一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，包括：温和还原法制备PEI包覆的超顺磁氧化铁纳米颗粒(USPIO-PEI)；USPIO-PEI纳米颗粒表面修饰叶酸复合物(COOH-PEG-FA)和异硫氰酸荧光素(FI)；以及纳米颗粒表面的乙酰化修饰。本发明工艺简单，反应条件温和，易于操作；制备的超顺磁氧化铁纳米颗粒粒径较小、弛豫率超高，并且具有良好的胶体稳定性、生物相容性和特定的肿瘤靶向性，在体内肿瘤靶向成像诊断领域具有潜在的应用价值。
【专利说明】一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于核磁共振造影剂的制备领域，特别涉及一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法。
【背景技术】
[0002]核磁共振成像技术日趋成熟，扫描时间明显缩短，分辨率逐渐提高，检测的准确度也越来越高，使得核磁共振成像技术在疾病检测领域发挥越来越重要的作用。为了提高MRI成像诊断的灵敏度和特异性，选择合适的MRI造影剂尤为重要。超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒近年来在生物医学领域有着越来越广泛的应用，特别是用作核磁共振成像(MRI)的造影剂。这主要是由于其具有独特的磁学性质以及信号强、使用剂量低和生物相容性好等特点，因而使其成为核磁共振成像造影剂的很好的选择。不足的是，超顺磁性Fe3O4纳米颗粒作为常规的MRI造影剂之一，往往弛豫率较低，不能满足对疫病灵敏检测的目的。本课题组在前期的工作中，通过简易的水热合成法制备了两种不同性质和尺寸规格的四氧化三铁纳米颗粒，并探索了其在MR成像诊断中应用的可行性(沈明武，蔡红东，史向阳。一种APTS修饰的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法。中国发明专利，专利号:ZL201110104443.1 ；Cai etal.，ACS App1.Mater.1nterfaces2013, 5 (5), 1722 - 1731 ;史向阳，蔡红东，沈明武。一种HPEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法。中国发明专利，申请号:201210277624.9)。尽管合成得到的四氧化三铁纳米颗粒具有相对高的弛豫率，探索合适的方法来合成具有更高弛豫率的四氧化三铁纳米颗粒仍然值得人们深入探索。
[0003]通过对不同合成方法的尝试，我们惊奇地发现温和还原法制备的超顺磁氧化铁纳米颗粒(USPIO)尺寸较小，并且表现出很高的弛豫率。但是这些还原法制备的裸露USPIO同样面临一些普遍的问题，即由于磁性颗粒本身具有的磁学特性导致USPIO很容易出现聚集现象，从而限制了其在生物医学成像领域的应用。为了解决这一难题，我们尝试采用类似“一步”简易水热合成法的方案在还原法制备纳米颗粒的过程中，在反应溶液中加入聚乙烯亚胺(PEI)，从而通过简易“一步”还原法制备了 PEI包覆的USPIO(USPIO-PEI)。表征数据表明，制备的USP10-PEI不仅具有良好的水溶性和胶体稳定性，而且同时表现出T1和T2加权的成像效果，R2的弛豫率高达ATOmr1S4左右，如此高的弛豫率在目前的研究文章中实属罕见。为了使制备的该种USP10-PEI能有效地应用到生物体内特定肿瘤部位的成像检测，我们进一步在其表面修饰聚乙二醇-叶酸复合物(Polyethylene glycol-Folicacid, PEG-FA)，有效地提高了 USPIO纳米颗粒的水溶性、稳定性、生物相容性和靶向性，再在其表面接上异硫氰酸荧光素(FI)用于纳米颗粒的示踪和荧光成像。以高叶酸受体表达的HeLa细胞(一种人宫颈瘤癌细胞)为模型细胞和肿瘤模型对制备的多功能纳米探针的性质进行评价。本研究制备的USPIO纳米颗粒具备的良好特性，特别是超闻的R2她豫率，有望实现不同疾病系统的准确和灵敏诊断。
[0004]检索国内外文献，尚没有发现关于用还原法制备具有超高弛豫率的USPIO纳米颗粒及其用于体内肿瘤模型靶向MRI研究的相关报道。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作，成本较低。制备的USPIO磁性纳米颗粒能够长时间稳定分散于水溶液中，不会出现团聚现象。所用的修饰剂PEI为廉价和环境友好材料，具有产业化实施的前景。
[0006]本发明的一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，包括:
[0007](I)将三价铁盐溶解于超纯水中，搅拌，鼓吹氮气，然后加入亚硫酸钠溶液后，搅拌反应20-30min，再加入超支化聚乙烯亚胺PEI水溶液和NH3.Η20，60-70°C条件下，搅拌反应20-30min，然后室温条件下反应0.5-1.5h，分离洗涤，得到PEI包裹的超顺磁氧化铁纳米颗粒USP10-PEI ;然后将USP10-PEI洗涤，分散于溶剂中；其中三价铁盐、超纯水、NH3.H2O的配比为1.2~1.4g:20~25mL:2~3mL，三价铁盐、亚硫酸钠、超支化聚乙烯亚胺PEI质量比为 1.2 ~1.4:0.21 ~0.25:0.51 ~0.53 ;
[0008](2)将叶酸FA溶解于溶剂中，用EDC和NHS活化2_4h，滴加到氨基-聚乙二醇-羧基NH2-PEg-COOH溶液中，搅拌反应2-4天，透析，然后真空冷冻干燥，即得C00H-PEG-FA ;其中 FA 和 NH2-PEg-COOH 的摩尔比为 1.8-2:1 ;
[0009](3)将上述C00H-PEG-FA、EDC和NHS溶解于溶剂中，搅拌活化2_4h，得到活化后的C00H- PEG-FA，然后加入步骤(1)中，搅拌反应2_4d，分离洗涤，分散，得到USPIO-PE1-PEG-FA纳米颗粒；其中活化后的C00H-PEG-FA与USP10-PEI纳米颗粒表面氨基的摩尔比为1:23~25。
[0010](4)将异硫氰酸荧光素FI溶液加入步骤(3)中，搅拌反应0.5-ld，分离，洗涤，分散，得到USPIO-PE1-F1-PEG-FA纳米颗粒溶液；然后加入三乙胺，搅拌反应20_40min，再加入乙酸酐，搅拌反应20-30h，离心洗涤，分散，得到叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA ;其中 FI 与 USP10-PEI 表面氨基的摩尔比为 1:39-40。
[0011]所述步骤(1)中三价铁盐为FeCl3.6H20 ；NH3.H2O质量百分比浓度为25-28%。
[0012]所述步骤⑴中鼓吹氮气的时间为10_15min。
[0013]所述步骤(1)中超支化聚乙烯亚胺PEI的相对分子量为25000。
[0014]所述步骤(2)中FA、EDC和NHS的摩尔比为1: 0.8-1:0.8-1。
[0015]所述步骤(2)中NH2-PEg-COOH的相对分子量为2000。
[0016]所述步骤(3)中C00H-PEG-FA 与 EDC、NHS 的摩尔比为 1:8-10:8-10。
[0017]所述步骤(4)中三乙胺、乙酸酐与USPIO纳米颗粒表面的PEI上伯氨基摩尔比为8-10:10-12:1。
[0018]所述步骤(1)-(3)中溶剂均为二甲基亚砜DMSO ;分散为分散于二甲基亚砜DMSO中。
[0019]所述步骤(4)中FI溶液的溶剂为二甲基亚砜DMS0，分散为均分散于水中。
[0020]本发明先利用还原法合成PEI包裹的USPIO磁性纳米颗粒，然后将PEG-FA和FI先后修饰在纳米颗粒的表面，最后对纳米颗粒的剩余表面氨基进行乙酰化修饰。
[0021]本发明操作简便易行，原材料成本低。制备的纳米颗粒具有良好的水溶性、胶体稳定性和生物相容性。与叶酸阻断的对照组相比，叶酸修饰的USPIO纳米颗粒对肿瘤细胞或肿瘤部位具有更高的靶向性。该方法制备的叶酸靶向性USPIO纳米颗粒在MRI分子影像诊断领域有着潜在的应用。
[0022]本发明使用X-射线衍射(XRD)、傅氏转换红外光谱分析(FTIR)、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、热重分析(TGA)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)、Zeta电势及动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)等方法表征制备的磁性纳米颗粒，并通过磁共振成像仪测定纳米颗粒的T1和T2弛豫性能，然后利用MTT法评价纳米颗粒的细胞毒性，再利用流式细胞仪、共聚焦显微成像以及体外和体内核磁共振成像实验检测叶酸修饰的纳米材料对肿瘤细胞的靶向性和诊断效果。具体测试结果如下:
[0023](I) X-射线衍射(XRD)测试结果
[0024]通过对比和分析X-射线衍射图谱，还原法合成的裸的USPIO (如图1a)和USP10-PEI (如图1b)纳米颗粒与Fe3O4图谱(ICSD20-596) 一致，表明PEI修饰的USPIO晶体结构为四氧化三铁。由于PEI的修饰，使得USP10-PEI纳米颗粒的X-射线衍射图谱在22.5°左右出现的较宽的峰。
[0025](2)傅氏转换红外线光谱分析(FTIR)的测试结果
