一种检测中华鳖出血病病毒的特异性扩增引物及其检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种检测中华鳖出血病病毒的特异性扩增引物及其检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]中华鳖因其特有的营养保健价值，成为我国淡水名优养殖品种，主要分布于浙江、广东、广西、湖南、湖北、江西等省份。其中浙江是中华鳖养殖大省，2014年产量达14万吨，产值达80亿元，是渔业增效、渔民增收的重要支柱产业。鳖病害威胁是养殖业可持续发展的重要瓶颈。常见细菌性病害大多可通过养殖密度控制、水质调控等良好的养殖管理模式来加以控制。但病毒性病害，尤其是高致病性病毒常导致爆发性死亡，给中华鳖养殖业带来巨大威胁。加之苗种的省际、国际流通日益频繁，给鳖病毒性病害的爆发带来了更多不确定因素。苗种产地检疫是水产动物病毒性病害的有效防控措施之一。但由于鳖病毒相关研究滞后，对种鳖或鳖苗开展检疫无从谈起。加之病害一旦发生，因病毒基础信息的缺失，无法确诊，易与细菌性病害混淆，导致滥用药，给食品安全和生态环境也带来极大隐患。加强对中华鳖病毒性病害的基础研究，有利于采取有效的防控措施，为渔业增效、渔民增收保驾护航，并减少食品安全与生态安全的隐患。
[0003]据2014年全国中华鳖病害监测报告，在红底板病、腐皮病、胃肠炎病、鳃腺炎病、溃疡综合症5种常见病害中，鳃腺炎死亡率最高，养殖户对该病也是谈之色变。但现有的病害监测手段仅根据临床表现来诊断，无相关的确诊技术。养殖户常提到的“鳃腺炎病”仅是从鳃腺红肿、吐血等症状来判断，实际上各病例病原及发病机理不尽相同，致死率也有很大差异。
[0004]中华鳖(Tr1nyx sinensis)在分类学上隶属爬行纲，主要分布于中国、日本及东南亚等国家和地区。相对于鱼病而言，有关鳖病害的基础研究较为薄弱，大部分报道只是疾病的诊断和治疗试验。我国对于中华鳖病毒病的研究较为零星，大都基于电镜观察结果。国内已先后报道过中华鳖虹彩病毒(Irido-like virus)、疱疹病毒(Herpes-likevirus)、呼肠孤样病毒(Reo-like virus)、弹状样病毒(Rhabdo-like virus)、30_39nm 球状病毒等。胡嗣基曾报道疱疹病毒可引起中华鳖体表明显溃疡，腹部有红色出血点或出血斑块(胡嗣基.用盐酸吗啉呱防治甲鱼疱疹病[J].水产科技情报，1995，22 (1):21-22.);叶普仁报道了鳖鳃腺炎病的病原体可能是病毒，其证据主要来自抗菌药物不能治疗的控制疾病，而病毒灵可很快治愈(叶普仁.鳖鳃腺炎病及治疗[J].淡水渔业，1996，26 (I):
42-43.)。陈在贤等从患“红脖子病”的鳖体内分离到一种虹彩病毒，直径120-160 nm左右(陈在贤，郑坚川，江育林.从患“红脖子病”甲鱼体分离到虹彩病毒[J].中国兽医学报1998，18(2):135-139.)，是目前唯一分类地位被确定、全基因组序列被解析的中华鳖病毒。在此基础上，虹彩病毒相关的免疫学研究、分子生物学鉴定方法等报道也相继出现。但有关虹彩病毒在养殖中未见单独弓I起爆发性死亡的报道。
[0005]目前中华鳖出血病只能临床观察诊断，存在主观性和不确定性，现在尚无引发中华鳖出血病病毒的核酸分子检测方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有引发中华鳖爆发性死亡的病毒性病原无法确诊的局限，提供一种检测中华鳖出血病病毒的特异性扩增引物，采用该特异性扩增引物检测中华鳖出血病病毒，检测结果特异，结果易判断，有利于中华鳖病毒病的确诊。
[0007]同时本发明还提供了包含上述引物的检测中华鳖出血病病毒的检测试剂盒，具有普通RT-PCR和荧光定量RT-PCR两种，两种试剂盒特异性强，灵敏度高，而且操作简便快捷，填补了目前尚无引发中华鳖出血病病毒的核酸分子检测方法的空白，适合中华鳖出血病病毒的确诊、筛查和预防。
