMA，0.1mg/mL蛙鱼精DNA，和0.1mg/mL BSA)将孔封闭，室温下培育1小时。然后除去上清，用120μL洗涤缓冲液冲洗孔。在第二轮开始，MA库需要在在空孔中阴性结合培育1小时，在用BSA封闭的孔中阴性结合培育。通过在100μL的1 X Dulbecco′s PBS中将100 pmoles MA混合物加入到靶孔中进行阳性筛选。再加入0.1mg/mL tMA和0.1mg/mL蛙鱼精DNA到阳性选择中。室温下培育一小时后除去上清，用表12列出的洗涤缓冲液(1 X DPBS)120μL洗涤孔五次。将第3和4轮筛选的混合物分开增加额外筛选。更长时间的洗涤可增加筛选严格度。
使用ThermoScript RT-PCRTM系统(Mvitrogen)，在100μl反应液65度下对MA进行反转录30分钟，使用3’引物与序列号5一致，PCR扩增cDNA，PCR扩增条件20mM Tris pH8.4，50mM KCl，2mM MgCl2，0.5μM 5′引物(序列号52)，0.5μM 3′引物(序列号105)，0.5mM每种dNTP，0.05units/μL Taq聚合酶(New Engl和Biolabs)使用PCR循环数(表12最后一栏)需要能在4％琼脂糖凝胶中获得一条带(Mvitrogen，Carlsbad，CA)，按照推荐(-48ng DNA)(New Engl和Biolabs，编目号N3231L，Beverly，MA)使用，上样时其强度与100bp DNA梯度上100bp标记物相同。PCR产物使用Centrisep Spm柱(Prmceton Separations)进行脱盐。模板在37度下转录过夜，使用200mM Hepes，40mM DTT，2mM亚精胺，0.01％ TritonX-100，10％ PEG-8000，9.6mM MgCl2，2.9mM MnCl2，30μM GTP，2mM mCTP，2mM mUTP，2mM dGTP，2mM dATP，2mM GMP，2mM亚精胺，0.01units/μl无机焦磷酸盐，T7聚合酶(Y639F)。随后几轮中的MA 10％的聚丙烯酰胺上纯化。下表12显示ARC445(序列号101)掺杂物再筛选方案的总结。
表12.ARC445(序列号101)掺杂物再筛选方案常规条件

开始于第3轮的长洗涤(从第3轮模板中分开)

开始于第4轮的长洗涤(从第4轮模板中分开)
使用TOPO TA克隆仪(Mvitrogen，CarlsbadCA)克隆DNA，这些DNA是在筛选最后一轮不同条件下和在第2和3轮中非严格筛选中获得的。合成筛选出7条序列并使用斑点杂交试验和实施例1B中叙述的的条件检测其与h-IgE的特异亲和力。检测的克隆都不显示和h-IgE的明显的结合。下表13显示了来自ARC445掺杂物再筛选的克隆序列。
除非另有特别说明，下面列出的每个序列代表的都是5′到3′方向，并在dRmY SELEXTM条件下筛选，其中嘌呤(A和G)是脱氧嘌呤，所有的嘧啶(U和C)是2’-氧-甲基嘧啶。在一些实施方案中，发明包括了含有下表13中所描述核酸序列的适体。在另一些实施方案中，表13中所描述适体的核酸序列还包括3′帽子(即，3′反向dT(3T))，和/或5′氨基(NH2)修饰，便于化学连接，和/或连接到高分子量非免疫原化合物(如，PEG)。
表13. ARC445掺杂物筛选克隆的序列SEQ ID NO 106 ARC664AGCCUGGGGACCCAUGGGGGCUSEQ ID NO 107 ARC665CGCCUGGGGACCCAGGGGGGGCUSEQ ID NO 108 ARC666AGCCUGGUGGCCCAUGGGGUGCUSEQ ID NO 109 ARC667AGCCUGGGGACCCAUGGGGGGUGGUSEQ ID NO 110 ARC668AGUCUGGGGACAGAUGGAUGGCUSEQ ID NO 111 ARC669AGCUGUGGAGUCGUGUGGGGCUSEQ ID NO 112 ARC670AAGCCUGGGGACCCAUGGGGGGGCU实施例2DDNA IgE适体的掺杂物再筛选
基于h-IgE结合序列D17。45′-GGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCC-3′(序列号113)(US 5,686,592在此整体并入参考文献)使用掺杂物序列库进行筛选以鉴定出更高亲和力的粘合物。筛选是针对固定于疏水板表面的h-IgE，使用的技术是用以促进筛选更高亲和力适体，如多种不同时间下洗涤的混合物(即30分钟，60分钟，过夜)。实验产生了许多与h-IgE亲和力增加的D17.4衍生物。
库列库制备含有序列5′gatcccttgttcagtccGGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCCttaagccacaggactccaaa-3′(序列号114)的DNA模板(ARC273)其中引物结合位点用小写字母表示，粗体的核苷有85％的可能代表所指出的残基，有5％的可能表示另外3个核苷中的其中一个。使用ABI EXPEDITETMDNA合成仪合成模板并用标准方法去保护。使用标准条件将混合物采用5’引物5′-GATCCCTTGTTCAGTCCG-3′(序列号115)和3′引物5′-GGAGTCCTGTGGCTTArA-3′(序列号116)(其中rA代表核糖腺苷，可使引物在PCR后分开，将模板和混合物条带在凝胶上分离)进行扩增。产物进行碱水解(200mMNaOH，90℃，15mm)并用异丙醇沉淀。在8％的聚丙烯酰胺凝胶分离双链，ssDNA混合物有很低的迁移率，将其从凝胶上割开。
筛选的每一轮都是在室温下于100μL筛选缓冲液(1 X SCHMK；参见实施例1A)中将20 pmoles h-IgE固定于Nunc Maxisorp疏水板表面上培育1小时而引发。然后除去上清，用120μL洗涤缓冲液(1 X SCHMK，0.2％ BSA和0.5％ Tween-20)冲洗孔四次。加入100μL封闭缓冲液(1 X SHMCK，1％ BSA，0.5％Tween-20)室温下培育1小时将孔封闭。然后除去上清，用120μL洗涤缓冲液洗涤孔四次。在第一轮中将80pmoles混合物DNA(1.5×1013特异分子)在100μL筛选缓冲液于室温下在空白孔内培育1小时，作为阴性筛选步骤以除去非特异粘合物。除去上清，在1 X SCHMK中加入12μL of 9.1mg/mL蛙鱼精子DNA，混合物转移到含有靶蛋白的孔内。培育1小时后室温下除去上清，多次用120μL洗涤缓冲液洗涤孔。下表14显示了掺杂物再筛选的筛选条件。
表14筛选严格度作为每一轮及洗涤的函数
在所有的情况下，连接到经固定化处理的h-IgE的混合物DNA用2×150μL热洗提缓冲液洗涤(7M Urea，100mM NaOAc pH5，3mM EDTA)，加入异丙醇沉淀，然后PCR扩增。筛选第一轮后洗提的DNA按照上述方法进行扩增并纯化。在标准条件下，使用5′和3′引物序列号115和序列号116，进行初始DNA掺杂物序列库的扩增。第2到4轮，洗提的DNA用5′和3′引物序列号115 5′-(5-biotm-T)(5-biotm-T)(5-biotm-T)GGAGTCCTGTGGCTTAA-3′(序列号117)。PCR产物用苯酚萃取，乙醇沉淀。在5-10μl of IX SCHMK缓冲液中加入300 pmoles中性链亲和素(Pierce，Rockford，IL)使DNA悬浮，室温下培育30分钟，然后加入10μl甲酰胺上载染液，在8％变性的聚丙烯酰胺上分离。整个变性过程中，生物素-中性链亲和素复合物保持完整，抗过敏DNA链的移动性相对于过敏DNA链显著降低。这样链被分开，有比较高的迁移率的目的ssDNA混合物成员，从胶上切下来进入筛选的下一轮。
筛选第三到第五轮后，使用TOPO TA克隆仪(Mvitrogen)和5′和3′引物序列号115和5′-GGAGTCCTGTGGCTTAA-3′(序列号118)(完全未被修饰的DNA)对混合物模板进行在扩增t，生成了84个序列。每个制备克隆无引物结合序列，并使用建立的斑点杂交试验和前面实施例1A中的条件检测克隆与5和50nM h-IgE的结合。和初始监测中下列序列号核酸序列一致的克隆未显示与h-IgE结合序列号125，序列号137和序列号138。使用滴定h-IgE(30pM至30nM，3倍稀释)(表15)，确定KDs以鉴定在初始监测中最好的结合物。其中几个克隆与母序列相比显示了经改善的结合力D17.4(序列号113)。含有核酸序列序列号140的克隆相对于母序列D17.4(序列号113)在亲和力方面显示出最大程度的改善。有趣的是含有序列序列号140的克隆和克隆D17.4(序列号113)之间的差别很微弱。变化包括含有核酸序列序列号140的克隆在已提出的Watson/Crick骨架直接接近于D17.4适体(序列号113)的环形区。几乎所有再筛选中(包括含有核酸序列与序列号140一致的克隆)获得的特异克隆都在D17.4的G8-C30碱基对上获得了突变变成了A8-T30或C8-G30，有效的改变了螺旋链大沟中出现的功能基团，该功能基团位于碱基对G8-C30的5′-链-羰基/3′-链-氨基和碱基对A8-T30与C8-G30 5′-链-氨基/3′-链-羰基之间。亲和力最大的克隆(除了与序列SEQ DD NO 140一致的克隆)根据其自身的环序列(残基9-29)重新设计，并基于与核酸序列号140(残基1-8和30-37)序列一致的克隆的骨架对其进行优化。在序列号140优化的骨架上将错配的C4-C34转化成G4-C34。下表15显示了核苷长度和被选择DNA适体的亲和力。表16显示了被选择DNA适体的核苷序列。
Table 15被选择DNA适体的长度和连接亲和力
下面描述的DNA适体中，所有的核苷(A，T，C和G)都是脱氧的。除非有特殊注释，每个序列代表的的都是5′到3′方向。在一些实施方案中，发明包括含有表16所描述的核酸序列的适体。在另一些实施方案中，表16中描述的适体的核酸序列还包括了增加了3′帽子(即，3′反向dT(3T))和5′端氨基修饰，便于化学连接和/或连接到一个高分子量非免疫原性的组合物上(如PEG)。
表16 DNA h-IgE掺杂物再选择适体序列信息(列出的克隆序列不包含引物区域)SEQ ID NO 113 D17.4GGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCCSEQ ID NO 119GGGGCACATTTATCCGTCCCTCCTAGTGGTTGTGCCCCSEQ ID NO 120 GGGGTACCTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGGGTGCCCCSEQ ID NO 121 GGGGTACCTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGGGTACCCCSEQ ID NO 122 GGGGCAAATTTATCCGTCCCTCCTAGTGGTTTGCCCCSEQ ID NO 123 GGGGCATATTTATCCGTCCCTCCTAGTGGTATGCCCCSEQ ID NO 124 GGGGCACATTTATCCGTTCCTCCTAGTGGTGTGCCCCSEQ ID NO 125GGGGTACATTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCATGCCCCSEQ ID NO 126GGGGCATGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCATGCCCCSEQ ID NO 127 GGGGCAACTTTATCCGTTCCTCCTAGTGGGTTGCCCSEQ ID NO 128GGGGCACATTCATCCGTCCCTCCTAGTGGTGTGCTCC
SEQ ID NO 129GGGGTACCTTGATCCGTCCCTCCTAGTGGGGTGCCCCSEQ ID NO 130GGGGCATGTTTATCCGTTCCTCCTAGTGGCATGCCCCSEQ ID NO 131GGGGCAGCTTTATCCGTTCTCCTAGTGGGCTGCCTCSEQ ID NO 132GGGGTACCTTTATCCGTTTCTCCTAGTGGGGTGCCCCSEQ ID NO 133 GGGGTATGTTGATCCGTCCCTCCTAGTGGCATGCCCCSEQ ID NO 134 GGGGCATGTTCATCCGTTCCTCCTAGTGGCGTGCCCCSEQ ID NO 135GGGACACATTTATCCGTTACTCTTAGTGGTGTGCCCCSEQ ID NO 136 GGGGCACATTTATCCGTTACTCTTAGTGGTGTGCCCCSEQ ID NO 137GGGGCACGTTTACAGTCCCTCCTATCGCCTCCCSEQ ID NO 138GGGGCACGTTTACAGTCCCTCCTTATCGCCTCCCSEQ ID NO 139 GGGCAACTTTATCCGTTCCTCTTAGTGGGTTGCCCCSEQ ID NO 140 GGGCTACTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGGTAGCCCCSEQ ID NO 141GGCACCTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGGGTGCCCCSEQ ID NO 142 GGGGCACCTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGGGTGCCCCSEQ ID NO 143 GGGCACATTCATCCGTTCCTCCTAGTGGTGTGCCCCSEQ ID NO 144 GGCACCTTTATCCGTTCCTTCTAGTGGGGTGCCCSEQ ID NO 145 CGGCACCTTTATCCGTTACTCTTAGTGNGGTGCCCCSEQ ID NO 146 GGCACCTTGATCCGTTCCTCCTAGTGGGGTGCCCCSEQ ID NO 147 GCGGGCAAATTCATCCGTCCCTCCTAGTGGTTTGCCCSEQ ID NO 148GGGCACTTTATCCGTTCCTTCTAGTGGGTGTCCCSEQ ID NO 149GGCGGCAGCTTTATCCGTACCTCCCAGTGGGCTGCTCCSEQ ID NO 150 ARC474GGGGCAGCTTTATCCGTACCTCCCAGTGGGCTGCCCCSEQ ID NO 151 ARC475 GGGGCTACTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGGTAGCCCCSEQ ID NO 152 ARC476GGGGCTACTTTATCCGTACCTCCCAGTGGGTAGCCCCSEQ ID NO 153 ARC477 GGGGCTACTTGATCCGTCCCTCCTAGTGGGTAGCCCCSEQ ID NO 154 ARC478 GGGGCTACTTCATCCGTCCCTCCTAGTGGGTAGCCCC
SEQ ID NO 155 ARC479 GGGGCTACTTTATCCGTTCCTCTTAGTGGGTAGCCCCSEQ ID NO 156 ARC480 GGGGCTACTTTATCCGTTCCTCCTAGTGGGTAGCCCCSEQ ID NO 157 ARC656GGGGCTACTTTATCCGTTCCTCCTAGTGGGTAGCCCC-3T实施例2用以增加血浆中稳定性和体外亲和力的ARC445适体医药化学
通过系统合成方法包括适体合成多相，纯化和结合活力检测而鉴定出ARC445(序列号101)的一个高度稳定和有效的变异体。修饰，比如用含有2’-O-甲基残基置换含有2′-脱氧残基的系统置换法是一种用于显著增加血浆核酸酶抵抗力和总稳定性的基本方法。
在生成ARC445(序列号101)的克隆监测和最小化过程中，适体的相对结合能力(前面述的斑点杂交试验得到)，ELISA，FACS，组氨酸释放试验(下实施例3描述)都非常一致。因此，大多数的实验衍生物都检测了和h-IgE结合的亲和力，并用来表示相对结合能力。使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，5′末端标记的γ-P ATP，来纯化化学合成的适体，以确定KD。并测试这些化学合成适体与人h-IgE的直接结合情况。8点蛋白滴度用于前述的斑点杂交结合试验(即{100nM，30nM，10nM，3nM，1nM，300pM，100pM，0pM}或{10nM，3nM，1nM，300pM，100pM，30pM，10pM，0pM})在含有0.1mg/ml BSAD的Dulbecco′s PBS(含有Mg++和Ca++)中室温下半小时。使用KaleidaGraph(KaleidaGraph v.3.51，Synergy Software)通过代入公式y＝(max/(1+K/protem))+ymt来计算KD值。下面表17中列入合成的，纯化的，检测的与h-IgE结合的ARC445衍生物的序列以及蛋白结合特性。
用2′-O甲基残基替换脱氧残基过程的第一步是合成和检测ARC 1250-ARC 1264(序列号158-172)的结合活力，其中每个都与增加了3′-反向-dT(3T)和用2′-O-甲基残基替换了2′-脱氧残基的ARC445结合活性相当。从表17中的结合数据可以看出，一些位置容易容受2′-O-甲基残基替换脱氧残基，而另一些位置则不是。有趣的是，在位点10(ARC1256)(序列号164)以2′-O-甲基残基替换2′-脱氧残基显著改善亲和力。
基于适体医药化学过程相1产生的结构活性关系结果，我们设计，合成，纯化又一系列的适体，并检测与h-IgE的结合。对这些分子和所有衍生分子，亲和力(KD)＜1nM的分子或更好的分子用于进一步的适体设计策略中。在产生ARC1332-ARC1337(序列号173-178)的相2中，只使用2′-O-甲基替换法，相1中的数据用于设计更高级修饰的组合物分子。加入了含有联接的稳定化处理的硫代磷酸酯的适体也被检测。这些之中简单亲和力最佳的是ARC1335(序列号176)。
在适体医药化学过程的相3(ARC1382-ARC1384，序列号179-181)和相4(ARC1572-1573，序列号182-183)中，在ARC1335(序列号176)中进一步检测硫代磷酸酯修饰作用。ARC1384(序列号181)是这有限适体中能打破了硫代磷酸酯的平均数目与最大亲和力之间的平衡的一个分子(参见图7)。
ARC445和其衍生物的合成过程中，在离子交换高效能液体色谱中观察到的峰与ARC445多亚基聚合体一致。图8是ARC445和几个衍生物高效能液体色谱微量分析的实施例，由于适体的集合显示多重峰。ARC445在位置6-9和16-21包含了2串鸟苷残基。尽管不受任何理论的约束，这2串中的任何一个或两者都可能引起适体集合。根据报道，以基本同样的方式，结合了双链MA和DNA溴化乙啶荧光性就增加了，结合了G-四连体(G-quartet)结构后N-甲基中卟啉IX(NMM)荧光性也增加。(Arthanari等人，Nucleic Acids Research，26(16)3724(1996)；Marathais等人，Nucleic Acids Research，28(9)1969(2000)；Joyce等人，Applied Spectroscopy，58(7)831(2004))。如图9中显示，我们使用NMM荧光性建立了理论ARC445实际上采用了G-quarte结构。根据文献方案，使用SpectraMaX Gemmi XS荧光板阅读器分析了含有大约1微摩尔NMM100微升反应物和含有镁和钙的Dulbecco′s PBS中大约2微摩尔的适体。收集550到750nm和405nm波长刺激下的荧光发散色谱。抗凝血酶DNA适体ARC183的G-quartet结构已经在文献(Macaya等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，903745(1993))中建立起来，因此在本实验中可作为阳性对照(图10)。图10显示了与ARC445大小相似核苷成分相似适体并没有被预测含有G-quartet结构，因此在本实验中用做阴性对照(图10)。从图9和10可以看出，相对于NMM单独作用相比，ARC183和ARC445的NMM荧光性明显增加，而ARCl 346则没有增加。
除了用dG类似物取代dG并监测在NMM荧光试验中的″G-四连体″最小化之外，还用斑点杂交试验在前叙述的结合反应条件(Dulbeccos PBS(含有Ca++″和Mg++)加0.1mg/mL BSA室温下30分钟)检验dG类似物是否改善了与h-IgE的亲和力以及对h-IgE的作用。第一个测试的类似物是脱氧-7-脱氮G。在嘌呤基第七位的氮被碳取代，G-四连体中G∶G配对所需要的氢键受体被有效的除去。在相5.1(序列号184-201)中ARC445每个G都被7-脱氮G取代。从图8和9中可以看出，HPLC和NMM荧光中观测到，位置18-20(ARC909-911，序列号191-193)去掉G N-7之后则完全除去了通过HPLC中观察到的适体集合。这些取代也完全除去了与h-IgE的结合，如图11所显示的结合曲线已经表明这点(参见表17中报道的KD值)。在HPLC中也观察到ARC912(序列号194)适体集合也显著减少，并保留了一定程度上与h-IgE的结合。基于ARC912(序列号194)的结合结果和其HPLC，位置3∶21的mC∶dG配对被另一个Watson/Crick配对碱基所取代，以减少多亚基集合。该配对在位置21上没有dG。在ARC1244-ARC1249(序列号195-200)中都进行了这样的操作，但是没有产生亲和力和ARC445(序列号101)相当的任何适体。因此这种修饰作为ARC445修饰方式被放弃。
尽管并不希望受到理论上的限制，用7-脱氮-G取代dG的试验提出了一种观点16到21位较长的G-序列串可能是引起集合现象的原因，测试的许多残基的N-7位是与h-IgE高亲和力结合所必需的，通过直接的氢键相互作用或通过和适体中其他残基的相互作用，促进适体的功能性折叠。
在适体医药化学过程(序列号201-211)的相5.2中，在含有ARCl 335(序列号176)的适体下，dG被脱氧次黄嘌呤所取代。由于脱氧次黄嘌呤缺乏脱氧鸟苷里发现的环外氨基酸，单个氨基和N7之间的氢键从每个dG被替换成dI的G-四聚体中去除掉。ARCs 1548，1552-1555和1562-1567(序列分别是相应的序列号201-211)的结合试验揭示了dG被替换成dI的SAR关系，几乎与dG替换成7-脱氮-G的关系相反。在dI系列中位置6-9上不能容受取代，而在位置16-21上则能不同程度的容受。
相5.2的结果导致了在ARC1384条件下对含有多个dG替换为dI取代的组合物分子的设计。5.3(序列号212-219)的结果产生了大量的适体，这些适体相对于ARC445(序列号101)和ARC1384(序列号181)明显的改进了亲和力。例如，图12描述，通过NMM荧光试验检测到ARC1666(序列号216)明显减少了G-四聚体的形成。
在一些实施方案中，发明包含了含有表17描述核酸序列的适体。在一些实施方案中，还包括含有表17描述适体的核酸序列的3′帽子，{如反向dT帽子(3T))，和/或5′氨基(NH2)修饰，而表17中没有这些修饰，以便于化学结合或连接到高分子量非免疫原组合物(即，PEG)上。在另一些实施方案中，表17描述的核酸序列没有所表示的3′帽子(即，3′反向dT帽子(3T))。小写字母“f’，″m″，和″d″分别表示2’-氟，2-O-甲基和脱氧修饰，″s″表示一个核苷间硫代磷酸取代，″I″表示次黄嘌呤取代鸟苷。
表17ARC445被修饰的衍生物的序列和结合亲和力




实施例2FARC656适体医药化学
通过系统合成方法，包括适体的多相合成，纯化和结合活性分析，来识别高稳定性高潜力的ARC656变异体(序列号157)(如实施例2D所描述)。用含有残基的2’-O-甲基置换含有残基的2′-脱氧的系统置换法是一种用于显著增加血浆核酸酶抵抗力和总稳定性的基本方法。
在生成ARC656(序列号157)的克隆监测和最小化过程中，适体的的相对结合能力(如前面描述的斑点杂交实验测量)，ELISA，FACS，组氨酸释放试验(下实施例3描述)都非常一致。因此，使用斑点杂交结合试验检测实验变异体与h-IgE的结合亲和力的实验用来表征大多数合成适体的相对能力。化学合成适体使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化，5′末端标记的γ-32P ATP，测试其对全人h-IgE的直接结合力以确定KD。在前述的斑点杂交试验在Dulbecco′s含有0.1mg/ml BSA的PBS(含有Mg++和Ca++)中使用到8点蛋白质滴度{30nM，10nM，3nM，1nM，300pM，100pM，30pM，0pM}。使用KaleidaGraph(KaleidaGraph v.3.51，Synergy Software)代入公式y＝(max/(1+K/protem))+ymt来计算KD值。下面表18列出了合成的，纯化的，以及与h-IgE结合的ARC445衍生物序列，以及蛋白质结合特性结果。
用2’-O-甲基包含残基替换脱氧包含残基过程的第一步是合成和检测ARC1265-ARC1306(序列号220-261)的结合活性，其中每个都与增加用2’-O-甲基残基替换脱氧残基的ARC656结合活性相当。从表18中的结合数据可以看出，一些位置容易容受2’-O-甲基残基替换脱氧残基，而另一些则不是。被提出的ARC656骨架区最能容受2’-O-甲基残基替换脱氧残基。另外，相一还包括在适体骨架区阻断脱氧残基被2’-O-甲基残基取代。
基于适体医药化学设计的相1结构活性关系结果，设计，合成，纯化又一系列的适体，并检测与h-IgE结合情况。对添加了含有联接(ARC1391(序列号266)和ARC1417(序列号292))的稳定硫代磷酸之后的适体也进行了检测。这些之中在简单亲和力方面最好的是ARC1410(序列号285)。尽管许多测验的许多构造物都保留了相对高的与h-IgE的亲和力(这一点是非常清晰的)，但是几乎没有保留和母组合物ARC656(序列号157)相当的亲和力。
在一些实施方案中，发明包括了含有下表18描述核酸序列的适体。在一些实施方案中，表18描述适体的核酸序列还包括3′帽子(3′反向的dT帽子(3T))，和/或5′氨基(NH2)修饰，以便于化学结合或连接到高分子量非免疫原化合物(即，PEG)上，而表18描述的核酸序列则缺少这种修饰。在另一些实施方案，表18描述的核酸序列没有所表示的3′帽子(即，3′反向dT帽子(3T))。核苷缩写A，C，G，或T之前的小写字母″f′，m″，和″d″分别表示2’-氟，2-O-甲基和脱氧修饰，″s″表示核苷间硫代磷酸取代。
表18修饰衍生物ACR656的序列和结合亲和力




实施例2G适体-5′-PEG连接体的合成
在AKTA OligoPilot 100合成仪上(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)，依照推荐使用程序使用标准的购买的2，-氧-甲基MA，脱氧次黄嘌呤和DNA亚磷酰胺(Glen Research，Sterlmg，VA)和反向脱氧胸腺嘧啶CPG支持合成寡核苷酸5′NH2 mA mG mC mC mU dG mG dG-s-dG mA mC mC mCmA mU-s-dI-s-mG dI-s-dG dI-s-dG mC mU-idT 3′(ARC 1666，序列号216)。末端氨基官能团与5′-氨基-修饰C6-TFA (Glen Research，Sterlmg，VA)连接。去保护之后，寡核苷酸经离子交换色谱Super Q 5PW(30)树脂(Tosoh Biosciences)进行纯化，并用乙醇沉淀。
