一种水溶性蛋白包覆的磁性纳米颗粒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种可用于生物医学成像领域的纳米颗粒及其制备方法，具体为一种水溶性蛋白包覆的磁性纳米颗粒及其制备方法。
【背景技术】
[0002]磁性纳米颗粒是近年来的研究热点，由于其拥有均一、优异的表面物理化学性质被广泛应用于各个行业。具有超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SP10)是未来癌症诊疗的不二选择，能够用于诊断实验、核磁共振造影剂、细胞分化、热疗以及药物载带等方面的研究。
[0003]在过去几十年中，自下而上的合成方法被广泛应用于磁性氧化铁颗粒的制备。如共沉淀、热分解、溶胶凝胶法、水热反应等。目前基于四氧化三铁的制备方法主要分为两类，一类是共沉淀法，主要是在一定温度下，将一定量的葡糖糖高聚物、铁盐和亚铁盐溶于水，搅拌下加入过量的氨水获得粒径约25?40纳米的颗粒。但是该方法获得的颗粒有尺寸较大，结晶度低、饱和磁化强度小，核磁共振医学成像效果差以及包裹剂厚度不均匀等缺点。另一类是在高温条件下，通过热分解制备的氧化铁纳米颗粒，尺寸相对较小且更均一，磁性能优越，但是其水溶性和生理环境下稳定性差等严重缺陷也阻碍了其在体内成像的应用。然而，具有较大比表面积的纳米颗粒容易聚集而导致磁性消失，表面活性降低，被快速从体内清除。鉴于前述的优点和缺点，制备具有高稳定、能够避免铁磁性聚集、在生理环境中空间结构稳定，同时具有易于化学修饰的表面基团的超顺磁性金属纳米颗粒(SP10)是目前纳米医学的重大挑战。
[0004]发展制备高质量磁性纳米材料的绿色工艺，大规模可控合成磁性高、制备尺寸均匀可控、单分散性好、结晶程度高、易于表面功能化的磁性纳米材料，并将其更好地应用于生物医学领域仍是今后研究的热点。
【发明内容】
[0005]本发明的一个主要目的在于克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种水溶性蛋白包覆的磁性纳米颗粒的制备方法，包括:将蛋白与磁性金属盐混合，所述磁性金属盐的金属离子通过复合于所述蛋白，制得蛋白-磁性金属的中间分散产物；向所述蛋白-磁性金属的中间分散产物中加入碱，反应后制得所述水溶性蛋白包覆的磁性纳米颗粒。
[0006]根据本发明的一实施方式，所述蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清白蛋白、转铁蛋白、胶原蛋白，以及磷脂蛋白中的一种或多种。
[0007]根据本发明的另一实施方式，所述蛋白的质量与所述磁性金属的摩尔比为(1?100g): (0.5 ?lOOOmmol)。
[0008]根据本发明的另一实施方式，所述磁性金属选盐自铁、钴、或镍的盐。
[0009]根据本发明的另一实施方式，所述磁性金属盐选自二价铁、三价铁的盐酸盐、硫酸盐、乙酸盐中的一种或多种。
[0010]根据本发明的另一实施方式，包括将所述蛋白的水溶液与所述磁性金属盐的水溶液于20?80°C混合10?60分钟，制得所述蛋白-磁性金属的中间分散产物。
[0011]根据本发明的另一实施方式，包括向所述蛋白-磁性金属的中间分散产物中加入所述碱，于20?90°C反应1?24小时，制得所述水溶性蛋白包覆的磁性纳米颗粒。
[0012]根据本发明的另一实施方式，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾或氨水。
[0013]根据本发明的另一实施方式，还包括将所述蛋白-磁性金属的中间产物与碱反应后的产物依次进行透析纯化处理、离心浓缩处理或者低温冻干处理，得到所述水溶性蛋白包覆的磁性纳米颗粒。
[0014]本发明进一步提供了一种水溶性蛋白包覆的磁性纳米颗粒，由上述任一项所述的方法制得。
[0015]本发明的水溶性蛋白包覆的磁性纳米颗粒的制备方法，所使用的原料廉价易得、天然无毒、环境友好、具有生物适用性；反应设备普通易得、制备方法简便、绿色环保、产物无需进一步纯化，适用于大规模的生产；得到的产物外包覆蛋白质、水溶性好、生物活性高、易于进一步修饰靶向分子、核磁共振医学信号优异、尺寸超小、易于进入组织细胞内部，适用于活体成像、癌症特异性靶向、以及体内信号实时追踪等生物医学应用。
