一种菝葜水溶性成分的含量检测方法
【专利摘要】本发明属于中药材的质量检测领域，具体涉及一种菝葜水溶性成分的含量检测方法，所述的检测方法为检测菝葜药材中绿原酸和Helicioside?A的含量，具体为菝葜药材中绿原酸的含量≥0.10%，Helicioside?A的含量≥0.05%。本发明通过色谱条件优化，应用变换波长HPLC法首次同步测定菝葜中绿原酸和Helicioside?A两个不同类别的水溶性药效成分，对菝葜中药材的检测及相关中成药的检测、以及建立菝葜药材及相关中成药质量检测标准具有重要的意义；本发明所提供的菝葜的检测方法能较全面地反映菝葜水溶性代表活性成分，且具有快速、重现性好、稳定性好的特点。
【专利说明】一种菝葜水溶性成分的含量检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于中药材的质量控制领域，尤其涉及中药材菝葜或同属植物水溶性成分的含量检测方法，还包括原料含有菝葜的中药制剂的水溶性成分的含量检测方法。
【背景技术】
[0002]菝葜为百合科植物菝葜(Smilax china L.)、长托菝葜(S.ferox Wall, exKunth)、黑果菝葜(S.glauco-china Warb.)、托柄菝葜(S.discotis Warb.)、小果菝葜(S.davidiana A.DC)、西南菝葜(S.biumbellata Warb.)、柔毛菝葜(S.chingii Wang etTang)、红果菝葜(S.polycoleaffarb.)等植物的干燥根莖。秋末至次年春采挖，除去须根，洗净，晒干或趁鲜切片，干燥。味甘，微苦涩，性平，归肝肾经。传统医学认为其根茎具有药用价值，具有祛风利湿、解毒散瘀的功效，可用于治疗筋骨酸痛、小便淋漓、带下量多和疔疮痈肿。
[0003]菝葜为《中国药典》自2005年版开始收载的品种之一，其[含量测定]项下选用薯蓣皂苷元作为含量测定指标，用酸水解法测定其中薯蓣皂苷元的含量。
[0004]“气相色谱法测定菝葜中薯蓣皂苷元含量”【参见刘杨、王永庆、邱宁婴等.气相色谱法测定菝葜中薯蓣皂苷元含量[J].江苏药学与临床研究，2004，12(4):14~15)】报道了一 种气相色谱法测定菝葜中薯蓣皂苷元含量的方法，通过测定薯蓣皂苷元的含量对中药材菝葜的质量进行控制。
[0005]申请号为200510200269.5的中国专利申请公开了一种中药菝葜提取物的制备方法和质量控制方法，所公开的质量控制方法中是采用液相色谱法测定菝葜中薯蓣皂苷元含量的方法，从而通过测定薯蓣皂苷元的含量对中药材菝葜的质量进行控制。
[0006]薯蓣皂苷经酸水解生成含有27个碳原子的薯蓣皂苷元，薯蓣皂苷与纤维素结合存在于细胞壁中，由于植物细胞壁比较坚韧，因而经典的酸水解法仅能提取1/4的皂苷元。目前总皂苷水解方法主要采用酸水解，另外还有采用两相溶剂水解法和生物水解法。在酸水解过程中，值得注意的问题是常有副反应发生，一是若用盐酸水解则有可能发生羟基氯代；二是薯蓣皂苷元易脱水转变为A3’5-de0Xytig0genin，其所得量可随酸的浓度、供试品稀释程度增加而增加，而且苷比苷元更容易形成脱水产物。此外，还可发生25S转25R构型的差向异构化，产生C 25-epimer及F环开环的化合物等，因此要注意控制好水解条件(聂凌鸿，林淑英，宁正祥.薯蓣属植物中薯蓣皂苷元的研究进展[J].中国生化药物杂志，2004, 25(5):318~320)。菝葜药材中大量的纤维素和淀粉的存在对水解有干扰作用，因而薯蓣皂苷元的收率低，对于菝葜的含量测定有很大的影响，也影响菝葜含量测定的准确性，同时考虑到薯蓣皂苷元为水解产物，因系水解产物且为非专属性成分，目前药品技术法规也不提倡使用水解产物作为含量测定指标，在实际检验操作中发现，上述方法存在专属性差、操作繁琐、可控性差、含量测定结果稳定性差等诸多不足，严重影响标准的可操作性。
[0007]为此本发明人在对菝葜开展系统植化研究的基础上，将其含量测定指标选定为稳定可控的二氢黄酮醇苷类的活性成分落新妇苷和黄杞苷，提出了申请号为200810089423.X、发明名称为“一种菝葜的质量控制方法”的发明专利申请，并获得了发明专利权。在此基础上将其[含量测定]指标修订为测定其中主要二氢黄酮醇苷类代表性成分落新妇苷和黄杞苷，专属性有了显著提高，并列为《中国药典》2010年版标准。
[0008]经过本发明人进一步研究，菝葜的质量检测方法可进一步提高。菝葜作为常用大宗药材，临床应用非常广泛，且该属不同种很难区分，存在不同种混用的现象，因此亟待寻求一种可操作性的检测方法，以建立更具专属性、稳定性、可控性的质量标准，确保菝葜临床用药安全可控。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供一种菝葜水溶性成分的含量检测方法，该方法精密度、稳定性、重现性良好，有利于菝葜的质量控制和保障临床安全用药。