合成之后将5′氨基修饰适体组分连接到不同的PEG基团上(如40kDa，60kDa PEG基团)。适体溶解于水/DMSO(1∶1)溶液中，浓度在1.5到3mM之间。加入碳酸钠缓冲液，pH8.5，直到终浓度是100mM，只有少数分子与1.7-3倍于目的PEG试剂的分子发生反应(即，40 kDa Sunbright GL2-400NP p-硝基苯碳酸酯[NOF Corp，Japan]，40kDa或60kDa mPEG2-NHS酯[Nektar，Huntsville AL])，目的PEG试剂溶解于等体积的乙腈。产生的40kDa或60kDa PEG化产物在离子交换色谱Super Q 5PW(30)resm(Tosoh Biosciences)上纯化，使用反相色谱Amberchrom CG300-S resm(Rohm和Haas)上脱盐，并冷冻干。
产生的PEG化适体序列列于下表19中。小写字母“f”，″m″，和″d″分别表示2’-氟，2-O-甲基和脱氧修饰，″s″表示核苷间磷酸取代，″I″表示次黄嘌呤取代鸟苷，″NH″表示便于化学连接的氨基，″3T″表示3′反向dT。
表19抗IgE适体ARC1666的5′PEG连接体ARC1787(SEQ ID NO 293)40K-NH-mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3TARC1788(SEQ ID NO 294)60K-NH-mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T
5′PEG化产物对适体功能几乎没有作用，这是通过下面实施例3描述的基于细胞的检测测量到的。
实施例2H适体-3′-5′-PEG连接体的合成
依照推荐使用程序采用标准购买的2’-氧-甲基MA，脱氧次黄嘌呤和DNA里的磷酸(Glen Research，Sterlmg，VA)和3′-酞亚胺-氨基-修饰C6 CPG支持在AKTA OligoPilot100合成仪中(GE Healthcare Uppsala，Sweden)合成寡核苷酸5′NH2 mA mG mC mC mU dG mG dG-s-dG mA mC mC mC mA mU-s-dI-s-mG dI-s-dG dI-s-dG mC mU-NH23′(ARC1784，序列号297)。末端氨基酸官能团与5′-氨基-修饰基C6-TFA(Glen Research，Sterlmg，VA)相连接。去保护之后，寡核苷酸经离子交换色谱Super Q 5PW(30)resm(Tosoh Biosciences)和乙醇沉淀进而纯化。
合成后将3′-5′-二氨基修饰适体组分连接到不同的PEG基团上(20kDa和30kDa PEG基团)。将1.5和3mM的适体溶解于水/DMSO(1∶1)的溶液中。加入碳酸钠缓冲液，pH8.5，直到终浓度是100mM，只有少量与2.7-3.5倍于目的PEG试剂的分子(e.g.，20kDa or 30kDa Sunbright GL2-400NP p-硝基苯碳酸酯[NOF Corp，Japan])反应过夜，目的PEG试剂溶解于等体积的乙腈。产生的2×20kDa或2×30kDa PEG化的产物在Super Q 5PW(30)resm(Tosoh Biosciences)在离子交换色谱上纯化，使用反相色谱Amberchrom CG300-S树脂(Rohm和Haas)上除去盐分，并冷冻干。
产生的双PEG化适体序列列于下表20中。小写字母“f”，″m″，和″d″分别表示2’-氟，2-O-甲基和脱氧修饰，″s″表示核苷间硫代磷酸取代，″I″表示次黄嘌呤取代鸟苷，″NH″表示便于化学连接的氨基。
表20抗IgE适体ARC 1666的3′-5′-PEG连接体ARC 1785 (SEQ ID NO 295)PEG20K-NH-mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmGmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-NH-PEG20KARC1790(SEQ ID NO 296)PEG30K-NH-mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-NH-PEG30K
3′-5′PEG化对适体功能有很少的影响或没有影响，下实施例3描述的基于细胞实验的检测到这一结果。
实施例3功能性细胞试验实施例3A受体(FcεR1)结合抑制ELISA
采用ELISA试验测试一组rRfY IgE适体(实施例IA所描述)抑制h-IgE和可溶的单节显性的FcεR1α(室内纯化)形成复合物的能力。IX PBS中的FcεR1(100μL，10μg/mL)在Nunc Maxisorb 96孔板中的孔中4℃培育过夜，以使其吸附于孔表面。除去上清，用120μl IX PBS溶液洗涤孔三次，并用300mL IX PBS和0.2％Tween-20在4℃下封闭孔两小时。封闭之后用IX PBS洗涤孔三次。不同浓度的适体紧接着与0.5nM h-IgE在100μL PBS和0.05％Tween-20中室温下培育30分钟，然后将混合液加入到检验孔中并在室温下培育一小时。用120μL IX PBS洗涤孔五次。通过加入HRP标记的抗h-IgE多克隆抗体(羊抗人IgE-HRP(074-1004)(KPL，Gaithersburg，MD))来检测结合的h-IgE。每个孔中加入100μl Quantablue substrate(Pierce，Rockford，IL)并在室温下培育15分钟。再向每孔中加入100μl提供的终止溶液。板使用SpectraMax 96孔板阅读器分别325nm和420nm的刺激/发散下阅读。每个孔的相对荧光单位(RFU)用来计算IC50。下表21显示计算出的IC50，表示rRfY筛选的不同适体对FcεRIα受体的抑制。
表21受体(FcεR1)结合抑制-rRfY适体

实施例3BFACS抑制受体(FcεR1)结合
检测一组代表rRfY，dRmY和DNA组合物的适体抑制h-IgE结合FcεR1的能力，FcεR1在鼠嗜碱性白血病(RBL)细胞表面表达。SX38细胞是RBL细胞系(Harvard University，Cambridge，MA)能稳定的表达h-IgE受体α，β和γ链，用于流式血细胞h-IgE结合试验。细胞在含有16％胎儿牛血清(FBS)和1mg/mL G418(Mvitrogen)的低限量Eagle培养基(MEM)在37度5％CO2的条件下培养。SX38细胞在含有1％BSA(Sigma，St.Louis，MO)和0.03％NaAzide(FACs buffer)(VWR，WestChester，PA)的1 X DPBS中，一百万个细胞被96孔板板上一个合适的孔数目整除，并在冰上培育30分钟。每种浓度的适体和h-IgE(Athens Research和Technology，Athens，GA)的2X混合液在冰上孵化30分钟。适体与h-IgE的混合物加入到SX38细胞中以获得IX终浓度，并在冰上再培育30分钟。在3μg/mLh-IgE(15nM)下检测终浓度范围在0-1μM中的适体。然后用FACs洗涤细胞3X以除去没有与受体结合的h-IgE。为了检测h-IgE结合，抗h-IgE-FITC抗体(QED Biosciences，San Diego，CA)加入到细胞，并在冰上培育30分钟。培育后，细胞用FACs缓冲液洗涤3次以除去未结合的抗体。细胞在FACs缓冲液中悬浮并用FACSCAN(BD Biosciences，San Jose，CA)分析。h-IgE单独和h-IgE自然混合物被分别包括入阴性对照和阳性对照。通过计算h-IgE与细胞结合的抑制百分比来测定h-IgE适体活性。平均荧光强度值用来计算抑制百分比。表22显示了通过FACS试验计算的被选择的各种rRfY，dRmY和DNA克隆的IC50。
表22FACS试验rRfY，dRmY，DNA克隆受体(FceR1)结合抑制

*idT相同序列3’端是含有反向dT残基的le 3’-endN.D.未确定
使用上述FACS试验和下列的修饰对ARC 445(序列号101)(在实施例2E中描述)和ARC 656(序列号157)(实施例2D中描述)的几个修饰衍生物进行试验检测其h-IgE受体(FceR1)的结合抑制。对每种适体浓度，适体和h-IgE(Athens Research and Technology，Athens，GA)2X的混合物在冰上培育30分钟；适体和h-IgE的混合物加入SX38细胞中，终浓度是IX，在冰上再培育2小时；在0.5μg/mL h-IgE(2.5nM)下检测0-1μM之间的终适体浓度。计算的IC50值总结在表23中。
表23ARC445经修饰的衍生物；FACS试验ARC656受体(FceR1)结合抑制
在实施例2G和2H中描述的与PEG连接的适体在下列条件下FACS试验中都是有活性的。计算的IC50值概括在下表24中。从表24的数据可以看出，不同类型的PEG连接体对适体的功能几乎不起作用。
表24

实施例3C适体与猕猴IgE的交叉反应
采用ELISA检测来测试适体抑制猕猴IgE和FcεR1α-Fc联合体形成的能力。1 X PBS中的FcεR1α-Fc(100mL，5μg/mL)在Nunc Maxisorb 96孔板中的孔中4℃培育过夜以吸附于表面。除去上清，用120μl 1 X PBS洗涤孔三次并用300mL 1X PBS和0.2％Tween-20度两小时封闭孔。用120μL 1 X PBS洗涤孔。不同浓度的适体紧接着在含0.5ng h-IgE的100μL PBS(或猕猴血清(Sigma)同样稀释到10％)室温下培育30分钟，然后将混合液加入到检验孔中并在室温下培育一小时。用120μL 1 X PBS洗涤孔五次。通过加入HRP标记的抗-h-IgE多克隆抗体(羊抗IgE-HRP(074-1004)(KPL，Gaithersburg，MD))来检测结合的h-IgE。使用Quantablue底物(Pierce，Rockford，IL)来检测过氧化物酶活性。每孔中加入100μl过氧化物酶底物并在室温下培育15分钟。在向每孔中加入100μl提供的终止溶液，分别在325nm和420nm刺激/发散下使用SpectraMax 96孔板阅读器进行阅读。每孔的相对荧光单位(RFU)用来计算IC50′s。
具有核酸序列为序列号149(含有3′反向脱氧胸腺嘧啶)和序列号151(3′-3′反向脱氧胸腺嘧啶)的DNA适体和与核酸序列为序列号90和序列号93的rRfY适体分别在250nM和1μM浓度下，并没有抑制猴子结合到FcεR1-Fc上，而核酸序列ARC445(序列号101)和ARC1666(序列号216)的dRm 适体则很可能阻断相互作用(ARC445，猴IC50＝161nM；人IC50＝63nM；ARC1666，猴IC50＝8nM；人IC50＝5nM)，表明该分子与猕猴IgE和人IgE发生交叉反应。另外的对照实验显示该检测模式下ARC445并不抑制猴IgE的检测。
图13显示了rRfY，dRmY和DNA最小化适体可能的二级结构。FACS试验表明DNA最小化适体阻断IgEFcεR1结合的可能最大。左序列号91(rRfY)，列出的残基是2′-F；中间ARC445(序列号101)(dRmY)，下划线的残基是2′-脱氧，列出的残基是2′-OMe；右ARC475(序列号151)(DNA)，下划线残基2′-脱氧。
实施例3D组氨酸释放抑制
基于IgE适体细胞活性通过使用组氨酸释放化验SX38细胞(Dana Farber Cancer Mstitute，Boston，MA)来测验。SX38细胞是能稳定表达人h-IgE受体α，β，和γ链的RBL细胞系。由于含有h-IgE和抗-h-IgE交叉连接抗体的SX38细胞上清液含有比适体受阻断细胞更多的组氨酸，使用竞争性组氨酸ELISA(Immuno-Biological Laboratories，Mmneapolis，MN)来定量释放入h-IgE和h-IgE交叉连接抗体+/-IgE适体处理过的SX38细胞上清液中的组氨酸。
实验前一天在24孔板上每个含有MEM和16％FBS孔中都铺入(200,000)SX38细胞。第二天，适宜浓度的适体(1μM开始2倍稀释系溶液8点滴定)和3ug/mL h-IgE(AthensResearch and Technology，Athens，GA)在MEM和16％FBS中培育30分钟。然后将混合液加入到SX38细胞中在37℃，5％CO2中培育30分钟。每种浓度都检测四分之一。使用MEM和16％FBS洗涤细胞三次，然后再在MEM加16％FBS中再培育5.5小时。h-IgE交叉连接抗体(QED Biosciences，San Diego，CA)加入到1ug/mL浓度的细胞培养基上再培育2小时。在组氨酸ELISA使用前收集上清在-20℃冷冻。组氨酸ELISA按照使用推荐用法。单独h-IgE和h-IgE相对于天然混合物被分别作为阳性和阴性对照。通过测定组氨酸释放入上清的抑制百分比来测定IgE适体活性，如图14显示(其中ARC445是序列号101，ARC656是序列号157，ARC714是非结合阴性对照)。
ARC445(序列号101)(实施例2E描述)和DNA适体，ARC656(序列号157)(实施例2D描述)中几个修饰衍生物也被用来测验其抑制上述SX38细胞组氨酸释放的能力，测量得到ARC445衍生物的IC50概括在表25中。
表25ARC445修饰衍生物；ARC656SX38细胞中组氨酸释放抑制

实施例4PK研究
实施例4中，所有基于质量的浓度数据只是指适体寡聚核苷酸部分的分子质量，与PEG连接体的质量无关。
实施例4A抗IgE适体血浆稳定性
检测适体医药化学过程中鉴定的一组适体在人和鼠血浆中核酸酶稳定性。在下述变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上来测定血浆核酸酶降解。简单的说，使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来纯化化学合成的适体，5′末端标记γ-32P ATP，然后凝胶纯化，以测定血浆稳定性。微量的32-P标记适体在中含有100nM未标记适体95％人血浆(或95％鼠血浆)200微升连接反应中培育。时间零点的反应单独分出来，用的是成分相同的PBS而不是血浆。这保证了实验中凝胶上的量或放射能一致。除非另有特别说明，反应液在37℃热循环仪中培育1，3，10，30和100个小时。在每个时间点上，除去20微升的反应液，与200微升甲酰胺上载染料一起在液氮中速冻并保存于-20℃。最后一点取完之后，取出冻结的样品并从每个时间点上除去20微升。加入SDS到小量样品中直到终浓度是0.1％。样品然后在90℃培育10-15分钟，并直接载入15％变性聚丙烯酰胺凝胶上在12W跑电泳35分钟。使用Storm 860 phosphoroimager系统(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)来定量凝胶上的放射能。量化0小时时间点全长适体条带并用甬道数目整除，从而确定每点上全长适体的百分比。每个时间点上的全长适体百分数然后规范化到0小时时间点全长适体百分比。适体全长百分数与每个时间上功能的关系符合公式ml*e^(-m2*m0)其中ml是适体全长最大％(ml＝100)；m2是降解率。
适体半衰期(T1/2)与(ln2)/m2相等。
图15a和15b显示了样品数据，检验是的结果总结在表26中。与我们预期的一致，适体在人血浆中比在鼠血浆中稳定，糖磷酸盐骨架中增加稳定化处理的修饰的数目与增加血浆稳定性有关。
表26ARC445和ARC656衍生物血浆稳定性

实施例4B鼠IV给药10mg/kg后抗IgE适体相对于PEG化产物ARC1785，ARC1787，ARC1788，和ARC1790的药代动力学
图16显示了对鼠科静脉给药ARC1785，ARC1787，ARC1788和ARC1790药代动力学研究。简单的说，本研究由三组组成(总计33个动物)。在每个样品采集时间点上，处死三个动物，通过心脏的小孔采集到0.5mL全血收集血浆。用标准0.9％盐将冻干的粉末适体配制成终浓度是10mg/mL(寡核苷酸浓度)的注射试剂，并在给药前灭菌过滤。给药方案是单静脉药丸注射，剂量是10mg/kg。在指定的时间点上，t＝给药前，0.08，0.5，1，2，4，8，16，24，32，48，和72小时获得全血样品并直接转移到K2EDTA吸附的试管中，反向混合并放置在冰上。
将血-EDTA试管3500rpm离心5分钟收集血浆。在分析之前血浆样品转移到新标记的1.5mL试管并储存于-80°C。使用相同的方法分析血浆适体浓度，直接将能整除的血浆加入到含有直接购买的荧光核酸检测试剂OligreenTM(Molecular Probes，Eugene，OR)的试验孔中。室温下简单培育(5分)，避光，使用荧光平板阅读器阅读检测板。每个孔的荧光信号与孔中适体浓度成正比，通过在荧光浓度标准曲线上添写荧光值来计算样品浓度(平均值来自双重曲线)。每组三个动物在每个时间点获取平均血浆浓度与时间后剂量绘成图17。
血浆浓度和时间数据要使用工业标准药代动力学模型软件WmNonLmTMv.4.0(Pharsight Corp.，Mountam View，CA)进行非划分分析(NCA)。可以估计出下面主要药代动力学参数最大血浆浓度，Cmax；浓度-时间曲线下面积AUC；终末半衰期，t1/2；终末清楚率，Cl；稳定状态分布体积，Vss。使用WmNonLmTMv.4.0(Pharsight Corp.，Mountam View，CA)。分析(NCA)非划分分析数据，获得了下图20列出的主要药代动力学参数的估计值。
实施例4C鼠SC给药(10mg/kg)后抗-IgE适体相对于PEG化产物ARC1785，ARC1787，ARC1788和ARC1790的药代动力学和生物利用度
图18显示了通过静脉注射途径给药研究鼠类药代动力学中的ARC1785，ARC1787，ARC1788，和ARC1790的生物利用度的设计。简单的说，本研究由三组组成(33个动物)。在每个样品采集时间点上，处死三个动物，通过心脏小孔采集0.5mL的全血以收集血浆。使用标准0.9％盐将干粉末适体配制成终浓度是10mg/mL(寡核苷酸浓度)的注射液，并在注射前消毒(0.2μm)。给药路线是一个简单的皮下注射药物，剂量是10mg/kg。在指定的时间点上，t＝给药前，0.08，0.5，1，2，4，8，16，24，32，48，和72小时，获得全血样品并直接转移到K2EDTA吸附的试管中，倒转混合放置在冰上。
将血-EDTA试管3500rpm离心5分钟收集血浆。在分析之前血浆样品转移到新标记的1.5mL试管并储存于-80°C。使用同样的方法来分析不同血浆样品中的适体浓度，直接将血浆加入到含有购买的荧光核酸检测试剂OligreenTM(MolecularProbes，Eugene，OR)的孔中。室温下培育(5mm)，避光，检测板使用荧光平板阅读器阅读。每个孔的荧光信号与孔中适体浓度成正比，通过使用添写荧光浓度标准曲线上的荧光值来计算样品浓度(平均值来自双重曲线)。在每组三个动物中每个时间点获取平均血浆浓度并时间后剂量绘成图19。
血浆浓度和时间数据要使用工业标准药代动力学模型软件WmNonLmTMv.4.0(Pharsight Corp.，Mountam View，CA)进行非划分分析(NCA)。可以估计出下面主要药代动力学参数最大血浆浓度，Cmax；浓度-时间曲线下面积AUC；终末半衰期，t1/2；终末清楚率，Cl；稳定状态分布体积，Vss。整体使用WmNonLmTMv.4.0(Pharsight Corp.，Mountam View，CA)。分析(NCA)数据生成了图20列出的主要药代动力学参数的估计，所有的PEG连接适体被检测的都显示了皮下生物利用度。
本发明已经被用书面描述和实施例的形式描述了，本领域普通技术人员能认识到本发明可以在多种实施方案中应用，并且上面的描述和实施例都是为了说明而并不是所附权利要求的限制。
序列表<110>阿切埃米克斯有限公司<120>免疫球蛋白E的特异性核酸配体及其作为过敏性疾病治疗的应用<130>23239-581-061<150>60/565,601<151>2004-04-26<150>60/574,120<151>2004-05-24<150>60/581,865<151>2004-06-22<150>60/660,204<151>2005-03-07<160>298<170>Patentln version 3.3<210>1<211>93<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成模板<220>
<221>其他特征<222>(25)..(54)<223>n是a，t，c，或g<400>1catcgatgct agtcgtaacg atccnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnncgagaa 60cgttctctcc tctccctata gtgagtcgta tta 93<210>2<211>92<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成模板<220>
<221>其他特征
<222>(24)..(53)<223>n代表a，t，c，或g<400>2catgcatcgc gactgactag ccgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac 60gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta 92<210>3<211>92<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成模板<220>
<221>其他特征<222>(24)..(53)<223>n代表a，t，c，或g<400>3catcgatcga tcgatcgaca gcgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac 60gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta 92<210>4<211>10<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成的免疫刺激基序<400>4aacgttcgag 10<210>5<211>88<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成模板<220>
<221>其他特征<222>(25)..(64)<223>n代表a，t，c，或g<400>5
gggaaaagcg aatcatacac aagannnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60nnnngctccg ccagagacca accgagaa 88<210>6<211>41<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成引物<400>6taatacgact cactataggg aaaagcgaat catacacaag a 41<210>7<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成引物<400>7ttctcggttg gtctctggcg gagc 24<210>8<211>88<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成模板<220>
<221>其他特征<222>(25)..(64)<223>n是a c，u，或g<400>8gggaaaagcg aaucauacac aagannnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60nnnngcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>9<211>24<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成的固定区域
<400>9gggaaaagcg aaucauacac aaga 24<210>10<211>24<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成的固定区域<400>10gcuccgccag agaccaaccg agaa 24<210>11<211>88<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-OH，所有的嘧′-羟啶(C和U)是2′-氟<400>11gggaaaagcg aaucauacac aagacgucgc cagauugagu gucgugguuc ggguugaggc 60ggaagcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>12<211>87<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(87)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟<400>12ggaaaagcga aucauacaca agagucgcga uagauugcuu gugaaugguu uugguggaag 60
cgggcuccgc cagagaccaa ccgagaa 87<210>13<211>88<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟<400>13gggaaaagcg aaucauacac aagagucgcu agauugcuag uguaugguuu aucuaaaggc 60ggccgcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>14<211>87<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(87)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟<400>14gggaaaagcg aaucauacac aagaggucuu acagauccug uguagugguu cgauacaugc 60ggggcuccgc cagagaccaa ccgagaa 87<210>15<211>88<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基
