一种测定颗粒及薄膜表面对水溶性蛋白非特异吸附的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术，设及测定颗粒及薄膜类材料对水溶性蛋白非特异吸附的方 法，尤其W水溶性显色底物的水溶性水解酶为模型测定材料表面非特异吸附的的方法。
【背景技术】
[0002] 颗粒及薄膜类材料有重要的生物医药应用，但该些材料表面非特异吸附应尽可能 低；在制备过程中需快速简便定量测定该些材料表面对水溶性蛋白非特异性吸附，W优化 表面修饰和功能化过程，该就需要简便实用方法测定材料表面对水溶性蛋白的非特异吸 附。
[0003] 此前报道的方法采用标记信号修饰作为测试模型的水溶性蛋白，吸附反应后分离 出待测试材料测定其所携带的标记信号强度表征其非特异吸附。标记过程可能改变所选水 溶性模型蛋白的非特异性吸附性能，而且标记造成额外成本，标记信号的测定仍费时费力。
[0004] 使用未经修饰水溶性蛋白为模型直接测定其在待测试材料表面非特异吸附无疑 更好。该就需要筛选适合的水溶性蛋白模型，并建立对应的简单适用定量方法。使用显色 底物测定水解酶或辣根过氧化物酶的活性可用光度计或微孔板读数器进行测定，所需样品 量很少而成本低。因此，水溶性的水解酶及水溶性好的辣根过氧化物酶是候选模型蛋白的 代表。
[0005] 常用的生物医药材料大多含有金属离子，如磁性颗粒常含有四氧化=铁。该些无 机成分可能显著干扰模型蛋白的酶活性而妨碍测定；辣根过氧化物酶的活性就受到铁离子 等过渡金属离子的显著干扰。多数水解酶对常见金属离子有抗性。所W，用水解酶为模型 测定颗粒及薄膜表面非特异吸附更合适。
[0006] 用水溶性酶蛋白为模型要求所用显色底物有较好水溶性、对应显色产物便于用酶 标仪类微孔板读数器快速高通量测定、成本尽量低。筛选发现非特异磯酸酶、非特异芳香硫 酸醋酶的显色底物满足要求。因此，需要水溶性好的磯酸酶和芳香硫酸醋酶为模型。
[0007] 作为模型蛋白，水溶性水解酶吸附在常见颗粒及薄膜表面后需尽可能保留其活 性，才能保障测定的灵敏度。如非特异吸附在材料表面的水解酶活性升高则测定灵敏度更 高。经过筛选，发现牛小肠粘膜碱性磯酸酶CIAP、截去膜定位肤段的大肠杆菌碱性磯酸酶 ECAP及其突变体R168K、绿脈杆菌芳香硫酸醋酶PAAS、蜗牛芳香硫酸醋酶都适合。
[000引因此，W非特异磯酸酶和非特异硫酸醋酶为模型蛋白测定材料表面非特异吸附。
【发明内容】
[0009] 一种测定颗粒及薄膜表面对水溶性蛋白非特异吸附的方法，其特征在于： (一）W天然或重组表达的水溶性非特异磯酸醋酶、非特异硫酸醋酶为模型蛋白；此 类模型蛋白的代表是牛小肠粘膜碱性磯酸酶、截去膜定位肤段后重组表达的大肠杆菌碱性 磯酸酶、绿脈杆菌芳香硫酸醋酶、蜗牛芳香硫酸醋酶，W及重组表达的该些酶的突变体； (二） 用颗粒或薄膜类待测试材料，在设定吸附条件下与模型蛋白进行吸附反应： (1) 设定吸附条件代表是抑在6. 0到8. 0之间、温度在摄氏4到37度之间；代表性缓 冲液包括哲己基嗽嗦己横酸缓冲液、3-吗咐丙横酸缓冲液、2-(N-吗咐代）己横酸缓冲液； (2)模型蛋白的所选浓度水平据需模拟的条件确定，代表水平在0.05 mg/L到5.0 g/ L之间； (S)分离吸附了模型蛋白的待测试材料，温和洗漆，测定被吸附模型蛋白的酶活性： (1) 用适当的物理方法分离出微纳米颗粒或薄膜；分离磁性颗粒适当的物理方法包括 外部磁力及离屯、，分离密度较大无机及无机-有机复合颗粒适当的物理方法包括离屯、，分 离薄膜适当的物理方法包括机械器械辅助的手工分离方法； (2) 温和洗漆；用吸附反应缓冲液温和洗漆吸附了模型蛋白的颗粒及薄膜； (3) 被吸附模型蛋白的催化反应：测定磯酸醋酶活性所用显色底物代表为对硝基苯基 磯酸醋和4-硝基-1-蒙基磯酸醋、测定硫酸醋酶活性所用显色底物代表为对硝基苯基硫酸 醋和4-硝基-1-蒙基硫酸醋；测定活性所用缓冲液的代表是模型蛋白发挥酶活性的最适缓 冲液，所用显色底物浓度在0. 