[0010]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0011]一种菝葜水溶性成分的含量检测方法，其中，所述的含量检测方法为检测菝葜药材中绿原酸和/或HeliciosideA的含量。
[0012]本发明人根据菝葜临床多以水煎入药的特点，选择从菝葜水溶性成分入手，首次从菝葜中分离得到绿原酸和HeliciosideA两个代表性水溶性成分，而且绿原酸也是公认具有广谱抗菌效果的活性成分，与菝葜在临床上用于抗菌消炎的作用是相关的，故以此作为药效成分控制菝葜药材质量，具有较好的质量药效相关性。
[0013]本发明所述的菝葜水溶性成分的含量检测方法中，菝葜药材中绿原酸的含量≥0.10%, HeliciosideA的含量≥0.05% ;优选菝葜药材中绿原酸的含量≥0.20%，HeliciosideA的含量> 0.10%。本发明人经过系统的检测方法学研究，采用变换波长法，建立了 HPLC法同步测定这两个不同类别代表性成分的含量测定方法，含量测定结果表明，两个成分均为其主要成分之一，可用于菝葜的检测，建立菝葜中药材的质量标准。
[0014]具体地说，本发明所述的菝葜水溶性成分的含量检测方法包括如下步骤:
[0015]I)色谱条件
[0016]以十八烷基键合硅胶为填充剂，以甲醇-酸水、乙腈-酸水或者甲醇-乙腈-酸水混合溶液为流动相；检测波长:绿原酸为325nm，HeliciosideA为283nm ;柱温:35°C ;流速:
1.0ml.mirT1,绿原酸和HeliciosideA对应的保留时间分别为7.3min和13min ；
[0017]2)供试品溶液的制备
[0018]取菝葜粉末1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入提取溶剂25ml，密塞，称定重量，提取，放冷，称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0019]3)对照品溶液的制备
[0020]精密称取绿原酸和HeliciosideA各IOmg,分别制成浓度为Img.ml-1对照品溶液储备液，分别吸取两储备液各Iml于同一个IOml量瓶中，加甲醇至刻度，即得绿原酸
0.1039mg.mF1 和 HeliciosideA0.0980mg.mF1 的混合对照品溶液；
[0021]4)测定法
[0022]分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得；菝葜中含绿原酸≥0.10%，含Helicioside A≥0.05% ;优选菝葜中含绿原酸≥0.20%，含HeliciosideA ^ 0.10%。[0023]本发明人采用高效液相色谱法同时检测菝葜药材中绿原酸和HeliciosideA的含量，通过检测方法学研究，优化了处理方法，色谱条件，表明本含量检测方法具有操作简便、准确、重复性好等特点，能够较好地检测菝葜药材的质量。
[0024]更进一步的，步骤I)中所述的以十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱为YMCpackODS-AQ液相色谱柱，优选型号为4.6 X 250mm5 μ m的YMC pack ODS-AQ液相色谱柱。
[0025]步骤I)中所述的流动相为体积比11:89的乙腈-水、体积比11:89的乙腈-0.2%磷酸溶液或体积比10:8:82甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液；优选体积比10:8:82的甲醇-乙
腈-0.2%磷酸溶液。
[0026]步骤2)中所述的提取溶剂为丙酮、乙醇或甲醇，优选甲醇，更优选80%甲醇。
[0027]步骤2)中所述的提取为超声提取、回流提取或索氏提取，优选超声提取，更优选超声提取45min，更优选在功率250W、频率40kHz的条件下超声提取45min。
[0028]本发明中，所述的菝葜药材包括同属不同种的菝葜，具体包括长托菝葜、黑果菝葜、西南菝葜或土茯苓。
[0029]本发明所述的菝葜水溶性成分的含量检测方法也适宜于同属不同种的菝葜，如长托菝葜、黑果菝葜、西南菝葜或土茯苓等。
[0030]与现有技术相比，本发明所提供的方法具有如下优点:
[0031 ] (I)本发明通过色谱条件优化，应用变换波长HPLC法首次同步测定菝葜中绿原酸和HeliciosideA两个不同类别的水溶性药效成分，对菝葜中药材的检测及相关中成药的检测、以及建立菝葜药材及相关中成药质量检测标准具有重要的意义；
[0032](2)本发明所提供的菝葜水溶性成分的含量检测方法能较全面地反映菝葜水溶性代表活性成分，且具有快速、重现性好、稳定性好的特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1为HeliciosideA纯度色谱图；
