一种利用超顺磁性纳米微球提取多核苷酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其是一种利用超顺磁性纳米微球提取多核苷酸的方法。
【背景技术】
[0002]多核苷酸(如聚肌苷酸、聚胞苷酸等)具有诱导机体干扰素生成，增强免疫活性等作用，目前多核苷酸作为抗病毒药物临床应用于治疗病毒性角膜炎、单纯疱疹、乙肝等多种病毒引起的疾病。由于多核苷酸的分子量对其活性及毒性有一定影响，在医药领域应用中，对多核苷酸分子量集中度的要求不断趋向严格。现有的多核苷酸提取方法，一般以反应液经过超滤除去小分子的无机盐、核苷酸等杂质，如果纯度要求高的还要再经过柱层析进一步除去内毒素、蛋白质等杂质，获得精制的多核苷酸。这种方法存在两方面不足:首先工艺过程比较复杂，超滤及柱层析效率不高，收率偏低，在大批量的生产应用有一定的限制；另一方面，多核苷酸是聚合物，传统的酶法合成多核苷酸后其分子量分布较广，由于多核苷酸的分子量对其活性及毒性有一定影响，目前在医药领域应用中，对多核苷酸分子量集中度的要求越来越高，传统提取方法无法控制多核苷酸的分子量，不能满足市场上对产品分子量质量项目的要求。
【发明内容】
[0003]针对现有技术的不足，本发明提供了一种简单有效的多核苷酸提取方法，利用超顺磁性纳米微球提取多核苷酸。
[0004]为了解决上述问题，本发明采用的技术方案如下:
[0005]一种利用超顺磁性纳米微球提取多核苷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0006](I)吸附:向多核苷酸合成反应液中加无机盐，混合均与，调pH值，在搅拌条件下，依次序加入磁性纳米微球和有机溶剂，继续搅拌10_20min ;
[0007](2)沉降:在外部磁场作用下，沉降10_20min，磁性纳米微球会在磁场作用下迅速沉降，收集沉降的磁性纳米微球；
[0008](3)洗涤:向步骤⑵收集到的磁性纳米微球中加入有机溶剂，搅拌1min后，在外部磁场作用下，沉降10_20min，收集沉降的磁性纳米微球；
[0009](4)重复步骤(3)操作I次；
[0010](5)洗脱:向步骤⑷得到的磁性纳米微球中加入pH值为5-8的纯化水，搅拌5-10min后，在外部磁场作用下，沉降10_20min，收集洗脱液，即为提取纯化后的多核苷酸溶液。
[0011]优选的，按多核苷酸干重计，步骤(I)中多核苷酸合成反应液浓度为1-5%。
[0012]优选的，所述的磁性纳米微球为表面修饰硅烷醇基团的超顺磁性纳米微球，如海狸生物科技、洛阳惠尔，无锡百运纳米科技等公司生产。
[0013]优选的，步骤(I)中无机盐为氯化钠。
[0014]优选的，步骤(I)中加入无机盐至无机盐浓度为0.2-0.4mol/L。
[0015]优选的，步骤(I)中pH值调至5-6。
[0016]优选的，步骤(I)中有机溶剂为甲醇、乙醇或异丙醇，浓度为100% ;步骤(3)中有机溶剂为体积分数为70-80 %的乙醇。
[0017]优选的，步骤(I)中加入的磁性纳米微球与多核苷酸干重的质量比为(1-2):(1-5)ο
[0018]优选的，步骤(I)中有机溶剂与多核苷酸合成反应液的体积比为(1-2): 1，步骤
(3)中加入的有机溶剂与步骤(I)中的多核酸的合成反应液的体积比为(2-4):1。
[0019]优选的，搅拌速度为60-100RMP。
[0020]本专利的有益效果:
