专利名称：人参水溶性蛋白的分离纯化制备方法
技术领域：
本发明属于蛋白质分离纯化技术领域，具体涉及一种采用缓冲液浸提、硫酸铵沉淀和各种层析柱层析技术相结合的人参水溶性蛋白的分离纯化制备方法。
背景技术：
人参蛋白及多肽的研究始于六十年代，主要集中于人参多肽的提取方法。1963年，德国的F.Gstirnor等人首次从人参根中检测出多种氨基酸谷氨酸、半光氨酸、酪氨酸等。1966年他们(Arch Pharm.1966，299(11)934～937)又采用电泳的方法从高丽白参的甲醇水提取液中得到5个小肽，未确定出一级结构。1980年，日本人Ando与Okada(Planta Medica.1980，3818～21)等发现人参水提取液中有一种强烈抑制肾上腺素诱导的脂肪分解的物质，此物质能被链霉蛋白酶(pronase)破坏，估计为蛋白或肽类化合物。经DEAE-Cellulose，Sephadex G-10，Avicel-Cellulose，Phosphoric-Cellulose等色谱手段分得一个14肽，氨基酸组成为2Asp，Thr，Ser，3Glu，3Gly，Ala，Val，Leu，Ile，未测出一级结构，之后也未查到继续研究此肽的报道。1990年Takaku和Okada(Planta Medica.1990，5627～30)等又报道从高丽红参中得到一种酸性物质，可以抑制肾上腺素诱导的脂肪分解并能刺激胰岛素参与的脂肪合成，并确定该酸性物质为焦谷氨酸。同时他们还指出红参中可能有一种非肽物质也有此活性。在此期间，韩国的Kim(CA.10868730s，107242499p)等报道从人参中分离纯化到有抗脂肪分解活性的寡肽，但未给出一级结构。Yagi等人1994年从人参中提取到一种四肽成分Val-D-Glu-D-ArG-Gly。并证明一些非蛋白氨基酸对其调节神经系统活性至关重要。魏俊杰等人(白求恩医科大学学报.1990，16(5)436～438)从生晒参中分离出两种人参多肽，分别是分子量为1kDa的11肽和分子量为1.3kDa的12肽，它们具有降低2BS细胞内多糖含量和增强2BS细胞内琥珀酸脱氢酶活力的作用。Chen等(Peptide Research.1998，52137～142)人利用水醇提取法，结合离子交换、凝胶过滤和RP-HPLC从人参中分离出六种含α氨基酸的小肽，并通过氨基酸序列分析已测定其结构为氧化性的谷胱甘肽及其类似物，实验证明，它具有调节动物睡眠的作用。另外，一种14肽也从人参中提取出来，结构为Glu-Thr-Val-Glu-Ile-Ile-ASP-Ser-Glu-Gly-Gly-Gly-ASP-Ala，它具有强烈的抗脂解活性(Jounal of Chromatography B.1996，687443～448)。吉林大学的张今等(高等学校化学学报.1985，61(4)376～380)，1985年报道用717型和732型离子交换树酯柱从人参花蕾中分得两个酸性肽，氨基酸组成分别为IASP-Thr-Ser-Glu-Gly-Ala-Val-Mat-Leu-Phe-Arg，分子量大于1.5kDa。IIASP-Thr-Ser-Glu-Gly-Ala-Val-Ile-Leu-Lys，分子量大于1.2kDa。1988年，他们(吉林大学自然科学学报.1988，475～78)又按照日本人Ando的分离程序及改进的分离程序(用Sephadex G-25凝胶过滤)从人参中分离出一个具有胰岛素作用的14肽，认为是Ando得到的14肽，但存在一个氨基酸的差异，并用DABITC/PICTC双偶合法测定了序列为Glu-Thr-Val-Glu-Ile-Ile-ASP-Ser-Glu-Gly-Gly-Gly-ASP-Ala。其后，又用CD谱研究了该肽的二级结构(生物化学与生物物理学报.1989，21(2)175～176)；生理活性研究表明有抗脂肪分解及降低血糖和肝糖作用(药学学报.1990，25(6)401～402；药学学报.1990，25(10)727～728)；对该肽的基因进行了化学合成和克隆(生物化学杂志.1990，6(3)193～195)。1991年又报道从红参中经DEAE-Cellulose，Sephadex G-10和RP-HPLC纯化得到两个肽(药学学报.1991，26(7)499～502)，其一为13肽3Gly，2Ser，2Glu，Ala，2Asp，Thr，Leu，Val；另一为15肽4Gly，3Ser，2Glu，2Ala，Asp，Thr，Leu，Ile。测出了15肽的N末端为Asp，各肽均未给出一级结构。