05到50ml之间，测定温度在摄氏20到37度之间；反应时 间的代表在3. 0到60分钟之间，并根据被吸附模型蛋白的酶活性的高低调整； (4) 终止被吸附模型蛋白的酶反应；如被吸附酶活性很高，在反应设定时间后加入氨 氧化钢类强碱的高浓度溶液，快速混匀将反应体系抑提高到抑12W上终止反应，再用适 当物理方法除去待测试材料；如被吸附酶活性很低，当所设定反应时间长于30分钟时，直 接用适当物理方法分离除去待测试材料而终止反应；如待测试材料在强碱处理后变化而干 扰测定显色产物吸收，用适当物理方法除去待测试材料终止反应；如所用模型蛋白酶活性 最适抑低于抑7. 0且用物理方法终止了酶反应，则再加强碱将抑调节到抑8. 0W上； (5) 用光度计测定吸附酶反应混合物上清液的吸收；显色产物为对硝基苯酪时测定波 长在405nm附近，显色产物为4-硝基-1-蒙酪则测定波长在460nm附近； (四）W吸附反应所用模型蛋白总量对应酶活性为基数，吸附在待测试材料表面的酶 活性活性所占比例为吸附率，表示所测试材料对模型蛋白的非特异吸附性能。
[0010] 应用实施例 所用材料制备、试剂来源 总蛋白浓度用化a壯ord方法测定。每分钟生成1微摩尔显色产物对硝基苯酪的酶量 为一个单位。对硝基苯基磯酸二钢PNPP、对硝基苯基硫酸钢4WS都来自Sigma-al化ich。 大肠杆菌碱性磯酸酶6〔4?的重组表达和纯化见文献[//?^ /&'07 2015; 74: 211-217];所得ECAP比活性约100kU/g。绿脈杆菌芳香硫酸醋酶PAAS编码序列见GI: 879288 ;在N端加SNSNSN连接片段再加細is标签；编码序列委托北京泰和基因全合成，插 入祀T24a表达载体；在大肠杆菌化21 (DE3)中摄氏16度用异丙基-beta-护半乳糖巧诱导 表达18小时，收集细胞，超声裂解离屯、得上清液进Ni"-NTA柱纯化两遍，所得PAAS活性约 36kU/g。
[OCm]ECAP活性测定：含底物缓冲液为1. 0 M二己醇胺-HCl缓冲液，pH10. 0,底物PNPP终浓度10. 0ml,MgCls终浓度2.0ml。测定吸附在磁珠上的磯酸酶活性时，反应体系共加 入含底物的缓冲液0. 20ml;反应指定时间后加入10ul浓度为10. 0M的氨氧化钢溶液终 止反应，快速磁分离去掉磁珠，用Biotek ELX800酶标仪测定吸收。
[001引PAAS活性测定：含底物缓冲液为1. 0M二己醇胺-HC1缓冲液，pH10. 0,底物4NPS 终浓度1. 0ml。测定吸附在磁珠上的PAAS活性时，反应体系共加入含底物的缓冲液0. 20ml;反应指定时间后加入10ul浓度为10.0M的氨氧化钢溶液终止反应，快速磁分离去掉 磁珠，用BiotekELX800酶标仪测定吸收。
[0013] 待测试磁珠；制备两种亚微米磁珠MSP。第一种为用阳G衍生物为单体聚合制 备，详细过程见[估^ 2013，8:791-807]及中国发明专利化201210046309. 5
[授权日期2014-09-24];所得磁珠用MSP-PEG表示。第二种磁珠参照文献[化 公如饼俗1998; 60(4):419-4