<222>(1)..(88)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟<400>15gggaaaagcg aaucauacac aagacgugag cauaucauug aguguagugg uuccggagua 60agucgcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>16<211>87<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(87)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟<400>16gggaaaagcg aaucauacac aagagcaccu ugacugugau ucgcgggugu gagucgugcg 60aaggcuccgc cagagaccaa ccgagaa 87<210>17<211>88<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟<400>17gggaaaagcg aaucauacac aagagugcaa gaagugcauu gcugugucug guucuuggcg 60augugcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>18<211>88<212>RNA<213>人工合成的
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟<400>18gggaaaagcg aaucauacac aagauccgag ggugggcaau aggcucacaa ggguuucgcg 60ugaugcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>19<211>88<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟<400>19gggaaaagcg aaucauacac aagagugccg aggcauugcu ugguaugguu ccggucuugu 60cggggcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>20<211>88<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(88)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟<400>20gggaaaagcg aaucauacac aagacgucgc cagauugagu guggugguuc ggguugaggc 60
ggaagcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>21<211>90<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(90)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟<400>21gggaaaagcg aaucauacac aagacgucag uaagauugag uguaugguuc cugguggaca 60auaauggcuc cgccagagac caaccgagaa90<210>22<211>88<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)-(88)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟<400>22gggaaaagcg aaucauacac aagagagugg aggagguaug uaugguuugu gcgucuggug 60cggugcuccg ccagagacca accgagaa 88<210>23<211>75<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成模板<220>
<221>其他特征
<222>(23)..(52)<223>n代表a，t，c，或g<400>23gggagaggag agaacgttct acnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nncgctgtcg 60atcgatcgat cgatg 75<210>24<211>22<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成引物<400>24gggagaggag agaacgttct ac 22<210>25<211>22<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成引物<400>25catcgatcga tcgatcgaca gc22<210>26<211>22<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成的固定区域<400>26gggagaggag agaacguucu ac22<210>27<211>23<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成的固定区域<400>27cgcugucgau cgaucgaucg aug 23
<210>28<211>75<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>28gggagaggag agaacguucu acgauuagca gggagggaga gugcgaagag gacgcugucg 60aucgaucgau cgaug75<210>29<211>75<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>29gggagaggag agaacguucu acacucuggg gacccguggg ggagugcagc aacgcugucg 60aucgaucgau cgaug75<210>30<211>74<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(74)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基
<400>3 0gggagaggag agaacguucu acgaggugag ggucuacaau ggagggaugg ucgcugucga 60ucgaucgauc gaug 74<210>31<211>75<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是a，c，u，或g<220>
<221>其他特征<222>(48)..(48)<223>n是a，c，u，或g<400>31gggagaggag agaacguucu acccgcagca uagccugngg acccaugngg ggcgcugucg 60aucgaucgau cgaug75<210>32<211>75<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)-(75)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>32gggagaggag agaacguucu acuggggggc guguucauua gcagcgucgu gucgcugucg 60
aucgaucgau cgaug75<210>33<211>75<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>33gggagaggag agaacguucu acgcagcgca ucuggggacc caagagggga uucgcugucg 60aucgaucgau cgaug75<210>34<211>73<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<220>修饰碱基<222>(1)..(73)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>34gggagaggag agaacguucu acgggauggg uaguuggaug gaaaugggaa cgcugucgau 60cgaucgaucg aug 73<210>35<211>74<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)-(74)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>35gggagaggag agaacguucu acgaggugua gggauagagg gguguaggua acgcugucga 60ucgaucgauc gaug 74<210>36<211>75<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>36gggagaggag agaacguucu acaggagugg agcuacagag aggguuaggg gucgcugucg 60aucgaucgau cgaug75<210>37<211>75<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>37gggagaggag agaacguucu acggauguug ggagugauag aaggaagggg agcgcugucg 60aucgaucgau cgaug75<210>38<211>76<212>DNA
<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(76)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>38gggagaggag agaacguucu acuuggggug gaaggaguaa gggaggugcu gaucgcuguc 60gaucgaucga ucgaug 76<210>39<211>75<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>3 9gggagaggag agaacguucu acguauuagg ggggaagggg aggaauagau cacgcugucg 60aucgaucgau cgaug75<210>40<211>76<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(76)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>40gggagaggag agaacguucu acagggagag aguguugagu gaagaggagg agucgcuguc 60
gaucgaucga ucgaug 76<210>41<211>75<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>41gggagaggag agaacguucu acauugugcu ccuggggccc aguggggagc cacgcugucg 60aucgaucgau cgaug75<210>42<211>75<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>42gggagaggag agaacguucu acgagcagcc cuggggcccg gagggggaug gucgcugucg 60aucgaucgau cgaug75<210>43<211>75<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)-(75)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>43gggagaggag agaacguucu acaggcaguu cuggggaccc augggggaag ugcgcugucg 60aucgaucgau cgaug75<210>44<211>75<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>44gggagaggag agaacguucu accaacggca uccugggccc cacaggggau gucgcugucg 60aucgaucgau cgaug75<210>45<211>74<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(74)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>45gggagaggag agaacguucu acgaguggau agggaagaag gggaguaguc acgcugucga 60ucgaucgauc gaug 74<210>46<211>75<212>DNA
<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>46gggagaggag agaacguucu acccgcagca uagccugggg acccaugggg ggcgcugucg 60aucgaucgau cgaug75<210>47<211>76<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(76)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(61)-(61)<223>n是a，c，u，或g<400>47gggagaggag agaacguucu acggucgcgu gugggggacg gauggguauu ggucgcuguc 60naucgaucga ucgaug 76<210>48<211>75<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)
<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>48gggagaggag agaacguucu acgggguuac gucgcacgau acaugcauuc aucgcugucg 60aucgaucgau cgaug75<210>49<211>75<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>49gggagaggag agaacguucu acuagcgagg agggguuuuc uauuuuugcg aucgcugucg 60aucgaucgau cgaug75<210>50<211>75<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(75)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>50gggagaggag agaacguucu acaagcaguu cuggggaccc augggggaag ugcgcugucg 60aucgaucgau cgaug75<210>51<211>75<212>DNA<213>人工合成的
<220>
<223>合成模板<220>
<221>其他特征<222>(23)..(52)<223>n代表a，t，c，或g<400>51gggagaggag agaacgttct acnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nncgctgtcg 60atcgatcgat cgatg75<210>52<211>22<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成引物<400>52gggagaggag agaacgttct ac 22<210>53<211>22<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成引物<400>53catcgatcga tcgatcgaca gc 22<210>54<211>21<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成的固定区域<400>54gggagaggag agaacguucu a21<210>55<211>23<212>RNA<213>人工合成的
<220>
<223>合成的固定区域<400>55cgcugucgau cgaucgaucg aug 23<210>56<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-OH，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>56gggagaggag agaacguucu acgaucuggg cgagccaguc ugacugagga agcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>57<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>57gggagaggag agaacguucu acgcggucgg guguguggag gaaguaguuc gucgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>58<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>58gggagaggag agaacguucu acgacguuaa ugcagcggcu agggaugggc agcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>59<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>59gggagaggag agaacguucu acaggcgugu ugguagggua cgacgaggca ugcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>60<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>60gggagaggag agaacguucu acugagggau aauacgggug ggauugucuu cccgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82
<210>61<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>61gggagaggag agaacguucu acgaaaaaga uaugagagaa aggauuaaga gacgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>62<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>62gggagaggag agaacguucu acgaagaaga uaugagagaa aggauuaaga gacgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>63<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基
<400>63gggagaggag agaacguucu acgaaaaaga uaugagagaa aggauuaaga gacgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg 82<210>64<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>64gggagaggag agaacguucu acgaaaaaga uaugagagaa aggauuaaga ggcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>65<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>65gggagaggag agaacguucu acgaaaaaga caugagagaa aggauuaaga gacgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>66<211>83<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(83)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(23)..(23)<223>n是a，c，u，或g<220>
<221>其他特征<222>(50)..(50)<223>n是a，c，u，或g<400>66gggagaggag agaacguucu acnaaaaagu auaugagaga aaggauuaan agacgcuguc 60gaucgaucga ucgaugaagg gcg 83<210>67<211>83<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(83)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>67gggagaggag agaacguucu acgaaaaaga uaugagagaa aaggauugag agaugcuguc 60gaucgaucga ucgaugaagg gcg 83<210>68<211>83<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基
<222>(1)-(83)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2 ′-氧-甲基<400>68gggagaggag agcacguucu acgaaaaaga uauggagaga aaggauuaag agacgcuguc 60gaucgaucga ucgaugaagg gcg 83<210>69<211>84<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(84)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>69gggagaggag agaacguucu acgaaaaaga uaugagagaa aggauuaaaa gagacgcugu 60cgaucgaucg aucgaugaag ggcg 84<210>70<211>85<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(85)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(26)..(26)<223>n是a，c，u，或g<400>70gggagaggag agaacguucu acgaanaaga uacauaguag aaaggauuaa uaagacgcug 60ucgaucgauc gaucgaugaa gggcg 85
<210>71<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>71gggagaggag agaacguucu acaggcgugu ugguagggua cgacgaggca ugcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>72<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>72gggagaggag agaacguucu acgcaaaaau gugaugcgag guaauggaac gccgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>73<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222> (1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>73gggagaggag agaacguucu acggaccuca gcgauagggg uugaaaccga cacgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>74<211>82
<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>74gggagaggag agaacguucu acauggucgg augcugggga guaggcaagg uucgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>75<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>75gggagaggag agaacguucu acguaucggc gagcgaagca uccgggagcg uucgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>76<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>76gggagaggag agaacguucu acguauuggc gcgcgaagca uccgggagcg uucgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>77<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>77gggagaggag agaacguucu acuuauaccu gacggccgga ggcgcauagg ugcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>78<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)-(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>78gggagaggag agaacguucu acauggucgg augcugggga guaggcaagg uucgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82