进入90年代中期，由于现代生物技术在中药领域的广泛应用，对于人参蛋白的研究才日益增多。应用二维电泳技术现已表明人参中共有人参蛋白300多种，其中已被报道的仅有40多种(Journal of Chromatography B.2005，815147～155Journal of Plant Physiology.2004，161837～845)，主要包括(1)类RNA酶蛋白类RNA酶蛋白是人参的主要蛋白(ginseng major protein，GMP)，分子量为28kDa，其氨基酸序列与植物的RNA酶具有高度同源性(Comparative Biochemistryand Physiology B.2002，132551～557)。二维电泳分析显示GMP的含量随季节的变化而变化，因此这一蛋白也被认为是人参的储存蛋白。(2)核糖核酸酶Lam和Ng从人参根中分离得到一种由27kDa和29kDa两个亚基组成的非耐热核糖核酸酶，其具有抗真菌、抗病毒和抑制增殖的活性(Biochemical and BiophysicalResearch Communications.2001，285419～423)。随后他们又从人参花蕾中分离得到一分子量23kDa的核糖核酸酶，但却没有抗真菌、抗病毒和抑制增殖的活性(Protein Expression and Purification.2004，33195～199)。Gennady也从人参愈伤组织中分离得到两种分子量都为18kDa的核糖核酸酶(FEBS Letters.1997，407207～210)。(3)几丁质样蛋白分子量1 5kDa，具有抗真菌功能(The InternationalJournal of Biochemistry and Cell Biology.2001，33，287～297)。(4)木聚糖酶从人参根部提取的木聚糖酶，分子量只有15kDa，明显低于从其他药用植物分离得到木聚糖酶，最适酶活温度为50℃，具有人I型免疫缺陷病毒转录抑制的活性(LifeSciences.2002，703049～3058)。(5)皂苷β～葡萄糖苷酶从人参中分离的皂苷β～葡萄糖苷酶能水解人参皂苷Rg3，得到抗癌物质人参皂苷Rh2，分子量59kDa，最适酶活温度为60℃(Chemical and Pharmaceutical Bulletin.2001，49795～798)。
发明内容
本发明的目的是提供一种高纯度人参水溶性蛋白的制备方法，其是将人参匀浆液反复浸提、用硫酸铵等沉淀得到粗人参总蛋白，再经超滤以及各种层析柱纯化，从而获得多种高纯度的人参水溶性蛋白产品。
本发明所述的制备方法包括如下步骤1)将鲜参切成小块，按1～3ml/g的比例加入含0.1～0.3mol/L NaCl、pH＝7～8的0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液匀浆，得匀浆液；再加匀浆液10～20倍体积的上述缓冲液，于1～10℃条件下浸提12～36小时，浸提后于1～10℃、3000～10000r/min离心10～60min，取上清液；然后向浸提后沉淀的人参沉渣中加入与第一次浸提时相同体积的上述缓冲液，于1～10℃条件下再浸提12～36小时，浸提后于1～10℃、3000～10000r/min离心10～60min，取上清液；进行2～3次浸提操作后，合并所得上清液，即为人参总蛋白粗提液；2)向上述人参总蛋白粗提液中加入固体硫酸铵(硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、或磷酸钠)至70～90％饱和度，混匀后于1～10℃静置12～36小时，再于1～10℃、3000～10000r/min离心10～60min，取沉淀；然后按1～3ml/g的比例将沉淀溶于pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液后装入透析袋中，透析袋的截留分子量为6000～8000Da，于1～10℃透析12～36小时，透析保留液(透析后留在透析袋内的物质，以下均与此相同)1～10℃、3000～10000r/min离心10～60min，取上清液冷冻干燥后即为人参总蛋白样品；3)先将人参总蛋白样品用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，1～2g人参总蛋白样品使用3000～6000ml缓冲液，再上样于截流分子质量为10kDa的超滤仪进行超滤，分别收集大、小分子流出液，冷冻干燥后得到分子质量大于10kDa的大分子样品A1和分子质量小于10kDa的小分子样品A2；
