专利名称：卵黄水溶性蛋白质组分的提取方法
技术领域：
本发明属于生物分离工程与技术领域，具体是应用超滤技术从鸡卵黄中分离提取 四种水溶性蛋白质组分的方法，产品纯度均达到85%以上，部分产品纯度高于95%。
背景技术：
鸡卵黄含有119种蛋白质，占总质量的17.8%。其中，大部分与脂肪结合形成脂 蛋白，而水溶性的蛋白质相对较少，常见的种类有卵黄免疫球蛋白、卵黄蛋白、卵黄 磷蛋白、卵黄高磷蛋白等。
卵黄免疫球蛋白是指鸡卵黄中存在的主要免疫球蛋白，是母鸡在接受免疫后的 7 10天，即卵黄成熟期，由母鸡血液中的免疫球蛋白IgG选择性的转移到卵黄中而 形成的。所以，卵黄免疫球蛋白相当于哺乳动物的IgG，而哺乳动物的IgG则是初级 免疫应答中最重要的抗体。在抗感染中起到主力军的作用，能够促进单核巨噬细胞的 吞噬作用，中和细菌毒素的毒性，并能够与病毒抗原结合使病毒失去感染宿主细胞的 能力。
目前，通过母鸡免疫来获得抗体已得到广泛关注，被认为是获得抗体的最佳途径 之一。因为与哺乳动物的IgG相比，卵黄免疫球蛋白具有以下优点①由于种系距离 相差较大，禽类的卵黄免疫球蛋白与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉血清学反 应，这有利于提高免疫诊断检测的特异性和敏感性；②卵黄免疫球蛋白性质稳定。在 pH3-12之间，75。C以下，活性基本不受影响；③无需采血，只需收集鸡蛋，且价廉 易得。到目前为止，通过母鸡免疫的方法已获得包括SARS病毒在内的多种抗体。
卵黄磷蛋白和卵黄高磷蛋白是鸡卵黄中最主要的两种磷蛋白，也是鸡蛋的重要营 养物质。它们之间存在较强的亲和作用，常结合形成囊状颗粒。卵黄磷蛋白的分子呈 球形，由80%的蛋白质和20%的脂肪构成；卵黄高磷蛋白占卵黄干重的2%，分子内 50%的氨基酸为丝氨酸，且90%已磷酸化。
目前，从卵黄中分离蛋白质的主要方法有盐析法、聚乙二醇沉淀法、氯仿抽提 法、中链脂肪酸法、表面活性剂法等。然而这些技术均存在一定的局限性，其中，盐析法和聚乙二醇沉淀法容易引起蛋白质的失活和变性；氯仿抽提法、中链脂肪酸法、 表面活性剂法的处理周期较长，存在残留问题。
膜分离法通常指利用天然或人工合成的薄膜，以外界能量或化学位差为推动力， 对双组份或多组分的混合物进行分离、提纯和富集的方法。膜分离技术是20世纪50 年代发展起来的一项高效分离技术，与传统的分离技术相比，具有分离效率高、能耗 低、可连续操作、易于放大、无污染等优点。
超滤膜是指膜孔径在1 100nm之间，具有不对称结构的复合膜。由于其孔径尺 寸与生物大分子的尺寸较为接近，故可用于生物大分子如蛋白质等的分离与纯化。超 滤分离是分子级的，即可截留溶液中的大分子溶质，同时使小分子溶质透过；有时也 可以通过调节溶液中微环境，使预分离的蛋白质分子和膜表面带有不同性质的电荷， 再通过蛋白质分子之间、蛋白质与膜表面之间的静电作用，达到分离的目的。目前， 在生物加工领域，超滤技术常用于蛋白质的纯化与浓缩，在工业上已有较多应用，但 由于自然体系中蛋白质种类复杂，且存在较多的同工酶，使用超滤法直接分离得到高 纯度的功能蛋白质的实例极少，且这方面的研究仍处于实验室规模。