<210>79<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>79gggagaggag agaacguucu acacgagagu acugaggcgc uugguacaga gucgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>80<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>80gggagaggag agaacguucu acagaaggua gaaaaaggau agcugugaga agcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>81<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基
<400>81gggagaggag agaacguucu acugagggau aauacgggug ggauugucuu cccgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>82<211>84<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(84)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>82gggagaggag agaacguucu acauugagcg uugaaguugg ggaagcuccg aggccgcugu 60cgaucgaucg aucgaugaag ggcg 84<210>83<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>83gggagaggag agaacguucu acgcggagau auacagcgag guaauggaac gccgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>84<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>84gggagaggag agaacguucu acgaagacag cccaauagcg gcacggaacu ugcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>85<211>84<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(84)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>85gggagaggag agaacguucu accgguugag ggcucgcgug gaagggccaa cacgcgcugu 60cgaucgaucg aucgaugaag ggcg 84<210>86<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>86gggagaggag agaacguucu acauaucaau agacucuuga cguuuggguu ugcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82
<210>87<211>79<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(79)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>87gggagaggag agaacguucu acagugaagg aaaaguaagu gaaggugugc gcugucgauc 60gaucgaucga ugaagggcg79<210>88<211>82<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(82)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>88gggagaggag agaacguucu acggaugaaa ugagugucug cgauagguua agcgcugucg 60aucgaucgau cgaugaaggg cg82<210>89<211>83<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(83)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基
<400>89gggagaggag agaacguucu acggaaggaa augugugucu gcgauagguu aagcgcuguc 60gaucgaucga ucgaugaagg gcg 83<210>90<211>49<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(49)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟<400>90gggaaaagcg aaucauacac aagacgucgc cagauugagu gucgugguu 49<210>91<211>43<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(43)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟<400>91ggaaucauac acaagacguc gccagauuga gugucguggu ucc 43<210>92<211>41<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(41)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟<400>92ggaaucauac acaagacguc gccagauuga gugucguggu u 41<210>93<211>37<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟<400>93ggagauccga gggugggcaa uaggcucaca aggguuu37<210>94<211>35<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟<400>94ggauccgagg gugggcaaua ggcucacaag ggucc 35<210>95<211>43<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(43)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟<400>95ggaaucauac acaagacguc aguaagauug aguguauggu ucc43<210>96<211>41<212>RNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(41)<223>所有的嘌呤(A和G)是2′-羟基，所有的嘧啶(C和U)是2′-氟<400>96ggaaucauac acaagacguc aguaagauug aguguauggu u 41<210>97<211>21<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(21)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>97uucuggggac ccauggggga a 21<210>98<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>98guucugggga cccauggggg aac 23<210>99<211>25<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(25)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>99aguucugggg acccaugggg gaacu 25<210>100<211>21<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(21)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>100gccuggggac ccaugggggg c 21<210>101<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>101agccugggga cccauggggg gcu 23<210>102<211>25<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(25)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>102uagccugggg acccaugggg ggcua 25<210>103<211>21<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(21)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>103gccuggggaa ccaugggggg c 21<210>104<211>68<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成模板<400>104gggagaggag agaacgttct acagcctggg gacccatggg gggctggtcg atcgatcgat 60catcgatg68<210>105<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成引物<400>105catcgatgat cgatcgatcg acc 23<210>106<211>22<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(22)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>106agccugggga cccauggggg cu22<210>107<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>107cgccugggga cccagggggg gcu 23
<210>108<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>108agccuggugg cccauggggu gcu23<210>109<211>25<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(25)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>109agccugggga cccauggggg guggu 25<210>110<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>110
agucugggga cagauggaug gcu 23<210>111<211>22<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)-(22)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>111agcuguggag ucgugugggg cu 22<210>112<211>25<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(25)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>112aagccugggg acccaugggg gggcu25<210>113<211>37<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>113ggggcacgtt tatccgtccc tcctagtggc gtgcccc 37<210>114<211>74<212>DNA
<213>人工合成的<220>
<223>合成模板<400>114gatcccttgt tcagtccggg gcacgtttat ccgtccctcc tagtggcgtg ccccttaagc 60cacaggactc caaa 74<210>115<211>18<212>DN<213>人工合成的<220>
<223>合成引物<400>115gatcccttgt tcagtccg 18<210>116<211>17<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成引物<220>
<221>修饰碱基<222>(17)-(17)<223>第17位的腺嘌呤是2′-羟基<400>116ggagtcctgt ggcttaa 17<210>117<211>20<212>DN<213>人工合成的<220>
<223>合成引物<220>
<221>其他特征<222>(1)..(3)<223>1到3位的n是5-生物素-胸腺嘧啶<400>117
nnnggagtcc tgtggcttaa 20<210>118<211>17<212>DNA<213>合成引物<400>118ggagtcctgt ggcttaa 17<210>119<211>37<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>119ggggcacatt tatccgtccc tcctagtggt gtgcccc37<210>120<211>37<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>120ggggtacctt tatccgtccc tcctagtggg gtgcccc37<210>121<211>37<212>DN<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>121ggggtacctt tatccgtccc tcctagtggg gtacccc37<210>122<211>37<212>DN<213>人工合成的<220>
<223>合成适体
<400>122ggggcaaatt tatccgtccc tcctagtggt ttgcccc37<210>123<211>37<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>123ggggcatatt tatccgtccc tcctagtggt atgcccc37<210>124<211>37<212>DN<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>124ggggcacatt tatccgttcc tcctagtggt gtgcccc37<210>125<211>37<212>DN<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>125ggggtacatt tatccgtccc tcctagtggc atgcccc37<210>126<211>37<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>126ggggcatgtt tatccgtccc tcctagtggc atgcccc37<210>127<211>36<212>DNA<213>人工合成的
<220>
<223>合成适体<400>127ggggcaactt tatccgttcc tcctagtggg ttgccc36<210>128<211>37<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>128ggggcacatt catccgtccc tcctagtggt gtgctcc 37<210>129<211>37<212>DN<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>129ggggtacctt gatccgtccc tcctagtggg gtgcccc 37<210>130<211>37<212>DN<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>130ggggcatgtt tatccgttcc tcctagtggc atgcccc 37<210>131<211>37<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>131ggggcagctt tatccgttcc tcctagtggg ctgcctc 37
<210>132<211>37<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>132ggggtacctt tatccgtttc tcctagtggg gtgcccc 37<210>133<211>37<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>133ggggtatgtt gatccgtccc tcctagtggc atgcccc 37<210>134<211>37<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>134ggggcatgtt catccgttcc tcctagtggc gtgcccc 37<210>135<211>37<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>135gggacacatt tatccgttac tcttagtggt gtgcccc 37<210>136<211>37<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体
<400>136ggggcacatt tatccgttac tcttagtggt gtgcccc 37<210>137<211>34<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>137ggggcacgtt tacagtccct ccttatcgcc tccc 34<210>138<211>34<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>138ggggcacgtt tacagtccct ccttatcgcc tccc 34<210>139<211>36<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>139gggcaacttt atccgttcct cttagtgggt tgcccc36<210>140<211>36<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>140gggctacttt atccgtccct cctagtgggt agcccc36<210>141<211>35<212>DNA<213>人工合成的
<220>
<223>合成适体<400>141ggcaccttta tccgtccctc ctagtggggt gcccc 35<210>142<211>37<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>142ggggcacctt tatccgtccc tcctagtggg gtgcccc 37<210>143<211>36<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>143gggcacattc atccgttcct cctagtggtg tgcccc 36<210>144<211>34<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>144ggcaccttta tccgttcctt ctagtggggt gccc 34<210>145<211>36<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>其他特征<222>(28)..(28)
<223>第28位的n是a，t，c，或g<400>145cggcaccttt atccgttact cttagtgngg tgcccc36<210>146<211>35<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>146ggcaccttga tccgttcctc ctagtggggt gcccc35<210>147<211>37<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>147gcgggcaaat tcatccgtcc ctcctagtgg tttgccc 37<210>148<211>34<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>148gggcacttta tccgttcctt ctagtgggtg tccc 34<210>149<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>149ggcggcagct ttatccgtac ctcccagtgg gctgctcc 38<210>150<211>37
<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>150ggggcagctt tatccgtacc tcccagtggg ctgcccc 37<210>151<211>37<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>151ggggctactt tatccgtccc tcctagtggg tagcccc 37<210>152<211>37<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>152ggggctactt tatccgtacc tcccagtggg tagcccc 37<210>153<211>37<212>DN<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>153ggggctactt gatccgtccc tcctagtggg tagcccc 37<210>154<211>37<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>154ggggctactt catccgtccc tcctagtggg tagcccc 37
<210>155<211>37<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>155ggggctactt tatccgttcc tcttagtggg tagcccc37<210>156<211>37<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<400>156ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagcccc37<210>157<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>第38位的n是是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>157ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>158<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)
<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1位的腺嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>第24位的n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(31-31连接)<400>158agccugggga cccauggggg gcun 24<210>159<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>第24位的n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>159agccugggga cccauggggg gcun 24<210>160<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第6位的鸟嘌呤是是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>第24位的n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)
<400>160agccugggga cccauggggg gcun 24<210>161<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第7位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>第24位的n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>161agccugggga cccauggggg gcun 24<210>162<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第8位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>第24位的n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>162agccugggga cccauggggg gcun 24<210>163<211>24<212>DNA<213>人工合成的