[0008]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种检测中华鳖出血病病毒的特异性扩增引物，包括用于普通RT-PCR的特异性扩增引物和用于荧光定量RT-PCR的特异性扩增引物，所述用于普通RT-PCR的特异性扩增引物为引物对 TSHSV-Fl 和 TSHSV-Rl，TSHSV-Fl 的核苷酸序列为 SEQ ID No:1 所示，TSHSV-Rl的核苷酸序列为SEQ ID No:2所示；所述用于荧光定量RT-PCR的特异性扩增引物为引物对 TSHSV-F2 和 TSHSV-R2，TSHSV-F2 的核苷酸序列为 SEQ ID No:3 所示，TSHSV-R2 的核苷酸序列为SEQ ID No:4所示。
[0009]一种检测中华鳖出血病病毒的普通RT-PCR病毒核酸检测试剂盒，包括反转录反应液和PCR扩增反应液，20-50 μ L的PCR扩增反应液包括:10-15mmol/L的ρΗ8.0-8.5Tris-HCl，50_80mmol/L 氯化钾，10-50 mmol/L 氯化镁，l_2mmol/L dNTP，20-200nmol/L TSHSV-F1 引物，20_200nmol/L TSHSV-Rl 引物，1-3U DNA 聚合酶，1-4 μ L 反转录产物；TSHSV-Fl的核苷酸序列为SEQ ID Νο:1所示，TSHSV-Rl的核苷酸序列为SEQ IDNo: 2所示。
[0010]反转录产物为反转录反应液反应后得到。
[0011]作为优选，所述反转录反应液包括反应液A和反应液B，反转录反应液总体积10-20 μ L中反应液A的体积为5-10 μ L，余量为反应液B ;反应液A包括:0.2-0.4 ymol/L引物Olig (dT)15，l-3yg待检样品RNA作为模板；反应液B包括:30-50mmol/L的ρΗ8.0-8.5Tris-HCl，50-80mmol/L 氯化钾，10-50 mmol/L 氯化镁，2-1OmmoI/L 二硫苏糖醇，l-2mmol/L dNTP, 10-15vol% DMSO，5-15wt% PEG-6000,0.1-0.2 μ g/ μ L BSA，10-20URNase抑制剂，50-200U的MMLV反转录试剂(Takara，大连来源)。
[0012]待检样品RNA的提取方法为:取20_30mg病毒感染的中华鳖肺、脾、肾等组织匀浆，加入350-500 μ L裂解液匀浆，离心；取上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻璃纤维素膜结合；依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜；用(无核糖核酸酶水，洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA。
[0013]一种检测中华鳖出血病病毒的荧光定量RT-PCR病毒核酸检测试剂盒，包括反转录反应液和荧光定量P CR扩增反应液，2 O - 5 O μ L的荧光定量P CR扩增反应液包括:10-15mmol/L 的 ρΗ8.0-8.5Tris_HCl，50_80mmol/L 氯化钾，10-50 mmol/L 氯化镁，
l-2mmol/L dNTP，20_200nmol/L TSHSV-F2 引物，20_200nmol/L TSHSV-R2 引物，0.3_0.5 μ LSYBGreen荧光染料，1-5 μ L稀释后的反转录产物，1-3U热启动DNA聚合酶；TSHSV_F2的核苷酸序列为SEQ ID No:3所示，TSHSV-R2的核苷酸序列为SEQ ID No:4所示。
[0014]作为优选，所述反转录反应液包括反应液A和反应液B，反转录反应液总体积10-20 μ L中反应液A的体积为5-10 μ L，余量为反应液B ;反应液A包括:0.2-0.4 ymol/L引物Olig (dT) 15，1-3 μ g待检样品RNA作为模板；反应液B包括:30-50mmol/L的ρΗ8.0-8.5Tris-HCl，50-80mmol/L 氯化钾，10-50 mmol/L 氯化镁，2-1OmmoI/L 二硫苏糖醇，l-2mmol/L dNTP, 10-15vol% DMSO，5-15wt% PEG-6000,0.1-0.2 μ g/ μ L BSA, 10-20URNase抑制剂，50-200U的MMLV反转录试剂(Takara，大连来源)。
[0015]作为优选，稀释后的反转录产物为反转录产物稀释5-10倍所得