[0034]图2 为 HeliciosideA 光谱图；
[0035]图3-a为283nm检视菝葜样品色谱图；
[0036]图3-b为325nm检视菝葜样品色谱图；
[0037]图4-a为混合对照品HPLC图和相应对照品的光谱图；
[0038]图4-b为混合对照品HPLC图和相应对照品的光谱图；
[0039]图4-c为混合对照品HPLC图和相应对照品的光谱图；
[0040]图5-a为菝葜样品HPLC图与对照品相应保留时间的峰的光谱图；
[0041]图5-b为菝葜样品HPLC图与对照品相应保留时间的峰的光谱图；
[0042]图5-c为菝葜样品HPLC图与对照品相应保留时间的峰的光谱图；
[0043]图6为绿原酸标准曲线；
[0044]图7 为 HeliciosideA 标准曲线。
【具体实施方式】
[0045]以下为本发明的【具体实施方式】，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。[0046]【实施例1】菝葜水溶性成分的含量检测方法
[0047]I)色谱条件
[0048]色谱柱:YMC pack 0DS-AQ液相色谱柱(4.6X250mm5 μ m);流动相:体积比10:8:64甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液；检测波长:绿原酸为325nm，HeliciosideA为283nm ;柱温:35°C;流速:1.0ml.mirT1,绿原酸和HeliciosideA对应的保留时间分别为7.3min和13min ；
[0049]2 )供试品溶液的制备
[0050]取菝葜粉末1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25ml作为提取溶剂，密塞，称定重量，超声提取45min (功率250W、频率40kHz)，放冷，称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0051 ] 3)对照品溶液的制备
[0052]精密称取绿原酸和HeliciosideA各IOmg,分别制成浓度为Img.π-1对照品溶液储备液，分别吸取两储备液各Iml于同一个IOml量瓶中，加甲醇至刻度，即得绿原酸0.1039mg.mF1 和 HeliciosideA0.0980mg.mF1 的混合对照品溶液；
[0053]4)测定法
[0054]分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得；菝葜中含绿原酸≥0.10%，含HeliciosideA≥0.05%。
[0055]【实施例2】菝葜水溶性成分的含量检测方法
[0056]具体操作步骤同实施例1，与实施例1不同的是步骤2)中的提取溶剂为50%甲醇。
[0057]【实施例3】菝葜水溶性成分的含量检测方法
[0058]具体操作步骤同实施例1，与实施例1不同的是步骤2)中的提取溶剂为乙醇。
[0059]【实施例4】菝葜水溶性成分的含量检测方法
[0060]具体操作步骤同实施例1，与实施例1不同的是步骤2)中的提取为回流提取2小时。
[0061]【实施例5】菝葜水溶性成分的含量检测方法
[0062]具体操作步骤同实施例1，与实施例1不同的是步骤2)中的提取为超声提取30mino
[0063]【实施例6】菝葜水溶性成分的含量检测方法
[0064]具体操作步骤同实施例1，与实施例1不同的是步骤2)中的提取溶剂为丙酮。
[0065]【实施例7】菝葜水溶性成分的含量检测方法
[0066]具体操作步骤同实施例1，与实施例1不同的是步骤I)中的流动相为体积比11:89的乙臆-水。
[0067]【实施例8】菝葜水溶性成分的含量检测方法
[0068]具体操作步骤同实施例1，与实施例1不同的是步骤I)中的流动相为体积比11:89的乙腈-0.2%溶液。
[0069]【实施例9】菝葜水溶性成分的含量检测方法
[0070]具体操作步骤同实施例1，与实施例1不同的是步骤2)中的提取为索氏提取。
[0071]试验例I
[0072]1、仪器、药品与试剂
[0073]1.1 仪器[0074]Waters2695高效液相色谱仪，waters996 二极管矩阵检测仪，Empower色谱工作站。1.2药品与试剂
[0075]绿原酸(对照品)；HeliciosideA (对照品，纯度大于98.0%);不同产地的菝葜药材由桂林三金药业股份有限公司提供，经郑跃年高级工程师鉴定；甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水；磷酸为分析纯。
[0076]1.2.1HeliciosideA 纯度检测