[0026]通过对比USPIO (图2a)、USPIO-PEI (图2b)的红外谱图，发现USP10-PEI在1630,2850,2930和3450CHT1处有较强的吸收峰，由此可知PEI成功包裹在USPIO上；比较USP10-PEI (图 2b)和 USPIO-PE1-PEG-FA (图 2c)，发现 USPIO-PE1-PEG-FA 在 1405CHT1 处有较强的吸收峰，结合FA(图2d)的红外谱图可知PEG-FA成功接到USP10-PEI上。
[0027](3)热重分析(TGA)测试结果
[0028]为了检测PEG-FA在USPIO纳米颗粒表面的上载量，我们对修饰前后的纳米颗粒进行了 TGA测试。由图3可以看出，USP10-PEI在温度升至700°C时，重量为原来的88.53%，经过计算，PEI上载率为11.47% (图3a);修饰后，USPIO-PE1-PEG-FA的失重分别是23.92%(图4b)，经过计算，C00H-PEG-FA上载率12.45%,由此表明PEG-FA已成功连接到USPIO纳米颗粒的表面。
[0029](4)紫外吸收(UV-Vis)测试结果
[0030]图 4 所示为 USPIO-PE1-PEG-FA(图 4a)和 USPIO-PE1-F1-PEG-FA(图 3b)在 200到800nm的紫外吸收图谱。从图中我们可以看出，USPIO-PE1-PEG-FA在400到600nm处没有明显的紫外吸收峰，而USPIO-PE1-F1-PEG-FA在505nm处有一个明显的紫外吸收峰，从而说明FI成功修饰到USPIO-PE1-PEG-FA纳米颗粒表面。
[0031](5)电势和水动力粒径测试结果
[0032]电势结果显示乙酰化后纳米颗粒的表面电势是+24.2mV，而其分散于水、PBS和细胞培养基中后的水动力粒径分别是310.1,315.6和217.3nm(表1)。
[0033](6)透射电子显微镜(TEM)测试结果
[0034]通过TEM观察本发明制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒的形态和尺寸(如图5所示)。TEM测试结果显示USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒的形貌均是球形或准球形。通过分别随机测量300个纳米颗粒的直径计算得到制备的USPIO-PE1-F1-PEG-FA纳米颗粒的直径是8.9 ±2.lnm。
[0035](7)弛豫率测量结果
[0036]USPIO纳米材料可以用作核磁共振成像的阴性造影剂，随着Fe浓度的增加，MRI信号强度逐渐减弱。弛豫率(^或!^)反映USPIO纳米粒子作为MRI造影剂的效率，为单位摩尔浓度铁的横向弛豫时间，可通过不同浓度下的弛豫时间化或^的倒数拟合计算得到。图6为本发明制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒的T1或T2弛豫时间倒数与Fe浓度的线性拟合图，可以看出这种USPIO纳米材料的弛豫时间倒数随着铁浓度的增加(在0.0025-0.04mM浓度范围内)具有很好的线性关系。并且通过计算可得本发明制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA 的 T1 弛豫率为 35.69ι?Μ?，r2 弛豫率高达 475.92ι?Μ?，rjr2比率为13.33。因此，本发明所制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA可作为MRI分子影像学诊断中的优良T2信号衰减造影剂。
[0037](8)MTT细胞活力测试结果
[0038]通过MTT比色法测定HeLa细胞的活力来检测本发明制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒的细胞相容性(如图7)。HeLa细胞与USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA 纳米颗粒(Fe 浓度为 0.2,0.4,0.6,0.8、1.0、1.5 和 2.0mM)在37°C下共培养24小时。然后，经MTT处理后在570nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的活力。不同浓度的材料对细胞增殖的影响以缓冲液PBS处理的细胞为对照进行比较。与PBS对照组相比，USPI O-PE1-Ac-F1-PEG-FA在Fe的实验浓度为O到1.5mM范围内对HeLa细胞的存活率的影响没有显著性差异，细胞存活率均在87%以上，即使Fe的实验浓度高达
2.0mM，仅有25.4%的细胞死亡。这充分说明USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA具有良好的细胞相容性，可以应用到生物体内MRI成像诊断。
[0039](9)流式细胞仪检测结果