【附图说明】
[0016]图1为制备例1的水溶性蛋白包覆的磁性纳米颗粒的透射电子显微镜测试图；
[0017]图2为制备例1的粒径分布图；
[0018]图3为制备例1的水溶性蛋白包覆的磁性纳米颗粒的X射线光电子能谱测试图；
[0019]图4为制备例1的水溶性蛋白包覆的磁性纳米颗粒的X射线衍射光谱谱图；
[0020]图5为制备例1的水溶性蛋白包覆的磁性纳米颗粒的磁性测试图；
[0021]图6为实施例1的水溶性蛋白包覆的磁性纳米颗粒的核磁共振成像测试图；
[0022]图7为制备例1的水溶性蛋白包覆的磁性纳米颗粒的铁离子浓度与1/T2的线性关系图；
[0023]图8A为现有的未使用应用例的样品的核磁共振医学信号活体成像图；
[0024]图8B为使用了应用例的样品的核磁共振医学信号活体成像图。
【具体实施方式】
[0025]体现本发明特征与优点的典型实施方式将在以下的说明中详细叙述。应理解的是本发明能够在不同的实施方式上具有各种的变化，其皆不脱离本发明的范围，且其中的说明及图示在本质上是当作说明之用，而非用以限制本发明。
[0026]本发明提供了一种水溶性蛋白包覆的磁性纳米颗粒的制备方法，包括:将蛋白与磁性金属盐混合，所述磁性金属盐的金属离子复合于所述蛋白，制得蛋白-磁性金属的中间分散产物；向所述蛋白-磁性金属的中间分散产物中加入碱，反应后制得所述水溶性蛋白包覆的磁性纳米颗粒。
[0027]由于本发明所制得的磁性金属纳米颗粒外面包覆有蛋白质，所以无需再进行额外的表面氨基化或是羧基化，可以直接修饰靶向分子，适用于活体成像、癌症特异性靶向、以及体内信号实时追踪等。
[0028]本发明中，磁性金属可以为铁、钻、银、络、猛等；蛋白可以为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清白蛋白、转铁蛋白、胶原蛋白，以及磷脂蛋白中的一种或多种。
[0029]蛋白的质量与磁性金属的摩尔比优选为(1?100g): (0.5?lOOOmmol);所使用的磁性金属盐可选自二价铁、三价铁的盐酸盐、硫酸盐、乙酸盐中的一种或多种。
[0030]在本发明的一实施方式中，将蛋白的水溶液与磁性金属盐的水溶液于20?80°C混合10?60分钟，制得蛋白-磁性金属的中间分散产物。
[0031]在本发明的另一实施方式中，向蛋白-磁性金属的中间分散产物中加入碱，以调节溶液的pH至碱性，于20?90°C中蛋白-磁性金属的中间分散产物反应1?24小时，制得水溶性蛋白包覆的磁性纳米颗粒。其中，碱可以为例如氢氧化钠、氢氧化钾或氨水。可通过加入碱，将体系的pH值调至例如10?14。
[0032]在本发明的另一实施方式中，还包括将所述蛋白-磁性金属与碱反应后的产物依次进行透析纯化处理、离心浓缩处理或者低温冻干处理，得到所述水溶性蛋白包覆的磁性纳米颗粒。例如，可将反应产物进行透析纯化处理72小时，每12小时更换一次水。
[0033]本发明的制备方法所使用的原料廉价易得、天然无毒、环境友好、具有生物适用性；反应设备普通易得、制备方法简便、绿色环保、产物无需进一步纯化，适用于大规模的生产；得到的产物外包覆蛋白质，无需再进行额外的表面氨基化或是羧基化，且结晶程度高、水溶性好、生物活性高，易于进一步修饰靶向分子，核磁共振信号优异、尺寸超小、易于进入组织细胞内部，适用于活体成像、癌症特异性靶向、以及体内信号实时追踪等生物医学应用。
[0034]以下，结合具体实施例对本发明的水溶性蛋白包覆的磁性纳米颗粒及其制备方法做进一步说明。其中，相关的测试仪器和条件如下:
[0035]透射电镜，将样品水溶液稀释为5mg/ml浓度，用移液器滴加在双面铜网干燥后，测试。仪器为Tecnai G2F20S-TWIN，美国FEI公司，电压:200KeV
[0036]XPS:测试仪器 Thermo Escalab 250Χ? (Thermo Scientific, China) using Mg asthe exciting source.