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第9位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>第24位的n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>163agccugggga cccauggggg gcun 24<210>164<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第10位的腺嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>第24位的n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>164agccugggga cccauggggg gcun 24<210>165<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)
<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>第24位的n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>165agccugggga cccauggggg gcun 24<210>166<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第16位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>第24位的n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>166agccugggga cccauggggg gcun 24<210>167<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第17位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>第24位的n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)
<400>167agccugggga cccauggggg gcun 24<210>168<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第18位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>第24位的n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>168agccugggga cccauggggg gcun24<210>169<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第19位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>第24位的n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>169agccugggga cccauggggg gcun 24<210>170<211>24<212>DNA<213>人工合成的
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第20位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>第24位的n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>170agccugggga cccauggggg gcun 24<210>171<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第21位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>第24位的n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>171agccugggga cccauggggg gcun 24<210>172<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)
<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1位的腺嘌呤是2′-氧-甲基，和第2，20，和21位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>第24位的n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>172agccugggga cccauggggg gcun 24<210>173<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第10和14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>第24位的n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>173agccugggga cccauggggg gcun 24<210>174<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，7和17位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征
<222>(24)..(24)<223>第24位的n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>174agccugggga cccauggggg gcun 24<210>175<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，7和17位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第10和14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>第24位的n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>175agccugggga cccauggggg gcun24<210>176<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)-(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，7和17位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10和14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>第24位的n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>176agccugggga cccauggggg gcun 24
<210>177<211>28<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(27)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第3，8和20位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第11和15位的腺嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(2)..(2)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(17)-(17)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(19)..(19)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(28)-(28)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>177angccugggg acccaungng gggngcun 28<210>178<211>30<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(29)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第3，8和21位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第12和16位的腺嘌呤2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(2)(2)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(11)-(11)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(18)..(18)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(20)..(20)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(23)..(23)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(26)-(26)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(30)..(30)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>178angccugggg nacccaungn ggnggngcun30<210>179<211>27<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基
<222>(1)-(28)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，7和18位是鸟嘌呤，第1，11和15位的腺嘌呤2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(9)..(9)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(20)..(20)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(23)..(23)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(27)-(27)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>179agccugggng acccaugggn ggngcun 27<210>180<211>28<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(27)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，7和19位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，11和15位的腺嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(9)..(9)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(17)-(17)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(21)-(21)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(28)..(28)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>180agccugggng acccaunggg nggngcun 28<210>181<211>29<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)-(28)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，7和20位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，11和15位的腺嘌呤2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(9)..(9)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(17)..(17)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(19)..(19)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(22)..(22)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(25)..(25)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接
<220>
<221>其他特征<222>(29)..(29)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>181agccugggng acccaungng gnggngcun29<210>182<211>32<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(31)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，8和21位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，13和17位的腺嘌呤2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(6)-(6)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(9)..(9)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(11)..(11)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(19)-(19)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(22)..(22)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(24)-(24)
<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(26)..(26)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(28)..(28)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(32)..(32)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>182agccunggng ngacccaung gngngngngc un32<210>183<211>35<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(34)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，9和23位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，14和18位的腺嘌呤2′-氧-甲基；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(6)..(6)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(8)..(8)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(10)..(10)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(12)..(12)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接
<220>
<221>其他特征<222>(20)-(20)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(22)..(22)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(26)..(26)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(28)..(28)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(30)..(30)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(32)-(32)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(35)..(35)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>183agccungngn gngacccaun gngngngngn gncun35<210>184<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基
<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的；所有的嘧啶(C和U)是2 ′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(2)..(2)<223>n是脱氧的7-脱氮鸟嘌呤<400>184anccugggga cccauggggg gcu 23<210>185<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(6)..(6)<223>n是脱氧的7-脱氮鸟嘌呤<400>185agccunggga cccauggggg gcu 23<210>186<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(7)..(7)<223>n是脱氧的7-脱氮鸟嘌呤
<400>186agccugngga cccauggggg gcu23<210>187<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(8)..(8)<223>n是脱氧的7-脱氮鸟嘌呤<400>187agccuggnga cccauggggg gcu 23<210>188<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>
所有的嘌呤(A和G)是脱氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(9)..(9)<223>n是脱氧的7-脱氮鸟嘌呤<400>188agccugggna cccauggggg gcu 23<210>189<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(16)..(16)<223>n是脱氧的7-脱氮鸟嘌呤<400>189agccugggga cccaungggg gcu 23<210>190<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基
<220>
<221>其他特征<222>(17)..(17)<223>n是脱氧的7-脱氮鸟嘌呤<400>190agccugggga cccaugnggg gcu 23<210>191<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(18)..(18)<223>n是脱氧的7-脱氮鸟嘌呤<400>191agccugggga cccauggngg gcu 23<210>192<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(2 3)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基
<220>
<221>其他特征<222>(19)..(19)<223>n是脱氧的7-脱氮鸟嘌呤<400>192agccugggga cccaugggng gcu23<210>193<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′氧-甲基-<220>
<221>其他特征<222>(20)..(20)<223>n是脱氧的7-脱氮鸟嘌呤<400>193agccugggga cccauggggn gcu 23<210>194<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(21)..(21)<223>n是脱氧的7-脱氮鸟嘌呤<400>194agccugggga cccauggggg ncu 23<210>195<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)
<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>195aggcugggga cccauggggg ccu 23<210>196<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第3位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基；所有的嘧啶2′-氧-甲基<400>196aggcugggga cccauggggg ccu 23<210>197<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>197agucugggga cccauggggg acu 23<210>198<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第21位的腺嘌呤2′-氧-甲基；所有的嘧啶2′-氧-甲基<400>198agucugggga cccauggggg acu 23
<210>199<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的；所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<400>199agacugggga cccauggggg ucu 23<210>200<211>23<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第3位的腺嘌呤2′-氧-甲基；所有的嘧啶2′-氧-甲基<400>200agacugggga cccauggggg ucu 23<210>201<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第7和17位的鸟嘌呤2′-氧-甲基，第1，10和14位的腺嘌呤2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(2)..(2)<223>第2位的n是脱氧的次黄嘌呤
<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>201anccugggga cccauggggg gcun 24<210>202<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，7和17位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(6)..(6)<223>n是一个脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>202agccunggga cccauggggg gcun 24<210>203<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基
<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2和17位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(7)..(7)<223>n是一个脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>203agccugngga cccauggggg gcun 24<210>204<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，和7位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(8)..(8)<223>n是一个脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>204
agccuggnga cccauggggg gcun 24<210>205<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第位的鸟嘌呤是2，7和17 2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(9)..(9)<223>n是一个脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>205agccugggna cccauggggg gcun24<210>206<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，7和17位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基