[0040]通过流式细胞仪检测HeLa细胞对本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒在不同浓度下的吞噬量和处理后细胞的平均荧光强度(如图8)来检测叶酸靶向性效果。在本研究中，正常的HeLa细胞被定义为高FA受体的HeLa细胞，而被FA(2.0mM)阻断2小时的HeLa细胞被定义为低FA受体的HeLa细胞。两组不同的细胞与USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA (Fe 浓度为 0.05,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8 和 1.0mM)在 37°C下共培养4小时，然后通过流式细胞仪检测细胞的平均荧光强度。在图8中，在浓度0.05-0.6mM范围内，高FA受体的HeLa细胞的平均荧光强度明显高于低FA受体的HeLa细胞。而在浓度为0.8和1.0mM时，高FA受体的HeLa细胞的平均荧光强度也高于低FA受体的HeLa细胞，只是不明显，这可能是因为在高浓度时细胞吞噬起到了主导作用。这些结果说明叶酸的修饰赋予了纳米颗粒对HeLa细胞的特异靶向能力。
[0041](10)共聚焦显微镜检测结果
[0042]叶酸的靶向性同样通过共聚焦显微镜来验证，如图9所示，高FA受体的HeLa细胞和低FA受体的HeLa细胞分别与PBS、本发明制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒(Fe浓度为0.4mM)在37°C下共培养4小时，然后在油镜下观察细胞吞噬纳米颗粒后的荧光信号。在图9中，经过PBS处理的细胞内没有荧光；纳米材料处理后的低FA受体的HeLa细胞内显示出比较微弱的荧光信号；而处理后高FA受体的HeLa细胞内显示出很强的荧光信号，这进一步说明叶酸修饰的纳米颗粒对HeLa细胞有更好的祀向性,从而为该材料成功高效地应用到体内MRI成像提供了可靠的依据。
[0043](11)体外细胞MRI成像结果
[0044]在体内实验之前，我们评价了本发明制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒的细胞MRI成像效果(如图10所示)，高FA受体的HeLa细胞和低FA受体的HeLa细胞与 USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA 纳米颗粒(Fe 浓度为 0.1、0.2、0.3 和 0.4mM)在 37 °C 下共培养4小时，并且以PBS处理的细胞作为对照组。在图1Oa中，随着Fe浓度的增加，USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒处理后的细胞均表现出MRI信号衰减的趋势，说明随着Fe浓度的增加，细胞对纳米颗粒的吞噬量也增加。需要指出的是，在相同的Fe浓度下，USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒处理后的高FA受体的HeLa细胞比低FA受体的HeLa细胞的MRI信号降低更明显，说明高FA受体的HeLa细胞对USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒的吞噬量要大大高于低FA受体的HeLa细胞。图1Ob是细胞经过不同浓度的纳米颗粒处理后的MRI成像信号值，从图中明显看出，随着Fe浓度的增加，细胞的MRI信号值均逐渐减少，而且在相同的Fe浓度下，USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒处理后高FA受体的HeLa细胞的MRI信号值要明显低于低FA受体的HeLa细胞的MRI信号值。这些结果不仅说明制备的纳米颗粒具有很好的细胞MRI成像效果，而且证明了 USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒对HeLa细胞的特异靶向性。 [0045](12)体内肿瘤MRI成像结果
[0046]裸鼠I直接采用尾静脉注射本发明制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒PBS溶液，裸鼠2和3分别是通过尾静脉和瘤内注射叶酸PBS溶液(20mM，0.1mL) 30分钟后，再尾静脉注射本发明制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒PBS溶液，以此来评价肿瘤部位的MRI成像效果(如图11所示)。