发明内容
本发明的目的是提供一种环境友好、操作简单、易于放大的四种卵黄水溶性蛋白 质超滤提取方法，且所有产品纯度均能达到85%以上，部分产品纯度高于95%。 本发明采取的技术路线是使用超滤法直接分离，按如下步骤实现
1. 将鸡蛋的蛋壳、蛋清和蛋黄膜除去，取蛋黄液；
2. 使用去离子水将卵黄液稀释至6 15倍，最佳为7 10倍，充分搅拌20 30分 钟后，于-20°<:冷冻8 12小时，再解冻；
3. 将上述部分解冻液在4'C下离心，弃去沉淀，取上清液；
4. 利用截留分子量为30 100kDa的市售超滤膜对上述步骤得到的上清液进行超 滤分离，分离条件4'C、 pH4.0 10.0，最佳为pH6.0 8.0，获得截流液A和滤出液 A'，滤出液A'即为卵黄高磷蛋白溶液；
5. 利用截留分子量为70 150kDa的市售超滤膜对步骤4得到的截留液A进行超 滤分离，分离条件4°C、 pH4.0 10.0，最佳为pH6.0 8.0，获得截流液B和滤出液 B，，截留液B为高纯度的卵黄免疫球蛋白溶液，而滤出液B'是一种未知的卵黄水溶 性蛋白质溶液，该蛋白质的分子量为50kDa，等电点(pl)为8.0;6. 将步骤2得到的部分解冻液在4'C条件下放置1 2小时，取上层清液部分，利 用0.22pm的滤纸过滤，取母液；7. 利用截留分子量为300kDa的市售超滤膜对步骤6得到的母液进行超滤分离， 分离条件4°C、 pH6.0 7.0，所得截留液C为卵黄磷蛋白溶液；8. 将所得到的滤出液A'、滤出液B'、截留液B和截留液C分别冻干10 12小 时，即获得四种卵黄水溶性蛋白质干粉。本发明直接应用超滤分离技术从鸡卵黄中提取了四种水溶性蛋白质组分，其中包 括卵黄免疫球蛋白、卵黄磷蛋白、卵黄高磷蛋白和一种分子量为50kDa的未知蛋白。 由于超滤膜是指膜孔径在1 100nm，具有不对称结构的复合膜。其孔径尺寸与生物 大分子的尺寸较为接近，故可用于生物大分子如蛋白质等的分离与纯化。超滤分离是 分子级的，即可截留溶液中的大分子溶质，而使小分子溶质透过，有时也可以通过调 节溶液中微环境，使预分离的蛋白质分子和膜表面带有不同性质的电荷，再通过蛋白 质分子之间、蛋白质与膜表面之间的静电作用，达到分离的目的。
具体实施方式
实施例l，从黄皮鸡蛋中提取卵黄水溶性蛋白质组分的方法，步骤1. 取八个新鲜的黄皮鸡蛋，用自来水洗净蛋壳，再用纸擦干，去除蛋壳和蛋清后， 用注射器针头轻轻将蛋黄膜剌破，收集蛋黄液，约100mL;2. 使用去离子水将上述步骤获得的卵黄液稀释至700mL，放入搅拌子，充分搅拌 20分钟后，置于-2(TC冷冻8小时，再解冻；3. 取上述解冻液400mL，在4。C下、用3000rpm离心，弃去沉淀，取上清液，约 350mL;4. 利用截留分子量为30kDa的市售聚砜膜对步骤3得到的上清液进行超滤分离， 分离条件为4'C、 pH6.0，滤出液为卵黄高磷蛋白溶液，纯度87.3%;5. 利用截留分子量为70kDa的市售再生纤维素膜对步骤4得到的截留液进行第二 次超滤分离，分离条件为4°C、 pH6.0，获得的截留液为卵黄免疫球蛋白溶液，纯度 95.1%;滤出液是分子量为50kDa的未知蛋白溶液，纯度96%;6. 