。
[0016]发明人在前期的研究中先后分析了 3个不同中华鳖养殖场、被养殖户称之为“鳃腺炎病”的爆发性死亡病样，其内脏各器官组织均出现严重出血症状，发病急，死亡率极高，同一养殖塘一旦发病，一周之内几乎全军覆没。经多次回感试验均可复制出典型临床症状，目前已证实该病原为一高致死性病毒，是中华鳖重大疫病病原。为方便后续研究，依据其症状，暂将该病毒命名为中华鳖出血症病毒(Sinensis Hemorrhagic SyndromeVirus, TSHSV)。
[0017]本发明针对上述新发现的引起中华鳖出血病的病毒TSHSV，专门设计了针对性的特异性引物，进一步的设计了检测试剂盒，检测结果特异，结果易判断，有利于中华鳖病毒病的确诊，填补了目前尚无引发中华鳖出血病病毒的核酸分子检测方法的空白，适合中华鳖出血病病毒的确诊、筛查和预防。
[0018]本发明的有益效果是:
1、试剂盒特异性强，灵敏度高，而且操作简便快捷，填补了目前尚无引发中华鳖出血病病毒的核酸分子检测方法的空白，适合中华鳖出血病病毒的确诊、筛查和预防。
[0019]2、避免了临床诊断的主观性和不确定性。
[0020]3、本发明首次发现的引起中华鳖重大疫病的新病毒的部分特异性核酸序列为今后的新病毒研究和检测提供了重要基础。
【附图说明】
[0021 ] 图1是普通RT-PCR检测TSHSV病毒核酸特异性序列的凝胶电泳结果图。
[0022]图中:M.DNA Marker DL2000 ； 1.正常鳖组织匀浆滤液；2.病鳖组织匀浆滤液图2是荧光定量RT-PCR检测TSHSV病毒核酸特异性序列的凝胶电泳结果图。
[0023]图中:M.DNA Marker DL2000 ； 1.病鳖组织匀浆滤液
图3是荧光定量RT-PCR检测TSHSV病毒核酸特异性序列的扩增曲线(显示引物的扩增效率)。
[0024]图4是荧光定量RT-PCR检测TSHSV病毒核酸特异性序列的扩增产物的溶解曲线(显示引物的特异性一单峰)。
[0025]图5是利用引物TSHSV-Fl和TSHSV-F2制备长度为308bp的地高辛标记的核酸探针。
[0026]图中:Μ.DNA marker DL2000; 1.未标记的对照 PCR 产物；2.DIG-label 的 PCR产物。
[0027]图6是利用地高辛标记的核酸探针进行斑点杂交检测组织中病毒特异性核酸序列。
[0028]图7是荧光定量RT-PCR检测病毒在不同组织中的分布。
【具体实施方式】
[0029]下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
[0030]本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0031 ] 本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件例如Sambrook等分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Habor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
[0032]操作1:TSHSV部分核酸序列的获取
步骤一:病毒RNA提取
将病鳖(病鳖症状为具有腮腺红肿、糜烂，肝、肠、肺、肾等组织明显出血的症状)，病鳖来自湖州当地养殖场)的肝、脾、肺、肾、肠组织取出，冰上匀浆。匀浆液12000g离心20min，取上清，0.22 μπι细菌过滤器过滤，滤液40000g离心3h，TEN缓冲液(50 mmol Tris_HCL、50mmol NaCK5 mmol Na2EDTA、pH7.4)重悬沉淀，作为含病毒的粗提液。用RNaseA (Takara大连)和DNaseI (Takara大连)处理病毒粗提液以去除样本中大部分宿主自身的核酸(背景核酸)。取 356 μ L 的病毒粗提液，加入 40 μ L 的 DNaseI Buffer，2 μ L DNaseI，2 μ L RNaseA(TaKaRa大连)，短暂离心混匀后，置于37 °C作用3 h，之后在75°C水浴10 min，灭活核酸酶。取上述核酸酶消化液 200 μ L，用 QIAamp MinElute Virus Spin Kit ( QIAGEN 德国)试剂盒提取病毒RNA。
[0033]步骤二:随机引物扩增
随机引物扩增使用的反转录引物为FR26V-N 5 ’ -GCCGGAGCTCTGCAGATATCNNNNNN-3 ’，随机 PCR 扩增单引物为 FR20RV 5’-GCCGGAGCTCTGCAGATATC-3’ ( FR26V_N、FR20RV 引物参见Huang YH, Huang XH, Liu H, et al.Complete sequence determinat1n of a novelreptile iridovirus isolated from soft-shelled turtle and evolut1nary analysisof Iridoviridae[J], BMC Genomics.2009,10:224-238.)。扩增前首先进行 PCR 模板的制备。将步骤一提取的病毒RNA作为RNA样品进彳丁后续实验。
[0034]RNA 样品利用 Invitrogen 公司的反转录试剂盒(SuperScript III ReveseTranscriptase)进行反转录，反转录引物为FR26 RV-N。反转录体系为:5X First -Strand Buffer 4 μ L,DTT (100 mM)2 μ L,dNTP (10 mM)I μ L,Super Script III ReverseTranscriptase 0.5 μ L，RRI 0.5 μ L，RNA 模板 3 μ g，FR26 RV-N 引物(I 0 μ Μ) 2 μ L，加水补足反应总体系达20 μ L。反转录结束后，将产物94°C变性3 min，迅速置于冰上冷却2 min，加入 0.5yL 3，-5 ’ exo-Klenow DNA Polymerase (NEB，美国)合成 cDNA 第二链，反应条件为37°C延伸I h，75°C条件下灭活10 min。产物(双链cDNA)作为后续扩增模板。
[0035]上述合成的双链cDNA应用FR20 RV单引物进行随机PC R扩增，反应体系为:10XE xTaq Buffer 5yL，2.5 mM MgCl2 5 μ L，2.5 mM dNTP 4 μ L，10 μ M FR20RV 引物 4yL，ExTaq 0.5 μ L，模板5 μ L，水26.5 μ L，反应总体系50 μ L。PCR反应程序为94 °C预变性2min，之后进入94 °C Imin, 65 °C 100 s，72°C 2min循环扩增，循环数40次，最后72°C延伸1min0取5 μ L PCR产物经琼脂糖电泳检测后，其PCR扩增产物用PCR产物纯化试剂盒纯化。
[0036]步骤三:PCR产物克隆、筛选及测序
步骤二PCR扩增产物经纯化后，用限制性内切酶EcoR V (Takara大连)将引物切除。酶切反应体系为25 μ L，其中纯化的PC R产物20 μ L，EcoR V 2.5 μ L，Buffer 2.5 yL。反应条件为37°C，作用时间3 h。回收500 -1500 b p目的片段，连接至pS頂PLE 18 EcoRV/BAP Vector (Takara)，16°C条件下连接过夜。连接产物转化大肠杆菌T0P10感受态细胞(天根，北京)。经PCR鉴定，筛选500bp以上片段大小不等的阳性克隆送苏州金维智生物技术有限公司进行测序。
[0037]步骤四:病毒部分核酸序列的确定
测序结果应用Blastn和Blastx工具在NCBI数据库中进行核苷酸序列和框架阅读翻译的氨基酸序列比对。在序列比对结果基础上，得到一段453nt与GenBank中猪繁殖与呼吸综合综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)的