与注射前的对照组相比较，在注射后I小时内，裸鼠2和裸鼠3在尾静脉注射USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA (Fe的浓度为80mM，0.1mL)后肿瘤部位稍微变暗，而只注射USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA (Fe的浓度为80mM，0.1mL)的裸鼠I肿瘤明显变暗，展示出叶酸修饰的纳米颗粒具有明显的MRI肿瘤诊断效果。在注射后2小时，三个实验组的裸鼠肿瘤部位明暗程度都逐渐恢复，说明此时纳米材料随着血液循环已经从肿瘤部位逐渐代谢出去(图11a)。图1lb是相应注射时间的肿瘤MRI信号值变化，在注射后I小时，裸鼠2和裸鼠3的肿瘤MRI信号值变化不明显，裸鼠I的肿瘤MRI信号值明显降低，在注射后2小时，三个实验组的裸鼠肿瘤部位MRI信号值均有所增加，这与图1la的结果一致。这些结果说明本发明制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒具有很好的肿瘤靶向能力，能成功应用于体内靶向MRI肿瘤成像诊断的造影剂。
[0047]有益.效果
[0048](I)本发明采用简单的还原法制备水溶性良好的PEI包覆的USPIO纳米颗粒，然后在纳米颗粒表面先后连接C00H-PEG-FA和FI分子，最后对纳米颗粒的表面氨基进行乙酰化修饰得到用于MRI造影剂的USPIO纳米颗粒；此法操作工艺简单，反应条件温和，易于操作分离，所用均为廉价的和环境友好的材料，具有实施商业化的前景；
[0049](2)本发明制备的USPIO纳米颗粒能够长时间地稳定分散于水溶液中，没有出现团聚现象；PEI的包覆增加了 USPIO纳米颗粒的稳定性，C00H-PEG-FA的表面修饰不仅增加了 USPIO纳米颗粒的生物相容性和亲水性，而且赋予纳米颗粒对肿瘤细胞或者肿瘤部位的靶向特异性；这些优点使制备的叶酸靶向性USPIO纳米颗粒可以有效地用作体内MRI成像的阴性造影剂。
【专利附图】
【附图说明】[0050]图1是本发明制备的USPIO(a)和USPIO-PEI (b)纳米颗粒的X-射线衍射图；
[0051]图2 是 USPIO (a) ,USPIO-PEI (b),USPIO-PE1-PEG-FA (c)和 FA (d)的傅氏转换红外线光谱谱图；
[0052]图3是本发明制备的USPIO-PEI (a)、USPIO-PE1-PEG-FA (b)的热重分析图；
[0053]图4 是本发明制备的 USPIO-PE1-PEG-FA(a)和 USPIO-PE1-F1-PEG-FA(b)的紫外吸收图谱；图5是本发明制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA的透射电镜图片(a)和尺寸分布直方图(b);图6是本发明制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒的T1和T2弛豫时间倒数与Fe浓度的线性关系图；
[0054]图7是MTT法测试的HeLa细胞经过PBS缓冲液(对照)和本发明制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒(Fe的浓度范围在0.2-2.0mM)处理24小时后的细胞活力；
[0055]图8是高FA受体的HeLa细胞和低FA受体的HeLa细胞与本发明制备的Fe3O4-PE1-Ac-F1-PEG-FA 纳米颗粒的 PBS 溶液(Fe 的浓度为 0,0.05,0.1,0.2,0.4,0.6、
0.8、1.0mM)共培养4小时后的细胞的平均荧光强度；
[0056]图9是高FA受体的HeLa细胞经过PBS缓冲液(对照，a)、本发明制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒(b) (Fe浓度为0.4mM)和低FA受体的HeLa细胞经过本发明制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒(c) (Fe浓度为0.4mM)处理4小时后细胞的共聚焦显微成像图片；
[0057]图10是高FA受体的HeLa细胞和低FA受体的HeLa细胞与本发明制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒(Fe浓度范围在0.1-0.4mM)处理4小时后的细胞T2MRI成像图片(a)和相应的MRI信号值变化(b)；
[0058]图11是裸鼠1、2和3分别尾静脉注射本发明制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒PBS溶液(Fe:80mM,0.1mL)后不同时间点裸鼠肿瘤的T2MRI成像图片(a)和相应的MRI信号值变化(b);裸鼠I直接采用尾静脉注射本发明制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒PBS溶液，而裸鼠2和3分别通过尾静脉和瘤内注射叶酸PBS溶液(20mM，0.1mL) 30分钟后，再尾静脉注射本发明制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒PBS溶液。
【具体实施方式】
[0059]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0060]实施例1
[0061]将1.30g FeCl3.6H20溶解于20mL超纯水中，移入250mL三口瓶中搅拌；氮气鼓吹10~15分钟后，将0.2g亚硫酸钠溶于IOmL超纯水后加入到三口瓶中，持续搅拌反应30分钟；然后依次将0.5g超支化聚乙烯亚胺PEI的水溶液和2mL的NH3.H2O也加入到三口瓶中，60~70°C下恒温搅拌反应30分钟；接着在室温下反应1.5小时；反应结束后，将所得到的黑色沉淀USP10-PEI磁分离除去上清液，再加适量超纯水超声分散，再磁分离，如此重复超纯水洗涤三次，以除去杂质，然后重新分散于20mL超纯水中，即得PEI包覆的USPIO纳米颗粒(USPIO-PEI)。同时用相同的方法在缺少PEI的情况下制备裸露的USPIO作为对照。取3mL纳米颗粒溶液，真空冷冻干燥用于X-射线衍射检测。XRD结果显示了 USPIO和USP10-PEI纳米颗粒的晶体结构为四氧化三铁(见附图1)。通过对比USPIO(见附图2a)、USPIO-PEI (见附图 2b)的红外谱图，发现 USP10-PEI 在 1630,2850,2930 和 3450cm-1 处有较强的吸收峰，由此可知PEI成功包裹在USPIO上；取冻干的USPIO-PEI进行热重分析(见附图3)。TG测试结果表明，USPIO-PEI在温度升至700°C时，重量为原来的88.53%，(见附图3a)，经过计算，PEI上载率为11.47%，由此表明PEI已成功包裹在USPIO上。
[0062]实施例2
[0063]取38.46mg C00H-PEG_FA、31.6mg EDC 和 19.0mg NHS 分别溶于 2mL DMSO,并将溶液混合后搅拌活化3h。然后将活化的C00H-PEG-FA溶液(6mL)逐滴加入到IlOmg实施例I制备的USPIO-PEI的DMSO溶液中，搅拌反应三天，再用超纯水磁分离洗涤3次，产物USPIO-PE1-PEG-FA重新分散于IlmL DMSO中。并取ImL用水洗涤后重新分散于水中，冷冻干燥，用于红外光谱分析。通过比较USP10-PEI(见附图2b)和USPIO-PE1-PEG-FA (见附图2c)，发现USPIO-PE1-PEG-FA在1045cm-1处有较强的吸收峰，结合FA(见附图2d)的红外谱图可知PEG-FA成功接到USPIO-PEI上。另外，USPIO-PE1-PEG-FA纳米颗粒失重被测为
23.92% (见附图3b)，减去USPIO-PEI的失重量，可计算得C00H-PEG-FA上载率12.45%,由此表明C00H-PEG-FA已成功连接到USPIO纳米颗粒的表面，与上述结果一致。
[0064]实施例3
[0065]将2mL DMSO溶解的FI溶液加入到实例2中制备的USPIO-PE1-PEG-FA的DMSO溶液中，搅拌反应I~3天后，产物USPIO-PE1-F1-PEG-FA分离洗涤3次，磁分离除去上清液，再加适量超纯水超声分散，再磁分离，如此重复纯水洗涤3次，以除去杂质，然后重新分散于 IOmL 水中，即得到产物 USPIO-PE1-F1-PEG-FA。分别取 25 μ L USPIO-PE1-PEG-FA (实施例2) ,USPIO-PE1-F1-PEG-FA(实施例3)的水溶液于2mL离心管中，再向其中加700 μ L超纯水，超声均匀，测紫外吸收(见附图4)。紫外可见光谱测试结果表明，USPIO-PE1-PEG-FA在400到600nm处没有明显的紫外吸收峰，而USPIO-PE1-F1-PEG-FA在505nm处有一个明显的紫外吸收峰，从而说明FI成功修饰到USPIO-PE1-PEG-FA纳米颗粒表面。
[0066]实施例4
[0067]向实施例3制备的USPIO-PE1-F1-PEG-FA纳米颗粒水溶液(IOmL)中加入493 μ L三乙胺(密度为0.726~0.729g/mL，浓度为99.0% )，并搅拌30分钟。然后向上述溶液中逐滴加入402yL乙酸酐(密度为1.08g/mL，浓度为98.5 %)(三乙胺、乙酸酐与USPIO-PE1-F1-PEG-FA的表面氨基摩尔比=10:10:1)，继续搅拌反应24小时。产物用超纯水磁分离洗涤3次，并重新分散到5mL超纯水中，即制得乙酰化的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA纳米颗粒。取本发明制备的USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA(实施例4)用超纯水分别配制成
