用肿瘤坏死因子受体相关因子6筛选抗肿瘤药物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种筛选抗肿瘤药物的方法，特别是设及一种用肿瘤坏死因子受体相 关因子6筛选抗肿瘤药物的方法。
【背景技术】
[0002] Akt(也称作蛋白激酶B，P邸）是一个在进化上高度保守的丝苏氨酸蛋白激酶，在 人癌中经常高度激活。Akt异常激活意味着肿瘤细胞对于调亡诱导的耐受，细胞增殖、生长、 代谢的异常增加。Akt在绝大多数癌症中存在着过度激活的情况，暗示着Akt的激活在肿瘤 发生中的重要角色。关于Akt被活化后是如何被募集到细胞膜上的分子机制，最近，有人报 道了肿瘤坏死因子受体相关因子6 (TRAF6)是一种E3泛素连接酶，可W泛素化修饰Akt,从 而促进Akt转移到细胞膜上，并被激活。
[0003] 肿瘤，特别是恶性肿瘤的产生严重影响人们的健康，甚至危及人的生命，快速的发 现抗肿瘤药物，可W尽可能地减少肿瘤的发生和发展，特别是一些副作用少的抗肿瘤药物， 更是目前亟需的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种用肿瘤坏死因子受体相关因子6筛选抗肿瘤药物的方 法。
[0005] 本发明的技术方案概述如下：
[0006] 用肿瘤坏死因子受体相关因子6 (TRAF6)筛选抗肿瘤药物的方法，包括如下步骤： WSEQIDNO. 1所示的TRAro作为检测祀点的活性口袋，与天然产物数据库或商用小分子 数据库中的小分子，利用AUT0D0CK软件进行活性口袋与小分子的对接，分析对接结果，根 据打分指标预测小分子与活性口袋的亲和力大小，筛选具有潜在抗肿瘤活性的小分子，通 过实验验证小分子的抗肿瘤活性。
[0007] 所述小分子为奎宁、奎宁了或辛可宁。
[000引本发明的优点是：
[0009] 针对在癌症中高表达的激酶，选择令其活化的关键酶，确定药物的作用祀点，快速 筛选出副作用少、抗肿瘤疗效高的小分子抗肿瘤药物。
【附图说明】
[0010] 图1 (A)是（1S)-嗟咐-4-基巧-己締基奎宁-2-基）甲醇（辛可宁）的分子结 构式及其与TRAro的结合位点；炬）是（1时-(6-甲氧基嗟咐-4-基）（（1S，4S，5时-5-己締 基奎宁-2-基）甲醇（奎宁）的分子结构式及其与TRAF6的结合位点；（C)为（S)-化-甲 氧基嗟咐-4-基）（（1S，2R，4S，5时-5-己締基奎宁-2-基）甲醇（奎宁了）的分子结构式 及其与TRAF6的结合位点。
[0011] 图2辛可宁（图中A)、奎宁（图中B)、奎宁了（图中C)对子宫颈癌细胞系化la 细胞的生长抑制作用，加药后（a) 72小时化），（b)96h，用MIT法测定的细胞生长状况。
[0012] 图3辛可宁（图中A)、奎宁（图中B)、奎宁了（图中C)对肺癌细胞系A-549细胞 的生长抑制作用，加药后（a) 7化，（b)96h，用MIT法测定的细胞生长状况。
[0013] 图4培养化la细胞添加不同浓度化合物后4她，用流式细胞仪检测AnnexinV和 PI的表达（a)辛可宁，化）奎宁和（C)奎宁了诱导细胞早期调亡的作用。
[0014] 图5培养A549细胞的Bax/Bcl的表达，（a)加奎宁1化、2化、4她、7化和96h后， 化）（a)图中的条带用ImageJ软件（NationalInstitutesofHealth)半定量测定后，计算 Bax/ 0 -actin和Bel/ 0 -actin的比值用柱状图表示。