4)将大分子样品A1用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液透析(透析袋的截留分子量为6000～8000Da)，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min离心5～15min、上清液再经0.22～0.45μm滤膜过滤后上样于用此步骤所述缓冲液平衡好的Affi-gel(blue gel)亲和层析柱，用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线(用280nm紫外检测器进行检测)，再用含1～2mol/L NaCl的pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液进行盐阶段洗脱，流速为0.1～3.0ml/min，分别收集得到未吸附样品A1B1(未挂柱样品)和盐阶段洗脱样品A1B2；5)将盐洗脱样品A1B2用pH＝4.0～6.0、0.01～0.03mol/L醋酸铵-醋酸缓冲液透析(透析袋的截留分子量为6000～8000Da)，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min离心5～15min、上清液再经0.22～0.45μm滤膜过滤后上样于用此步骤所述缓冲液平衡好的SP-Sepharose FF离子交换柱，用pH＝4.0～6.0、0.01～0.03mol/L醋酸铵-醋酸缓冲液洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线，再用含0～1mol/L NaCl的此步骤所述缓冲液进行盐梯度洗脱，流速为0.1～3.0ml/min，收集第二个洗脱峰A1B2C2，得人参蛋白(Ginseng Protein)GP1，其分子量范围在23～27kDa；通过SDS～PAGE凝胶电泳可判定本步骤所得产物为人参蛋白，因为只有蛋白才会在SDS～PAGE凝胶电泳上显示条带。分子量不同的蛋白其在SDS～PAGE凝胶电泳上的位置不同，得到的各蛋白分子量可以通过已知标准蛋白分子量的标准曲线方程来获得；6)将样品A1B1用pH＝4.0～6.0、0.01～0.03mol/L醋酸铵-醋酸缓冲液透析(透析袋的截留分子量为6000～8000Da)，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min离心5～15min、上清液再经0.22～0.45μm滤膜过滤后上样于用此步骤所述缓冲液平衡好的SP-Sepharose FF离子交换柱，用pH＝4.0～6.0、0.01～0.03mol/L醋酸铵-醋酸缓冲液洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线，再用含0～1mol/L NaCl的此步骤所述缓冲液进行盐梯度洗脱，流速为0.1～3.0ml/min，收集未吸附样品A1B1C1；收集第一个洗脱峰A1B1C2，得人参蛋白GP2，其分子量范围在60～70kDa；收集第二个洗脱峰A1B1C3；7)将样品A1B1C1用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液透析(透析袋的截留分子量为6000～8000Da)，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min离心5～15min、上清液再经0.22～0.45μm滤膜过滤后上样于用此步骤所述缓冲液平衡好的DEAE-Sepharose FF离子交换柱，用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液洗柱直至280nm处吸收峰回到基线，用含0～1mol/L NaCl的此步骤所述缓冲液进行盐梯度洗脱，流速为0.1～3ml/min，收集第一个洗脱峰A1B1C1D1，得人参蛋白GP3，。