<222>(1)..(23)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(16)..(16)<223>n是一个脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>206agccugggga cccaungggg gcun 24<210>207<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，和7位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(17)..(17)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>207agccugggga cccaugnggg gcun 24<210>208<211>24<212>DNA<213>人工合成的
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，7和17位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(18)..(18)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶<400>208agccugggga cccauggngg gcun 24<210>209<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，7和17位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(19)..(19)<223>n是脱氧的次黄嘌呤
<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>209agccugggga cccaugggng gcun 24<210>210<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，7和17位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(20)-(20)<223>n是一个脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(24)-(24)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>210agccugggga cccauggggn gcun24<210>211<211>24<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基
<222>(1)..(23)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，7和17位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，10，14位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<221>修饰碱基<222>(1)..(23)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(21)..(21)<223>n是一个脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>211agccugggga cccauggggg ncun 24<210>212<211>29<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)-(28)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，7和20位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，11，15位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(28)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(9)..(9)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(17)..(17)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(19)-(19)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(22)..(22)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(25)-(25)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(29)-(29)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>212agccugggng acccaungng gngnngcun 29<210>213<211>29<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(28)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，7和20位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，11，15位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(28)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(9)..(9)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征
<222>(17)..(17)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(18)..(18)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(19)-(19)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(22)..(22)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(25)..(25)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(29)..(29)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>213agccugggng acccaunnng gngnngcun29<210>214<211>32<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(31)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，8和21位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，13，17位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(31)
<223>所有的嘧啶(C和U)是2T-O-methyl<220>
<221>其他特征<222>(6)..(6)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(9)..(9)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(11)-(11)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(19)..(19)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(22)..(22)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(26)..(26)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(27)..(27)<223>n是一个脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(28)..(28)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(32)..(32)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>214agccunggng ngacccaung gngngnnngc un32
<210>215<211>32<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(31)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，8和21位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，13，17位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(31)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(6)-(6)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(9)..(9)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(11)..(11)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(19)..(19)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(20)..(20)<223>n是一个脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(22)..(22)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接
<220>
<221>其他特征<222>(26)..(26)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(27)..(27)<223>n是一个脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(28)..(28)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(32)..(32)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>215agccunggng ngacccaunn gngngnnngc un32<210>216<211>29<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(28)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，7和20位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，11，15位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(28)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(9)..(9)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(17)..(17)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(18)..(18)<223>n是一个脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(19)..(19)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(21)..(21)<223>n是一个脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(22)..(22)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(25)..(25)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(29)..(29)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>216agccugggng acccaunnng nngnngcun 29<210>217<211>29<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(28)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第位的鸟嘌呤是2，7和20 2′-氧-甲基，第位的腺嘌呤是1，11，15 are2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基
<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(9)..(9)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(17)..(17)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(19)..(19)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(21)..(21)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(22)..(22)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(25)..(25)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(29)..(29)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>217agccugggng acccaungng nngnngcun29<210>218<211>32<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(31)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，8和21位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，13，17位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(31)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(6)..(6)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(9)..(9)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(11)..(11)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(19)..(19)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(22)-(22)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(23)..(23)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(26)..(26)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(27)..(27)<223>n是脱氧的次黄嘌呤
<220>
<221>其他特征<222>(28)..(28)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(32)..(32)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>218agccunggng ngacccaung gnnngnnngc un32<210>219<211>32<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(31)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，8和21位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第1，13，17位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)-(31)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(6)..(6)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>其他特征<221>
<222>(9)..(9)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(11)..(11)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(19)..(19)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接
<220>
<221>其他特征<222>(20)..(20)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(22)..(22)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(23)..(23)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(24)..( 24)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(26)..(26)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(27)..(27)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(28)..(28)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(32)..(32)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>219agccunggng ngacccaunn gnnngnnngc un 32<210>220<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)
<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第1位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)-(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>220ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>221<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第2位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3 ′-3′连接)<400>221ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>222<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第3位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)
<400>222ggggctactt tatccgttcc tcctagtgggtagccccn 38<210>223<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第4位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>223ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>224<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第5位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>224ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>225<211>38<212>DNA<213>人工合成的
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第6位的尿嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>225ggggcuactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn38<210>226<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>226ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>227<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)
<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第8位的胞嘧啶是2′氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>227ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>228<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第9位的尿嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>228ggggctacut tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>229<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第10位的尿嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>38<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)
<400>229ggggctactu tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>230<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第11位的尿嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>230ggggctactt uatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>231<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第12位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>231ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>232<211>38<212>DNA<213>人工合成的
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第13位的尿嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>232ggggctactt tauccgttcc tcctagtggg tagccccn38<210>233<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第14位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)-(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3，-3′连接)<400>233ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn38<210>234<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)
<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第15位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)-(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>234ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>235<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第16位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>235ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn38<210>236<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第17位的尿嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)