取步骤2所获得的解冻液300 mL，在4。C条件下放置1小时，取上层清液部分， 利用0.22pm的滤纸过滤，取母液；7. 利用截留分子量为300kDa的市售超滤膜对步骤6得到的母液进行超滤分离，分离条件4'C、 pH6.0，获得的截留液为卵黄磷蛋白溶液，纯度98.4%;8.将得到的四种蛋白质溶液置于-6(TC冷阱中冻干10小时，可获得卵黄高磷蛋白 干粉约406mg、卵黄免疫球蛋白干粉约610mg、卵黄磷蛋白干粉约724mg、 50kDa的 未知蛋白干粉约730mg。实施例2，从白皮鸡蛋中提取卵黄水溶性蛋白质组分的方法，步骤1. 取六个新鲜的白皮鸡蛋，用自来水洗净蛋壳，再用纸擦干，去除蛋壳和蛋清后， 用注射器针头轻轻将蛋黄膜刺破，收集蛋黄液，约76mL;2. 使用去离子水将上述步骤获得的卵黄液稀释至760mL，放入搅拌子，充分搅拌 30分钟后，置于-20'C冷冻12小时，再解冻；3. 取上述解冻液420mL，在4。C下、用6000rpm离心，弃去沉淀，取上清液，约 360mL;4. 利用截留分子量为100kDa的市售聚砜膜对步骤3得到的上清液进行超滤分离， 分离条件为4'C、 pH8.0，滤出液为卵黄高磷蛋白溶液，纯度85.2%;5. 利用截留分子量为150kDa的市售聚砜膜对步骤4得到的截留液进行第二次超 滤分离，分离条件为4'C、pH8.0，获得的截留液为卵黄免疫球蛋白溶液，纯度91.8%; 滤出液是分子量为50kDa的未知蛋白溶液，纯度95.4%;6. 取步骤2所获得的解冻液340mL，在4。C条件下放置2小时，取上层清液部分， 利用0.22pm的滤纸过滤，取母液；7. 利用截留分子量为300kDa的市售超滤膜对步骤6得到的母液进行超滤分离， 分离条件4"、 pH7.0，获得的截留液为卵黄蛋白溶液，纯度98.1%;8. 将得到的四种蛋白质溶液置于-6(TC冷阱中冻干12小时，获得卵黄高磷蛋白干 粉约302 mg、卵黄免疫球蛋白干粉约483mg、卵黄蛋白干粉约658mg、 50kDa的未知 蛋白干粉约597 mg。实施例3，从鸡蛋中提取卵黄水溶性蛋白质组分的方法，步骤1. 取十个新鲜的鸡蛋，用自来水洗净蛋壳，再用纸擦干，去除蛋壳和蛋清后，用 注射器针头轻轻将蛋黄膜刺破，收集蛋黄液，约122mL;2. 使用pH5.0、 200mM的磷酸盐缓冲溶液将上述步骤获得的卵黄液稀释至 1000mL，放入搅拌子，充分搅拌25分钟后，置于-20。C冷冻10小时，再解冻；3. 取上述解冻液600mL，在4t下、用5000rpm离心，弃去沉淀，取上清液，约515mL;4. 利用截留分子量为100kDa的市售聚砜膜对步骤3得到的上清液进行超滤分离， 分离条件为4°C、 pH7.0，滤出液为卵黄高磷蛋白溶液，纯度86.7%;5. 利用截留分子量为100kDa的市售再生纤维素膜对步骤4得到的截留液进行第 二次超滤分离，分离条件为4°C、 pH7.0，获得的截留液为卵黄免疫球蛋白溶液，纯 度93.6%;滤出液是分子量为50kDa的未知蛋白溶液，纯度92.8%;6. 取步骤2所获得的解冻液400mL，在4。