其分子量范围在10～20kDa；8)将样品A1B1C3用含1～2mol/L硫酸铵的pH＝7～8、0.01～0.03mol/LTris-HCl缓冲液透析(透析袋的截留分子量为6000～8000Da)，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min离心5～15min、上清液经0.22～0.45μm滤膜过滤后上样于用此步骤所述缓冲液平衡好的Phenyl Sepharose 6 FF疏水层析柱，用含1～2mol/L硫酸铵的pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线，流速为0.1～3ml/min，收集未吸附部分A1B1C3D1，得人参蛋白GP4，其分子量范围在60～70kDa；9)将样品A2上样于用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液平衡好的Sephadex G-25凝胶过滤层析柱，用此步骤所述缓冲液洗脱至样品的280nm处吸收峰回到基线，流速为0.1～3ml/min，收集第一个洗脱峰A2B1，得人参蛋白GP5，其分子量范围在5～10kDa；10)上述各步骤获得的人参蛋白样品GP1～GP5，分别经过pH＝7～8、0.01～0.03mol/LTris-HCl缓冲液于1～10℃透析12～36h，透析袋截留分子量范围为6000～8000Da，透析保留液再于1～10℃、3000～10000r/min离心10～60min，上清液冷冻干燥后即得各种人参水溶性蛋白。
本发明具有的优点在于获得各人参蛋白的纯化工艺简单、周期短、见效快，所得样品在SDS～PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳中除GP4以外均显示一条带，说明已达到电泳纯，收率分别为GP1(56％)、GP2(67％)、GP3(81％)、GP4(92％)、GP5(89％)。采用SP-Sepharose FF和DEAE-Sepharose FF离子交换柱层析具有纯化效果好、上样量大、样品得率较高且可用于放大生产的特点。
图1实施例1制备的人参总蛋白及各纯化蛋白的SDS～PAGE电泳图。
如图1所示，其中M表示的是分子量标准蛋白，自上而下分子量依次为97kDa、66kDa、43kDa、31kDa、20kDa、14kDa；GP1～GP5为各纯化蛋白；GP为人参总蛋白。
具体实施例方式
实施例15种人参蛋白的分离纯化1、人参总蛋白的提取称取100g鲜参切成小块，加300ml含0.15mol/L NaCl的pH＝7.4的0.01mol/L Tris-HCl缓冲液匀浆，匀浆液再加3000ml含0.15mol/L NaCl的pH＝7.4的0.01mol/L Tris-HCl缓冲液于4℃条件下浸提24小时，浸提后于4℃、6000r/min离心30min，得上清液3100ml；然后向沉淀的人参沉渣中再加入3000ml含0.15mol/L NaCl的pH＝7.4的0.01mol/L Tris-HCl缓冲液，于4℃条件下再浸提24小时，浸提后于4℃、6000r/min离心30min，得上清液3000ml；合并2次浸提所得上清液，即得人参总蛋白粗提液6100ml；2、硫酸铵沉淀向上述步骤获得的6100ml人参总蛋白粗提液中加入3148克固体硫酸铵(80％饱和度)，混匀后于4℃静置24小时，再于4℃、6000r/min离心30min，得沉淀3.2克；然后按3ml/g的比例将沉淀溶于pH＝7.4、0.01mol/LTris-HCl的缓冲液后装入透析袋中，透析袋截留分子量是8000Da，4℃透析24小时，透析保留液再于4℃、6000r/min离心30min，取上清液冻干后得人参总蛋白样品2g，见电泳图1中的GP；GP中包含有下述步骤制备的GP1～GP5各蛋白，除GP1～GP5各蛋白外还有分子量范围在15～25kDa之间的两条带没被分离出来，GP1为类RNA酶蛋白，具有抗真菌、抗病毒和转录抑制活性；GP3为壳多糖酶样蛋白，具有抗真菌功能；GP4为人参核糖核酸酶，该蛋白主要由29kDa和27kDa两个亚基组成，具有抗真菌和抗病毒的活性；采用本发明所述方法获得的人参蛋白GP2和GP5未见文献报道；3、超滤取上述步骤制备的人参总蛋白样品1g，用pH＝7.4、0.01mol/L Tris-HCl缓冲液溶解至3000ml，再用截留分子量为10kDa的超滤膜超滤，冻干，分别得到900mg分子量大于10kDa的大分子组份A1和100mg分子量小于10kDa的小分子组份A2；4、亲和层析用pH＝7.4、0.01mol/L Tris-HCl缓冲液平衡Affi-Gel(blue gel)层析柱，先将大分子组份A1用pH＝7.4、0.01mol/L Tris-HCl缓冲液透析，透析袋截留分子量是8000Da，透析保留液于4℃以12000r/min离心10min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤，所得过滤液再加入Affi-Gel(blue gel)层析柱内，用pH＝7.4、0.01mol/L Tris-HCl缓冲液洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线，采用含1.5mol/L