<400>236ggggctactt tatccgutcc tcctagtggg tagccccn38<210>237<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第18位的尿嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>237ggggctactt tatccgtucc tcctagtggg tagccccn38<210>238<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第19位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>238ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn38<210>239<211>38<212>DNA<213>人工合成的
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第20位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>239ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn38<210>240<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第21位的尿嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>240ggggctactt tatccgttcc ucctagtggg tagccccn38<210>241<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)
<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第22位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>241ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn38<210>242<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第23位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>242ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn38<210>243<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第24位的尿嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)
<400>243ggggctactt tatccgttcctccuagtggg tagccccn 38<210>244<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第25位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>244ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn38<210>245<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第26位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>245ggggctactt tatccgttcc tcctagtgggtagccccn38<210>246<211>38<212>DNA<213>人工合成的
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第27位的尿嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>246ggggctactt tatccgttcc tcctaguggg tagccccn 38<210>247<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第28位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特点<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>247ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>248<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)
<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第29位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>248ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn38<210>249<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第30位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>249ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn38<210>250<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(1，(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第31位的尿嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)
<400>250ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg uagccccn 38<210>251<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)-(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第32位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>251ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn38<210>252<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第33位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>252ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn38<210>253<211>38<212>DNA<213>人工合成的
<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第34位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>253ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>254<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>254ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>255<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)
<223>所有的嘌呤(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第36位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)-(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>255ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>256<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A和G)和所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第3 7位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>256ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>257<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4，30和33位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第7和32位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的
<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>257ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>258<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第5，8，34，35，36，和37位的胞嘧啶是2′-氧-甲基，和第6和31位的尿嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>258ggggcuactt tatccgttcc tcctagtggg uagccccn 38<210>259<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，和4位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第34，35，36，和37位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>259ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>260<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和33位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第5，34，35，36，和37位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>260ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn38<210>261<211>36<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)
<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，和32位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(35)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第4，33，34，和35位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(36)..(36)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>261gggctacttt atccgttcct cctagtgggt agcccn36<210>262<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和33位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第34，35，36，和37位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>262ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>263<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和33位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第5，8，34，35，36，和37位的胞嘧啶是2′-氧-甲基，和第6位的尿嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>263ggggcuactt tatccgttcc tcctagtggg tagccccn 38<210>264<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和33位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第20，34，35，36，和37位的胞嘧啶是2′-氧-甲基，和第11，17，和18位的尿嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>264ggggctactt uatccguucc tcctagtggg tagccccn 38
<210>265<211>38<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和33位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(37)<223>所有的嘧啶(C和，T)是脱氧的，除了第5，8，20，34，35，36，和37位的胞嘧啶是2′-氧-甲基，和第6，11，17，和18位的尿嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>265ggggcuactt uatccguucc tcctagtggg tagccccn 38<210>266<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基
<221>其他特征<222>(9)..(9)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>266ggggctacnt ttatccgttc ctcctagtgg gtagccccn 39<210>267<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(10)..(10)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>267ggggctactn ttatccgttc ctcctagtgg gtagccccn 39<210>268<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(11)..(11)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>268ggggctactt ntatccgttc ctcctagtgg gtagccccn 39<210>269<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(12)..(12)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接
<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>269ggggctactt tnatccgttc ctcctagtgg gtagccccn 39<210>270<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(13)..(13)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>270ggggctactt tantccgttc ctcctagtgg gtagccccn 39<210>271<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基
<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和31位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(14)-(14)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>271ggggctactt tatnccgttc ctcctagtgg gtagccccn 39<210>272<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(15)..(15)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)
<400>272ggggctactt tatcncgttc ctcctagtgg gtagccccn 39<210>273<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)-(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)-(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(16)-(16)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>273ggggctactt tatccngttc ctcctagtgg gtagccccn 39<210>274<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(17)..(17)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>274ggggctactt tatccgnttc ctcctagtgg gtagccccn39<210>275<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(18)..(18)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>275ggggctactt tatccgtntc ctcctagtgg gtagccccn 39
<210>276<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是 2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(19)..(19)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>276ggggctactt tatccgttnc ctcctagtgg gtagccccn 39<210>277<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)
<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(20)..(20)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>277ggggctactt tatccgttcn ctcctagtgg gtagccccn 39<210>278<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第位的鸟嘌呤是1，2，3，4和34 2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是72′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(21)..(21)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)-(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>278ggggctactt tatccgttcc ntcctagtgg gtagccccn39
<210>279<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(22)..(22)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶<400>279ggggctactt tatccgttcc tncctagtgg gtagccccn 39<210>280<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(23)..(23)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间连接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>280ggggctactt tatccgttcc tcnctagtgg gtagccccn 39<210>281<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第5，36，37和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>281ggggctactt tatccgttcc tccntagtgg gtagccccn 39<210>282<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)-(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(25)..(25)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>282ggggctactt tatccgttcc tcctnagtgg gtagccccn 39<210>283<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(26)-(26)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接
<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(31-31连接)<400>283ggggctactt tatccgttcc tcctangtgg gtagccccn39<210>284<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)-(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(27)..(27)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>284ggggctactt tatccgttcc tcctagntgg gtagccccn39<210>285<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基
<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(28)..(28)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>285ggggctactt tatccgttcc tcctagtngg gtagccccn39<210>286<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(29)..(29)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)
<400>286ggggctactt tatccgttcc tcctagtgng gtagccccn 39<210>287<211>3 9<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(30)..(30)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>287ggggctactt tatccgttcc tcctagtggn gtagccccn 39<210>288<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基
<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37，和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(31)..(31)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>288ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg ntagccccn39<210>289<211>39<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和34位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(38)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第35，36，37和38位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(32)..(32)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(39)..(39)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>289ggggctactt tatccgttcc tcctagtggg tnagccccn 39