1.5mL的水溶液用于测表面电势和水动力直径(如表1)。电势结果显示乙酰化后纳米颗粒的表面电势是+24.2mV，而其分散于水、PBS和细胞培养基中后的水动力粒径分别是310.1、315.6 和 217.3nm (表 I)。
[0068]表1.USPIO-PE1-F1-PEG-FA纳米颗粒分散于水中的电势和在不同溶液中的水动力粒径。
[0069]
【权利要求】
1.一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，包括: (1)将三价铁盐溶解于超纯水中，搅拌，鼓吹氮气，然后加入亚硫酸钠溶液后，搅拌反应20-30min，再加入超支化聚乙烯亚胺PEI水溶液和NH3.H20,60-70°C条件下，搅拌反应20-30min，然后室温条件下反应0.5-1.5h，分离洗涤，得到PEI包裹的超顺磁氧化铁纳米颗粒USP10-PEI ;然后将USP10-PEI洗涤，分散于溶剂中；其中三价铁盐、超纯水、NH3.H2O的配比为1.2~1.4g:20~25mL:2~3mL，三价铁盐、亚硫酸钠、超支化聚乙烯亚胺PEI质量比为 1.2 ~1.4:0.21 ~0.25:0.51 ~0.53 ; (2)将叶酸FA溶解于溶剂中，用EDC和NHS活化2_4h，滴加到NH2-PEG-C00H溶液中，搅拌反应2-4天，透析，然后真空冷冻干燥，即得C00H-PEG-FA ;其中FA和NH2-PEG-C00H的摩尔比为1.8-2:1 ； (3)将上述C00H-PEG-FA、EDC和NHS溶解于溶剂中，搅拌活化2_4h，得到活化后的C00H-PEG-FA，然后加入步骤⑴中，搅拌反应2_4d，分离洗涤，分散，得到USPIO-PE1-PEG-FA纳米颗粒；其中活化后的C00H-PEG-FA与USP10-PEI纳米颗粒表面氨基的摩尔比为1:23~25 ; (4)将异硫氰酸荧光素FI溶液加入步骤(3)中，搅拌反应0.5-ld，分离，洗涤，分散，得到USPIO-PE1-F1-PEG-FA纳米颗粒溶液；然后加入三乙胺，搅拌反应20_40min，再加入乙酸酐，搅拌反应20-30h，离心洗涤，分散，得到叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒USPIO-PE1-Ac-F1-PEG-FA ;其中 FI 与 USP10-PEI 表面氨基的摩尔比为 1:39-40。
2.根据权利要求1所 述的一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于:所述步骤(1)中三价铁盐为FeCl3.6H20 ；NH3.H2O质量百分比浓度为25-28%。
3.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于:所述步骤(1)中鼓吹氮气的时间为10-15min。
4.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于:所述步骤(1)中超支化聚乙烯亚胺PEI的相对分子量为25000。
5.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于:所述步骤⑵中FA、EDC和NHS的摩尔比为1:0.8-1:0.8-1。
6.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中NH2-PEg-COOH的相对分子量为2000。
7.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中C00H-PEG-FA与EDC, NHS的摩尔比为1:8-10:8-10。
8.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于:所述步骤(4)中三乙胺、乙酸酐与USPIO纳米颗粒表面的PEI上伯氨基摩尔比为8-10:10-12:1。
9.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于:所述步骤(1)-(3)中溶剂均为二甲基亚砜DMSO ;分散为分散于二甲基亚砜DMSO中。
10.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于:所述步骤(4)中FI溶液的溶剂为二甲基亚砜DMS0，分散为均分散于水中。
【文档编号】A61K49/12GK103933584SQ201410182821
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】沈明武, 李静超, 胡勇, 孙文杰, 史向阳 申请人:东华大学