NaCl的此步骤所述缓冲液进行盐阶段洗脱，收集得到未吸附部分A1B1850mg和1.5mol/L NaCl洗脱样品A1B2 50mg，洗脱流速0.3ml/min，用UV280nm检测洗脱过程；5、阳离子交换层析用pH＝5.0、0.01mol/L醋酸铵-醋酸缓冲液平衡SP-Sepharose FF层析柱，将A1B2用此步骤所述缓冲液透析，透析袋截留分子量是8000Da，透析保留液于4℃以12000r/min离心10min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤，所得过滤液再加入SP-Sepharose FF层析柱内，用pH＝5.0、0.01mol/L醋酸铵-醋酸缓冲液洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线，采用含0～0.5mol/LNaCl的此步骤所述缓冲液进行梯度洗脱，洗脱流速0.5ml/min，收集第二个洗脱峰；将第二个洗脱峰A1B2C2于pH＝7.4、0.01mol/LTris-HCl缓冲液4℃透析24小时，透析保留液再于4℃、6000r/min离心30min，取上清液冻干后保存，得人参蛋白样品GP1(18mg)，其分子量是25kDa，电泳见图1中的GP1，UV280nm检测洗脱过程；6、用pH＝5.0、0.01mol/L醋酸铵-醋酸缓冲液平衡SP-Sepharose FF层析柱，将A1B1用此步骤所述缓冲液透析，透析袋截留分子量8000Da，透析保留液于4℃以12000r/min离心10min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤，所得过滤液加入SP-Sepharose FF层析柱内，用pH＝5.0、0.01mol/L醋酸铵-醋酸缓冲液洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线，再用含0～0.5mol/L NaCl的此步骤所述缓冲液进行梯度洗脱，洗脱流速0.5ml/min，收集得到未吸附部分A1B1C1、第一个洗脱峰A1B1C2和第二个洗脱峰A1B1C3，将A1B1C2于pH＝7.4、0.01mol/L Tris-HCl缓冲液4℃透析24小时，透析保留液再于4℃、6000r/min离心30min，取上清液冻干后保存，得人参蛋白样品GP2(49mg)，其分子量是65kDa，电泳见图1中的GP2，UV280nm检测洗脱过程；7、阴离子交换层析用pH＝7.4、0.01mol/L Tris-HCl缓冲液平衡DEAE-Sepharose FF层析柱，将A1B1C1用此步骤所述缓冲液透析，透析袋截留分子量是8000Da，透析保留液于4℃以12000r/min离心10min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤，所得过滤液加入DEAE-Sepharose FF层析柱内，用pH＝7.4、0.01mol/LTris-HCl缓冲液洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线，用含0～0.5mol/L NaCl的此步骤所述缓冲液进行梯度洗脱，洗脱流速0.5ml/min，收集得到两个洗脱峰，将第一个洗脱峰A1B1C1D1于pH＝7.4、0.01mol/L Tris-HCl缓冲液4℃透析24小时，透析保留液再于4℃、6000r/min离心30min，取上清液冻干后保存，得人参蛋白样品GP3(24mg)，其分子量是15kDa，电泳见图1中的GP3，UV280nm检测洗脱过程；8、疏水层析用含1.7mol/L硫酸铵的pH＝7.4、0.01mol/L Tris-HCl缓冲液平衡Phenyl-Sepharose 6FF(high sub)疏水层析柱，将A1B1C3用此步骤所述缓冲液透析，透析袋截留分子量是8000Da，透析保留液于4℃以12000r/min离心10min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤，所得过滤液加入Phenyl-Sepharose 6 FF(high