C条件下放置1.5小时，取上层清液部 分，利用0.22pm的滤纸过滤，取母液；7. 利用截留分子量为300kDa的市售超滤膜对步骤6得到的母液进行超滤分离， 分离条件4'C、 pH6.0，获得的截留液为卵黄蛋白溶液，纯度98.3%;8. 将得到的四种蛋白质溶液置于-6(TC冷阱中冻干11小时，获得卵黄高磷蛋白干 粉约558 mg、卵黄免疫球蛋白干粉约840mg、卵黄蛋白干粉约880mg、 50kDa的未知 蛋白干粉约972 mg。本发明工艺仅涉及稀释、冻融、离心、过滤和超滤五个简单步骤，相对目前的工 业、实验室提取工艺，具有操作简单、分离浓縮同步进行、活性损失小、回收率高的 特点，且未使用有机溶剂，可有效避免传统提取方法中有机溶剂引起的蛋白变性，杜 绝了有机溶剂残留造成的产品安全隐患；能耗低、环境污染小、分离效率高、产品纯 度可调控、控制因素单一，便于工业放大。
权利要求
1.一种卵黄水溶性蛋白质组分的提取方法，其特征是按如下步骤进行①将鸡蛋的蛋壳、蛋清和蛋黄膜除去，取蛋黄液；②使用去离子水将卵黄液稀释至6～15倍，充分搅拌20～30分钟后，于-20℃冷冻8～12小时，再解冻；③将上述部分解冻液在4℃下离心，弃去沉淀，取上清液；④利用截留分子量为30～100kDa的市售超滤膜对上述步骤得到的上清液进行超滤分离，分离条件4℃、pH4.0～10.0，获得截流液A和滤出液A’，滤出液A’即为卵黄高磷蛋白溶液；⑤利用截留分子量为70～150kDa的市售超滤膜对步骤④得到的截留液A进行超滤分离，分离条件4℃、pH4.0～10.0，获得截流液B和滤出液B’，截留液B即为高纯度的卵黄免疫球蛋白溶液，而滤出液B’是一种未知的卵黄水溶性蛋白溶液，该蛋白质的分子量为50kDa，等电点(pI)为8.0；⑥将步骤②得到的部分解冻液在4℃条件下放置1～2小时，取上层清液部分，利用0.22μm的滤纸过滤，取母液；⑦利用截留分子量为300kDa的市售超滤膜对步骤⑥得到的母液进行超滤分离，分离条件4℃、pH6.0～7.0，所得截留液C为卵黄磷蛋白溶液；⑧将所得到的滤出液A’、滤出液B’、截留液B和截留液C分别冻干10～12小时，即获得四种卵黄水溶性蛋白质干粉。
2. 依据权利要求1所述的卵黄水溶性蛋白质组分的提取方法，其特征是使用去 离子水将卵黄液稀释至7~10倍。
3. 依据权利要求1所述的卵黄水溶性蛋白质组分的提取方法，其特征是步骤④ 和步骤⑤中所说的超滤分离的条件为pH6.0 8.0、 4°C。
全文摘要
本发明提供了一种提取卵黄水溶性蛋白质的方法，属于生物分离工程技术领域，主要是应用超滤分离技术，经过稀释、冻融、离心、过滤和超滤五个简单步骤，即可从卵黄中提取四种高纯度的卵黄水溶性蛋白质，其中包括卵黄免疫球蛋白、卵黄磷蛋白、卵黄高磷蛋白和一种分子量为50kDa的未知蛋白，在提取过程中，未使用有机溶剂，有效避免了有机溶剂引起的蛋白变性，杜绝了溶剂残留造成的产品安全隐患。
文档编号C07K1/34GK101402672SQ20081015969
公开日2009年4月8日 申请日期2008年11月6日 优先权日2008年11月6日
发明者刘建国, 娟 杨, 王晶冰 申请人:中国石油大学(华东)