<210>290<211>46<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(45)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和41位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)-(45)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第42，43，44和45位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(10)-(10)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(14)..(14)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(17)..(17)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(22)..(22)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(26)..(26)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(30)..(30)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(34)..(34)
<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(46)..(46)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>290ggggctactn ttantcncgt tncctncctn agtngggnta gccccn46<210>291<211>46<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(45)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和41位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(45)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第5，8，42，43，44，和45位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(10)..(10)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(14)..(14)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(17)..(17)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(22)..(22)
<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(26)..(26)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(30)..(30)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(34)..(34)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(38)..(38)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(46)..(46)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>291ggggcuactn ttantcncgt tncctncctn agtngggnta gccccn 46<210>292<211>45<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(44)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第1，2，3，4和40位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第7位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(44)<223>所有的嘧啶(C和T)是脱氧的，除了第5，8，23，41，42，43和44位的胞嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(10)..(10)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接
<220>
<221>其他特征<222>(14)..(14)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(17)..(17)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(25)..(25)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(29)..(29)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(33)..(33)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(37)..(37)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(45)-(45)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>292ggggcuactn tuantcncgu ucctncctna gtngggntag ccccn45<210>293<211>31<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>其他特征<222>
<223>n是一个分支为40kDa大小的PEG<220>
<221>其他特征<222>(2)..(2)<223>n代表一个氨基<220>
<221>修饰碱基<222>(3)..(30)<223>所有的嘌呤是脱氧的，除了第4，9，和22位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第3，13，和17位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(3)-(30)<223>所有的嘧啶2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(11)-(11)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(19)-(19)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(20)..(20)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(21)-(21)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(23)..(23)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(26)-(26)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(27)..(27)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(31)..(31)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>293nnagccuggg ngacccaunn ngnngnngcu n 31
<210>294<211>31<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>其他特征<222>(1)..(1)<223>n是一个分支为40kDa大小的PEG<220>
<221>其他特征<222>(2)..(2)<223>n代表一个氨基<220>
<221>修饰碱基<222>(3)..(30)<223>所有的嘌呤是脱氧的，除了第4，9，和22位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第3，13，和17位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(3)..(30)<223>所有的嘧啶2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(11)..(11)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(19)..(19)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(20)-(20)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(21)..(21)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(23)-(23)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(26)..(26)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(27)..(27)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(31)..(31)<223>n是一个反向脱氧的胸腺嘧啶(3′-3′连接)<400>294nnagccuggg ngacccaunn ngnngnngcu n 31<210>295<211>32<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>其他特征<222>(1)-(1)<223>n是20kDa的PEG<220>
<221>其他特征<222>(2)..(2)<223>n是一个氨基<220>
<221>修饰碱基<222>(3)..(30)<223>所有的嘌呤是脱氧的，除了第4，9，和22位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第3，13，和17位的腺嘌呤是2′-氧-甲基
<220>
<221>修饰碱基<222>(3)..(30)<223>所有的嘧啶2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(11)..(11)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(19)..(19)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(20)..(20)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(21)..(21)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(23)..(23)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(26)..(26)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(27)..(27)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(31)..(31)<223>n是一个氨基<220>
<221>其他特征<222>(32)..(32)<223>n是一个20kDa的PEG<400>295nnagccuggg ngacccaunn ngnngnngcu nn 32<210>296<211>32<212>DNA<213>人工合成的
<220>
<223>合成适体<220>
<221>其他特征<222>(1)(1)<223>n是一个30kDa的PEG<220>
<221>其他特征<222>(2)..(2)<223>n是一个氨基<220>
<221>修饰碱基<222>(3)..(30)<223>所有的嘌呤是脱氧的，除了第4，9，和22位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第3，13，和17位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(3)(30)<223>所有的嘧啶2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(11)..(11)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(19)..(19)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(20)..(20)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(21)..(21)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(23)..(23)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(26)..(26)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(27)..(27)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(31)..(31)<223>n是一个氨基<220>
<221>其他特征<222>(32)..(32)<223>n是的30kDa和PEG<400>296nnagccuggg ngacccaunn ngnngnngcu nn 32<210>297<211>30<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>其他特征<222>(1)..(1)<223>n是一个氨基<220>
<221>修饰碱基<222>(2)..(29)<223>所有的嘌呤是脱氧的，除了第3，8和21位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，第2，12，和16位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(2)..(29)<223>所有的嘧啶是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(10)..(10)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(18)-(18)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(19)..(19)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(20)..(20)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(22)..(22)
<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(23)..(23)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(25)..(25)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(26)..(26)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(30)..(30)<223>n是一个氨基<400>297nagccugggn gacccaunnn gnngnngcun 30<210>298<211>28<212>DNA<213>人工合成的<220>
<223>合成适体<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(28)<223>所有的嘌呤(A和G)是脱氧的，除了第2，7，和20位的鸟嘌呤是2′-氧-甲基，和第1，11和15位的腺嘌呤是2′-氧-甲基<220>
<221>修饰碱基<222>(1)..(28)<223>所有的嘧啶(C和U)是2′-氧-甲基<220>
<221>其他特征<222>(9)..(9)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(17)..(17)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(18)..(18)<223>n是一个脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征
<222>(19)..(19)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(21)..(21)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征<222>(22)..(22)<223>n是一个硫代硫酸盐核苷间联接<220>
<221>其他特征<222>(24)..(24)<223>n是脱氧的次黄嘌呤<220>
<221>其他特征
权利要求
1.与PEG基团连接的适体，包括下列序列mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU。
2.根据权利要求1所述的适体，其中PEG基团是从由60kDa，40kDa，30kDa和20kDa所组成的组中筛选出来的。
3.根据权利要求2所述的适体，其中PEG基团是分支的PEG。
4.根据权利要求3所述的适体，含有如下结构 其中， 表示一个接头适体＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(序列号216)其中mC，mG，mU和mA分别＝2’-OMe C，2′-OMeG，2′-OMe U和2’-OMe A，dG＝脱氧G，dI＝脱氧次黄嘌呤，s＝硫代磷酸骨架取代，和3T＝3′反向脱氧胸腺嘧啶。
5.根据权利要求4所述的适体，其中的接头是烷基接头。
6.根据权利要求5所述的适体，其中的烷基接头包括2至18个连续的CH2基团。
7.根据权利要求6所述的适体，其中的烷基接头包括2至12个连续的CH2基团。
8.根据权利要求7所述的适体，其中的烷基接头包括3至6个连续的CH2基团。
9.根据权利要求8中所述的适体，含有如下所述结构 适体＝mALmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(序列号216)其中mC，mG，mU和mA分别＝2’-OMe C，2’-OMe G，2’-OMe U和2’-OMe A，dG＝脱氧G，dI＝脱氧次黄嘌呤，s＝硫代磷酸骨架取代和3T＝3′反向脱氧胸腺嘧啶。
10.根据权利要求3所述的适体，含有下面提出的结构 其中， 表示一个接头适体＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(序列号216)其中mC，mG，mU和mA分别＝2′-OMe C，2′-OMe G，2’-OMe U和2′-OMe A，dG＝脱氧乌嘌呤，dI＝脱氧次黄嘌呤，s＝硫代磷酸骨架取代和3T＝3′反向胸腺嘧啶。
11.根据权利要求1O所述的适体，其中的接头是烷基接头。
12.根据权利要求11所述的适体，其中烷基接头包括2-18个连续的CH2基团。
13.根据权利要求12所述的适体，其中烷基接头包括2-12个连续的CH2基团。
14.根据权利要求13所述的适体，其中烷基接头包括3-6个连续的CH2基团。
15.根据权利要求14所述的适体，含有下面提出的结构 适体＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU-3T(序列号216)其中mC，mG，mU和mA分别＝2’-OMe C，2’-OMeG，2′-OMe U和2′-OMe A，dG＝脱氧G，dI＝脱氧次黄嘌呤，s＝硫代磷酸骨架取代，和3T＝3′反向胸腺嘧啶。
16.根据权利要求2所述的适体，含有下面提出的结构 其中， 表示一个接头适体＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(序列号298)其中mC，mG，mU和mA分别＝2′-OMe C，2′-OMeG，2’-OMe U和2’-OMe A，dG＝脱氧G，dI＝脱氧次黄嘌呤，s＝硫代磷酸骨架取代，和3T＝3′反向胸腺嘧啶。
17.根据权利要求16所述的适体，其中的接头是烷基接头。
18.根据权利要求17所述的适体，其中的烷基接头包括2-18个连续的CH2基团。
19.根据权利要求18所述的适体，其中的烷基接头包括2-12个连续的CH2基团。
20.根据权利要求19所述的适体，其中的烷基接头包括3-6个连续的CH2基团。
21.根据权利要求17所述的适体，含有下面提出的结构 适体＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(序列号298)其中mC，mG，mU和mA分别＝2’-OMe C，2’-OMeG，2′-OMe U和2’-OMe A，dG＝脱氧G，dI＝脱氧次黄嘌呤，s＝硫代磷酸骨架取代，和3T＝3′反向胸腺嘧啶。
22.根据权利要求2所述的适体有下面提出的结构 其中， 表示一个接头其中，适体＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(序列号298)其中mC，mG，mU和mA分别＝2′-OMe C，2′-OMeG，2′-OMe U和2’-OMe A，dG＝脱氧G，dI＝脱氧次黄嘌呤，s＝硫代磷酸骨架取代和3T＝3′反向胸腺嘧啶。
23.根据权利要求22所述的适体，其中的接头是烷基接头。
24.根据权利要求23所述的适体，其中的烷基接头包括2-18个连续的CH2基团。
25.根据权利要求24所述的适体，其中的烷基接头包括2-12个连续的CH2基团。
26.根据权利要求25所述的适体，其中的烷基接头包括3-6个连续的CH2基团。
27.根据权利要求26所述的适体，含有下面提出的结构 适体＝mAmGmCmCmUdGmGdG-s-dGmAmCmCmCmAmU-s-dI-s-mGdI-s-dGdI-s-dGmCmU(序列号298)其中mC，mG，mU和mA分别＝2’-OMe C，2’-OMeG，2’-OMe U和2’-OMe A，dG＝脱氧G，dI＝脱氧次黄嘌呤，s＝硫代磷酸骨架取代和3T＝3′反向胸腺嘧啶。
28.能特异结合IgE的适体，所述适体包括一种核酸序列，该序列与任何一个选自由序列号11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96，和98-102组成的组的序列有至少80％的同源性。
29.根据权利要求28所述的适体，其中的适体核酸序列与任意一个选自由序列号11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96，98-102所组成的组的序列有至少90％的同源性。
30.能特异结合IgE的适体，所述适体包括一核酸序列，该核酸序列与选自序列号11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50和56-89中的任一序列的独特序列区域有至少80％的同源性。
31.根据权利要求30所述的适体，其中的适体核酸序列至少与选自序列号11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50和56-89的任一序列的独特序列区域有至少90％的同源性。
32.能与IgE结合的适体，包括30个相邻的核苷，所述30个相邻核苷与选自序列号11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50和56-96中的任一序列中的30个相邻核苷序列相同。
33.根据权利要求32所述的适体，其中的适体包含有20个连续的核苷，所述连续的核苷序列与选自序列号11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96，98-102中任一适体酸序列的独特序列区域中的20相邻核苷序列相同。
34.根据权利要求33所述的适体，其中的适体包含有8个连续的核苷，所述连续的核苷序列与选自序列号11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96，98-102中任一序列中独特区域的8个相邻核苷序列相同，其中的适体特异结合IgE。
35.从由序列号11-15，18，19，21，29，33，41-44，46，50，56-96，98-102，119-124，126-136，139-157，158-176，178-190，194-201，206-243，247，249-259，261-267，269-290和292所组成的组中选出的适体。
36.依据权利要求35的适体，其中适体为单链核酸。
37.根据权利要求36所述的适体，其与一种高分子量非免疫原性化合物或亲脂性化合物连接。
38.根据权利要求37所述的适体，其中高分子量，非免疫原性化合物是一种聚烃基乙二醇。
39.根据权利要求38所述的适体，其中的聚烃基乙二醇是聚乙二醇。
40.根据权利要求35所述的适体，该适体包括化学修饰，选自在糖位点上的化学取代；在磷酸盐位点上的化学取代；在核酸碱基位点上的化学取代；反向核苷3′封端；反向核苷5′封端。
全文摘要
该发明公开了能够结合免疫球蛋白E(IgE)，用于治疗和诊断过敏性疾病或者其它与IgE有关的疾病或不适的适体。该发明进一步涉及能够结合IgE的适体的给药材料和方法。
文档编号C07H21/04GK101014609SQ200580021366
公开日2007年8月8日 申请日期2005年4月26日 优先权日2004年4月26日
发明者莎伦·克洛德, 约翰·L·戴纳, 萨拉·切斯沃思·克内, 马克斯·库尔兹, H·A·丹尼尔·莱加斯, 哈罗德·尼古拉斯·马莎, 波加·桑霍尼, 安东尼·多米尼克·克费, 波拉·伯梅斯特, 王春华 申请人:阿切埃米克斯有限公司