sub)疏水层析柱内，用含1.7mol/L硫酸铵的pH＝7.4、0.01mol/LTris-HCl缓冲液洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线，收集得到未吸附部分A1B1C3D1，将A1B1C3D1于pH7.4、0.01mol/LTris-HCl缓冲液4℃透析24小时，透析保留液再于4℃、6000r/min离心30min，取上清液冻干后保存，得人参蛋白样品GP4(308mg)，其分子量是66kDa，电泳见图1中的GP4，洗脱流速0.5ml/min，UV280nm检测洗脱过程；9、凝胶过滤层析取100mg A2冻干品，溶于1ml pH＝7.4、0.01mol/L Tris-HCl缓冲液中，于4℃以12000r/min离心10min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤，所得过滤液加入已用此步骤所述缓冲液平衡好的Sephadex G-25凝胶层析柱中，用此缓冲液洗脱，收集得到第一个洗脱峰A2B1，将A2B1于pH7.4、0.01mol/L Tris-HCl缓冲液4℃透析24小时，再于4℃、6000r/min离心30min，取上清液冻干后保存，得人参蛋白样品GP5(55mg)，其分子量是8kDa，电泳见图1中的GP5，洗脱流速0.3ml/min，UV280nm检测洗脱过程。
权利要求
1.人参水溶性蛋白的分离纯化制备方法，其包括如下步骤(1).将鲜参切成小块，按1～3ml/g的比例加入含0.1～0.3mol/L NaCl、pH＝7～8的0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液匀浆，浸提后合并所得上清液，即为人参总蛋白粗提液；(2).向上述人参总蛋白粗提液中加入固体硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠或磷酸钠至70～90％饱和度，混匀后于1～10℃静置12～36小时，再于1～10℃、3000～10000r/min离心10～60min，取沉淀；然后按1～3ml/g的比例将沉淀溶于pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液后装入透析袋中，透析袋截留分子量为6000～8000Da，1～10℃透析12～36小时，透析保留液于1～10℃、3000～10000r/min离心10～60min，取上清液冷冻干燥后即为人参总蛋白样品；(3).将人参总蛋白样品上样于截流分子质量为10kDa的超滤仪进行超滤，分别收集大、小分子流出液，冷冻干燥后得到分子质量大于10kDa的大分子样品A1和分子质量小于10kDa的小分子样品A2；(4).将样品A1用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液透析、透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min离心5～15min、上清液经0.22～0.45μm滤膜过滤后上样于用此步骤缓冲液平衡好的Affi-gel(bluegel)亲和层析柱，洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线，再用含1～2mol/L NaCl的此步骤缓冲液进行盐阶段洗脱，流速为0.1～3.0ml/min，分别收集得到未吸附样品A1B1和盐阶段洗脱样品A1B2；(5).将盐洗脱样品A1B2用pH＝4.0～6.0、0.01～0.03mol/L醋酸铵-醋酸缓冲液透析，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min离心5～15min、上清液经0.22～0.45μm滤膜过滤后上样于用此缓冲液平衡好的SP-Sepharose FF离子交换柱，洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线，再用含0～1mol/L NaCl的此缓冲液进行盐梯度洗脱，流速为0.1～3.0ml/min，收集第二个洗脱峰A1B2C2，得人参蛋白GP1，其分子量范围在23～27kDa；(6).将样品A1 B1用pH＝4.0～6.0、0.01～0.03mol/L醋酸铵-醋酸缓冲液透析，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min离心5～15min、上清液经0.22～0.45μm滤膜过滤后上样于用此缓冲液平衡好的SP-SepharoseFF离子交换柱，用缓冲液洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线，再用含0～1mol/L NaCl的此缓冲液进行盐梯度洗脱，流速为0.1～3.0ml/min，收集未吸附样品A1B1C1，收集第一个洗脱峰A1B1C2，得人参蛋白GP2，其分子量范围在60～70kDa，并收集第二个洗脱峰A1B1C3；(7).