[0037]XRD:x射线粉末衍射仪D8Advance，德国Bruker AXS。测试角度:起始角=10，终止角=80，步宽=.01，波长=1.5406，40kV, 40mA。
[0038]弛豫率:7T小动物核磁共振成像仪(B1Spec70/20USR，Bruker)，T2-加权:RARE序列,TR:3000ms, TE:50ms。
[0039]磁滞回线:超导量子磁强计MPMS-7，测试温度:300k，磁场0_±5T。
[0040]活体MRI成像，西门子1.5Τ临床核磁共振成像仪。TSE序列，TR: 5520ms，TE: 120ms。
[0041]制备例1
[0042](1)将一定质量的牛血清白蛋白溶于水中，制备成20mg/mL的溶液；
[0043](2)取二价铁和三价铁的氯化盐制备铁离子混合溶液，三价铁及二价铁的混合摩尔比为1:2，铁元素的总浓度为100mmol/L ；
[0044](3)在磁力搅拌条件下，将0.8mL的铁盐混合溶液加入到10mL蛋白质水溶液中，充分反应30分钟，得到蛋白-铁的中间分散产物；
[0045](4)向步骤⑶得到的蛋白-铁的中间分散产物中加入lmL浓度为lmol/L的氢氧化钠水溶液，在37°C水浴中，搅拌反应8小时后停止反应。
[0046](5)将步骤(4)得到的产物进行透析纯化处理72小时，使用的透析袋为截留分子量为3500，每12小时更换一次水。
[0047](6)将透析后的产物经过离心浓缩处理，得到最终的蛋白质包覆的氧化铁纳米颗粒粉末样品。
[0048]对上述样品进行各项表征，具体参见图1至7。图1为样品的透射电子显微镜测试结果，表明得到的氧化铁纳米颗粒具有较小的尺寸；图2为样品的粒径分布图，显示样品的平均粒径大小为4.51纳米。图3为样品的X射线光电子能谱测试结果，在结合能为710.8电子伏的位置存在有一个明显的峰位，表明得到的纳米颗粒中铁元素的存在形式是四氧化三铁。图4为样品的X射线衍射光谱谱图，该谱图也表明制备的纳米颗粒是四氧化三铁的结晶形态，结晶程度良好。图5为样品的磁性测试图，样品的磁滞回线结果显示样品的饱和磁化强度是84.32emu每克。将样品配制成一系列不同浓度的水溶液之后，对其进行核磁共振成像测试，结果如图6所示，随着样品浓度的增加，得到的T2加权像也越来越暗，所得的结果与对应的铁元素浓度作图得到的结果如图7所示，数据结果呈现良好的线性关系，表明样品非常适用于核磁共振医学成像应用。
[0049]制备例2
[0050](