[0077]精密称取置五氧化二磷干燥器中干燥至恒重的HeliciosideA对照品各10.0mg,置IOml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀，制成每1ml含1.0mg的HeliciosideA对照品溶液，精密吸取10 μ 1，注入液相色谱仪，PAD-UV设置为190至400nm全波段检测，记录色谱仪，每40nm为间隔采集数据一次，用归一化法计算HeliciosideA平均含量为99.28%，符合含量测定用对照品纯度要求，考虑到实际测定方便，测定中将对照品含量以100%计。结果见表1，色谱图见图1、图2。其结构式如下:
[0078]
【权利要求】
1.一种菝 葜水溶性成分的含量检测方法，其特征在于，所述的含量检测方法为检测菝葜药材中绿原酸和/或Helicioside A的含量。
2.根据权利要求1所述的菝葜水溶性成分的含量检测方法，其特征在于，菝葜药材中绿原酸的含量≥0.10%, Helicioside A的含量≥0.05% ;优选菝葜药材中绿原酸的含量≥ 0.20%, Helicioside A 的含量≥ 0.10%。
3.根据权利要求2所述的菝葜水溶性成分的含量检测方法，其特征在于，所述的含量检测方法包括如下步骤: 1)色谱条件 以十八烷基键合硅胶为填充剂，以甲醇-酸水、乙腈-酸水或者甲醇-乙腈-酸水混合溶液为流动相；检测波长:绿原酸为325nm，Helicioside A为283nm ;柱温:35°C ;流速:1.0ml.mirT1,绿原酸和Helicioside A对应的保留时间分别为7.3min和13min ； 2)供试品溶液的制备 取菝葜粉末1.5g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入提取溶剂25ml，密塞，称定重量，提取，放冷，称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得； 3)对照品溶液的制备 精密称取绿原酸和Helicioside A各IOmg,分别制成浓度为Img ^mr1对照品溶液储备液，分别吸取两储备液各Iml于同一个IOml量瓶中，加甲醇至刻度，即得绿原酸0.1039mg.mF1 和 Helicioside A0.0980mg.mF1 的混合对照品溶液； 4)测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ l，注入液相色谱仪，测定，即得；菝葜中含绿原酸≥0.10%，含Helicioside A≥0.05% ;优选菝葜中含绿原酸≥0.20%，含Helicioside A≥0.10%。
4.根据权利要求3所述的菝葜水溶性成分的含量检测方法，其特征在于，步骤I)中所述的以十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱为YMC pack ODS-AQ液相色谱柱，优选4.6 X 250mm5 μ m 的 YMC pack ODS-AQ 液相色谱柱。
5.根据权利要求4所述的菝葜水溶性成分的含量检测方法，其特征在于，步骤1)中所述的流动相为体积比11:89的乙腈-水、体积比11:89的乙腈-0.2%磷酸溶液或体积比10:8:82甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液；优选体积比10:8:82的甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液。
6.根据权利要求3所述的菝葜水溶性成分的含量检测方法，其特征在于，步骤2)中所述的提取溶剂为丙酮、乙醇或甲醇。
7.根据权利要求6所述的菝葜水溶性成分的含量检测方法，其特征在于，所述的提取溶剂为甲醇，优选80%甲醇。
8.根据权利要求3所述的菝葜水溶性成分的含量检测方法，其特征在于，步骤2)中所述的提取为超声提取、回流提取或索氏提取。
9.根据权利要求8所述的菝葜水溶性成分的含量检测方法，其特征在于，所述的提取为超声提取，优选超声提取45min，更优选在功率250W、频率40kHz的条件下超声提取45min。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的菝葜水溶性成分的含量检测方法，其特征在于，所述的菝葜药材包括同属不同种的菝葜，具体包括长托菝葜、黑果菝葜、西南菝葜或土茯苓。
【文档编号】G01N30/02GK103901118SQ201210576168
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月26日 优先权日:2012年12月26日
【发明者】邹节明, 周艳林 申请人:桂林三金药业股份有限公司