[0021]本发明利用磁性微球对多核苷酸的特异性吸附作用及其在不同条件下(如pH、无机盐浓度，有机溶剂等)对不同分子量的多核苷酸的吸附能力的差异，设计了适当的吸附、洗脱条件，通过简单的工序获得了比传统工艺分子量集中度更佳的精制多核苷酸产品。本发明简化了多核苷酸提取工序，一步到位的工艺实现了传统工艺至少要两步以上步骤才能达到的效果，同时，解决了多核苷酸分子量控制难这一质量瓶颈问题。
【附图说明】
[0022]图1为实施例1-6提取的多核苷酸的电泳图；
[0023]图2为实施例1、3提取的多核苷酸与现有技术提取的多核苷酸电泳图；
【具体实施方式】
[0024]实施例1
[0025]一种利用超顺磁性纳米微球提取多核苷酸的方法，包括以下步骤:
[0026](I)吸附:取IL浓度为I %的多核苷酸合成反应液放入玻璃容器中，加入11.76g氯化钠，混合均勾，调节pH至5.0，搅拌下加入1g表面修饰娃烧醇基团的超顺磁性纳米微球，再加入IL乙醇，继续搅拌10分钟；多核苷酸吸附在磁性纳米微球后，把玻璃容器放置在带磁性的底座上使纳米微球沉降10分钟，上清溶液澄清后倾倒弃去上清液，收集沉降的磁性纳米微球；
[0027](2)洗涤:往步骤(2)收集的磁性纳米微球中加入70%乙醇2L，多核苷酸会继续吸附在磁性纳米微球上，搅拌10分钟充分洗涤纳米微球，利用磁性底座使磁性纳米微球沉降20分钟，倾倒弃去上清液，然后重复洗涤纳米微球一遍；
[0028](3)洗脱:加入0.5L pH值为5.0的纯化水搅拌洗脱5分钟，多核苷酸会从磁性纳米微球中解吸溶解在纯化水中，利用磁性底座使磁性纳米微球沉降10分钟，分离洗脱液与纳米微球，收集洗脱液即为提取纯化后的多核苷酸溶液。
[0029]实施例2
[0030]一种利用超顺磁性纳米微球提取多核苷酸的方法，包括以下步骤:
[0031](I)吸附:取IL浓度为3%的多核苷酸合成反应液放入玻璃容器中，加入17.64g氯化钠，混合均勾，调节pH至5.5，搅拌下加入15g表面修饰娃烧醇基团的超顺磁性纳米微球，再加入1.5L乙醇，继续搅拌15分钟；多核苷酸吸附在磁性纳米微球后，把玻璃容器放置在带磁性的底座上使纳米微球沉降15分钟，磁性纳米微球会在磁场作用下迅速沉降，上清溶液澄清后倾倒弃去上清液，收集沉降的磁性纳米微球；
[0032](2)洗涤:往步骤(I)中收集的磁性纳米微球中加入75%乙醇3L，多核苷酸会继续吸附在磁性纳米微球上，搅拌10分钟充分洗涤纳米微球，利用磁性底座使磁性纳米微球沉降15分钟，倾倒弃去上清液，然后重复洗涤纳米微球一遍；
[0033](3)洗脱:加入0.7L pH值为7的纯化水，搅拌洗脱7分钟，多核苷酸会从磁性纳米微球中解吸溶解在纯化水中，利用磁性底座使磁性纳米微球沉降12分钟，分离洗脱液与纳米微球，收集洗脱液即为提取纯化后的多核苷酸溶液。
[0034]实施例3
[0035]一种利用超顺磁性纳米微球提取多核苷酸的方法，包括以下步骤:
[0036](I)吸附:取IL浓度为5%的多核苷酸合成反应液放入玻璃容器中，加入23.52g氯化钠，混合均勾，调节pH至6.0，搅拌下加入20g表面修饰娃烧醇基团的超顺磁性纳米微球，再加入2L乙醇，继续搅拌20分钟；多核苷酸吸附在磁性纳米微球后，把玻璃容器放置在带磁性的底座上20分钟，磁性纳米微球会在磁场作用下迅速沉降，上清溶液澄清后倾倒弃去上清液，收集沉降的磁性纳米微球；
[0037](2)洗涤:往上述收集的磁性纳米微球中加入80%乙醇4L，多核苷酸会继续吸附在磁性纳米微球上，搅拌10分钟充分洗涤纳米微球，利用磁性底座使磁性纳米微球沉降20分钟，倾倒弃去上清液，然后重复洗涤纳米微球一遍；
[0038](3)洗脱:加入IL pH值为8的纯化水，搅拌洗脱10分钟，多核苷酸会从磁性