[00巧]图6加1. 5Xl(T4mol/L的奎宁分别刺激3、6、12和2化，再加20yg/ml的LPS刺激 化后，Westernblot法测定磯酸化Akt(pAkt)的结果，柱状图是用ImageJ软件Optional InstitutesofHealth)半定量测定pAkt和P-actin的条带（a)为A-549 细胞（b)为 化la细胞
[0016] 图7培养化la细胞加化合物奎宁作用3, 6, 12, 2化后，提取蛋白质用TRAro抗体 进行免疫共沉淀后检测Akt表达，（a)五个条带分别为；1 ;空白对照；2,加奎宁后化；3 ;加 奎宁后化；4 ;加奎宁后12h;5 ;加奎宁2化；化）用ImageJ软件OptionalInstitutesof Health)半定量测定Akt和TRAro的条带，柱状图表示Akt/TRAro的比值。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了使本领域 的技术人员能够实施，但并不对本发明作任何限制。其中的常用试剂的公开了是为了使本 领域的技术人员更好的实施本发明，但并不对本发明作任何限制。
[001引 实施例1
[0019] 用计算机模拟筛选技术，筛选出TRAro相关小分子化合物：
[0020] 蛋白结构信息获取；从RCSB蛋白质数据库中下载TRAro蛋白结构（PDBID;3肥T) 用SEQIDNO. 1所示，W其作为检测祀点的活性口袋；将天然产物数据库或商用小分子数据 库中的小分子，进行对接前的加氨，加电荷等处理；利用AUT0D0CK软件进行活性口袋与小 分子的对接，分析对接结果，根据打分指标预测小分子与活性口袋的亲和力大小，并分析各 种参数的相互关系及对结合能的贡献，筛选具有潜在抗肿瘤活性的小分子奎宁、奎宁了和 辛可宁（图1)。
[002。TRAF6是有523个氨基酸结构的细胞内泛素酶，我们选择TRAF6为作用祀点，首先 用计算机辅助设计找到能够与泛素结合酶结合位点（即TRAro的第50-80,90-110氨基酸） 结合的小分子化合物，合成或购买其中几种化合物后，测试其抗肿瘤活性及作用的分子机 制。
[0022] 用计算机辅助设计找到能够与TRAF6的第50-80,90-110氨基酸的2个W上氨基 酸结合的小分子化合物，建立化合物作用祀点；
[0023] 分别检测几种化合物对不同肿瘤细胞的生长抑制作用，和诱发细胞调亡的作用；
[0024] 实施例2
[00巧]实施例1筛选的化合物奎宁、奎宁了和辛可宁对肿瘤细胞生长的影响：
[0026]培养化la细胞和A-549细胞（购自沈阳万类生物科技有限公司），W4000个/孔 的细胞密度接种到96孔板，培养24小时化）后，分别加入1X1(T6, 5X10^5,1X10^5, 5Xi(T4， 1X1〇-4, 2. 5X1〇-4, 5Xl〇-4mol/L浓度的奎宁、奎宁了或者辛可宁，分别培养4她，72h和96h 后用MIT法测细胞生长状况，其结果总结为图2和图3,图2显示3种化合物都能有浓度依 存性地抑制化la细胞的生长，图3显示3种化合物都能有浓度依存性地抑制A-549细胞的 生长。图中A、B、C各代表辛可宁（A)、奎宁炬）、奎宁了（C)。
[0027]MIT法：每孔加入5mg/ml的MIT溶液20y1，培养箱中解育化后取出，弃去上清， 每孔加150y1二甲基亚讽溶解甲琐沉淀，用酶标仪在490nm下测定吸光度值。
[0028] 图2、3为加入化合物后72和9化的细胞生长结果统计并W柱状图表示，实验结果 表明3种化合物都可W抑制Hela细胞（图2)和A-549细胞（图3)的生长，表明3种化合 物都有抗肿瘤活性。
[002引实施例3
[0030] 早期细胞调亡的检测--流式细胞
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