将样品A1B1C1用pH＝7～8、0.01～0.03mol/LTris-HCl缓冲液透析，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min离心5～15min、上清液经0.22～0.45μm滤膜过滤后上样于用此缓冲液平衡好的DEAE-Sepharose FF离子交换柱，洗柱直至280nm处吸收峰回到基线，用含0～1mol/L NaCl的此缓冲液进行盐梯度洗脱，流速为0.1～3ml/min，得到第一个洗脱峰A1B1C1D1，为人参蛋白GP3，其分子量范围在10～20kDa；(8).将样品A1B1C3用含1～2mol/L硫酸铵的pH＝7～8、0.01～0.03mol/LTris-HCl缓冲液透析，透析保留液于1～10℃以10000～15000r/min离心5～15min、上清液经0.22～0.45μm滤膜过滤后上样于用此缓冲液平衡好的Phenyl Sepharose 6 FF疏水层析柱，用缓冲液洗柱直至样品的280nm处吸收峰回到基线，流速为0.1～3ml/min，得到未吸附部分A1B1C3D1，为人参蛋白GP4，其分子量范围在60～70kDa；(9).将样品A2上样于用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液平衡好的Sephadex G-25凝胶过滤层析柱，用此缓冲液洗脱至样品的280nm处吸收峰回到基线，流速为0.1～3ml/min，得到第一个洗脱峰A2B1，为人参蛋白GP5，其分子量范围在5～10kDa；(10).收集上述各步骤获得的人参蛋白样品GP1～GP5，分别经过pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液1～10℃透析12～36h，透析袋截留分子量范围为6000～8000Da，透析保留液再于1～10℃、3000～10000r/min离心10～60min，取上清液冷冻干燥后即得人参水溶性蛋白。
2.如权利要求1所述的人参水溶性蛋白的分离纯化制备方法，其特征在于步骤(1)浸提是向匀浆后得到的匀浆液中加入10～20倍体积的此步骤所述缓冲液，于1～10℃条件下浸提12～36小时，浸提后于1～10℃、3000～10000r/min离心10～60min，取上清液；然后向沉淀的人参沉渣中加入与第一次浸提时相同体积的同种缓冲液，于1～10℃条件下再浸提12～36小时，浸提后于1～10℃、3000～10000r/min离心10～60min，取上清液；进行2～3次浸提后，合并所得上清液。
3.如权利要求1所述的人参水溶性蛋白的分离纯化制备方法，其特征在于步骤(2)是向人参总蛋白粗提液中加入固体硫酸铵至70～90％饱和度。
4.如权利要求3所述的人参水溶性蛋白的分离纯化制备方法，其特征在于步骤(2)是向人参总蛋白粗提液中加入固体硫酸铵至80％饱和度。
5.如权利要求1所述的人参水溶性蛋白的分离纯化制备方法，其特征在于步骤(3)超滤步骤前先将人参总蛋白样品用pH＝7～8、0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，1～2g人参总蛋白样品使用3000～6000ml缓冲液。
全文摘要
本发明属于蛋白质分离纯化技术领域，具体涉及一种采用缓冲液抽提、硫酸铵沉淀和亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析分离纯化制备人参蛋白的方法。其是将人参匀浆液浸提后加入固体硫酸铵至80％饱和度，经Tris－HCl缓冲液平衡透析、高速离心后超滤、多种层析纯化后得到5种人参蛋白(Ginseng Protein)GP1－GP5，其中GP1为类RNA酶，GP3为壳多糖酶样蛋白，GP4为人参核糖核酸酶，GP2和GP5两种蛋白均为首次报道。本发明具有纯化效果好、上样量大、样品收率较高且可用于放大生产等特点。所得样品在SDS－PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳中除GP4以外均显示一条带，说明已达到电泳纯。
文档编号C07K1/34GK101092448SQ200710055850
公开日2007年12月26日 申请日期2007年7月6日 优先权日2007年7月6日
发明者赵雨, 张巍, 李红艳, 惠歌, 李银清, 姜先刚, 唐任能, 幺宝金 申请人:长春中医药大学