人肿瘤坏死因子α抗原表位及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：：人肿瘤坏死因子α抗原表位及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及蛋白质工程和分子生物学和免疫学领域，具体而言，本发明涉及新的人肿瘤坏死因子a抗原表位及其制备方法和用途。
背景技术：
：已知肺瘤坏死因子cx(TNF-ot)是一种具有多种生物学活性的细胞因子，主要来源于单核细胞和巨噬细胞，T'淋巴细胞、中性粒细胞、肥大细胞及内皮细胞在一定条件下也能产生[OldL(1985)Science230:630-632]。成熟TNF-ct分子量为17kD,以三聚体形式与细胞表面的TNF-ot受体(TNFR)结合，介导多种生物学活性。正常水平的TNF-a可以参与抵抗细菌、病毒和寄生虫的感染，促进组织修复，引起肿瘤细胞凋亡，但TNF-a在体内的大量产生和释放则会破坏机体的免疫平衡，与其他炎症因子一起产生多种病理损伤，例如恶病质和败血症休克所致的多器官功能衰竭、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、炎症性肠病(IBD)、移植物抗宿主病(GVHD)和骨髓造血紊乱综合症(MDS)等多种疾病(MoellerAetal.(1990)Cytokine2:162-169;Moeller等的美国专利5231024号；VasilliP(1992)A画RevImmunol10:411-452;TraceyKJ,CeramiA(1994)A廳RevMed45:491-503)。为了治疗与肿瘤坏死因子oc(TNF-a)相关的疾病，目前已经研究出多种对其具有中和作用的抗体。目前上市的肿瘤坏死因子单克隆抗体有英夫利西单抗(抗体名Infliximab,商品名Remicade)和阿达木单抗(抗体名Adalimumab，商品名Humira)。这几种抗体药物在美国和欧洲广泛用于治疗类风湿关节炎、强直性脊柱炎、银屑病等。在抗体制备过程中，通常使用抗原分子(免疫原)来致敏动物或者诱发细胞，免疫原可以是完整的抗原分子或者是特征性的抗原表位。已知抗原分子不但含有与免疫识别密切相关的表位结构，同时还含有一些对于保护性免疫不利的结构，如毒性或抑制性表位、病理及自身抗原交叉反应性表位等。因此，天然抗原在引发免疫反应时，由于中和性表位隐匿或非显性表位，引发的免疫反应不强，或所引发的免疫反应发生了免疫偏移(Deviation)，造成T、B细胞间或T细胞亚群间互相残杀从而加重感染等原因，使病原体不能得到有效清除。并且，完整的抗原分子往往是生物大分子，制备、保存困难，所需剂量大，易引起副作用(DerooSetal(2001)CombChemHighThroughputScreen4:75-115)。所以为了获得特异性强、亲和力高且具有中和活性的抗体，需要选择合适的抗原表位。抗原表位(Epitope)，又称为抗原决定簇(Antigenicdeterminant)，是抗原分子上的一个免疫活性区，负责与抗体分子或免疫细胞表面的抗原受体结合。因此，严格说来，抗体的特异性是针对抗原表位而不是针对完整的抗原分子的[周光炎(2000)免疫学原理]。在同一分子的众多表位中，各表位对抗原性的贡献不同，有优势表位和非优势表位之分。此外，就蛋白抗原表位而言，其含有的各个氨基酸残基对抗原性的贡献也不同，抗原的特异性主要由其中几个关键氨基酸残基的组成和顺序决定。以特定的抗原表位甚至是其关键氨基酸残基为靶标制备治疗性抗体和治疗性疫苗，可以增强疗效，减少毒副作用，是目前治疗性抗体的一个发展趋势[PrakkenBJetal(2004)ProcNat1AcadSci101:4228-33.，FockeMetal(2001)FASEBJ15:2042-4〗。随着抗原表位的研究的日益深入，对获得有效的胂瘤坏死因子ot的抗原表位的需要也与日俱增，但是到目前为止还没有有关获得有效的肿瘤坏死因子a的抗原表位的相关报道。鉴于这一现状，申请人进行了多方面研究和探索,通过下述试验策略获得了新的rhTNFa抗原表位，具体而言，申请人用rhTNFct(笫一靶标)免疫动物，制备和纯化得到抗rhTNFcx的多克隆抗体(第二靶标)，然后以线性十二肽库与抗体孵育，经筛选获得了与抗体特异结合的噬菌体克隆。之后通过竟争ELISA确定阳性噬菌体克隆，测定阳性克隆的噬菌体展示肽序列(第三靶标)。通过比对这些结合肽序列，发现其与hTNFcc的4-15位氨基酸序列相似性很高。然后申请人合成了312号肽(笫四乾标，序列为FHLTPSERPVEA，SEQIDNO:4),并将其与KLH偶联免疫动物检测其抗原表位的功能，即是否可以制备得到抗rhTNFoc多抗。结果，通过ELSIA和Western印迹结果表明，制备的抗血清(第四靶标)能够与rhTNF发生交叉免疫反应，提示此多肽为hTNFot的模拟表位，与之相对应的hTNFoc区段可能是一个抗原表位。然后申请人合成了hTNFoc的4-15位氨基酸对应的肽段，将其偶联KLH后免疫动物。ELSIA和Western印迹结果显示，获得的抗血清能够与rhTNFot特异结合，即其具有rhTNFot的抗原表位功能。进一步地，申请人通过ELISA实验，确定所述的TNFa抗原表位YG1不能够被已有的商品化的抗体所识别，是一种新的TNFa抗原表位。通过动物试验，申请人还发现，该抗原表位肽能够延緩类风湿性关节炎动物模型CIA的进程，进而提供了制备抗hTNFa抗体的一个新耙标o申请人并不满足仅仅获得一个单一的抗原表位，而是希望能够在获得的TG1的基础上确定其中关键的氨基酸残基，为制备抗hTNFoc抗体提供更为精确的作用靶点，提高抗体特异性、亲和力，从而降低抗体的使用量、减少副作用。为此申请人通过丙氨酸扫描的方法[WeissG.A.，etal.(2000)ProcNatlAcadSci，16:8950-8954]，进一步提供了一组具有通式(I)所示的氨基酸序列A^AAAsAsAAA^oAuAu(I)其中Ai表示Ser,A2表示Ser，As表示Arg，入4表示Thr，A5表示Pro,A^表示Ser,A表示Asp,7As表示Lys，As表示Pro，A!。表示Val，Au表示Ala，Au表示His，上述通式(I)所示的氨基酸序列未取代或被取代，其中所述取代是指如上定义的A!-Au中的A"A2、A3、A4、A5、A6、A7、As和A12中的一个或者多个任选地被Ala取代。并通过生物学试验就所述抗原表位进行了生物学活性的检测，由此完成了本发明。
发明内容具体地，本发明提供了1.一种人肺瘤坏死因子a的抗原表位，其具有下述通式(I)所示的氨基酸序列A^AsAoAsAsAAAgAmAnAu(I)其中Ai表示氨基酸S，A2表示氨基酸S，A3表示氨基酸R,A4表示氨基酸T，A5表示氨基酸P,Ae表示氨基酸S，A7表示氨基酸D,As表示氨基酸K，A9表示氨基酸P,A^表示氨基酸V，Au表示氨基酸A,Au表示氨基酸H，上述通式(I)所示的氨基酸序列未取代或被取代，其中所述取代是指如上定义的ArAu中的A,、A2、A3、A"A5、A6、A7、A8、A9、A:。和A"中的一个或者多个任选地被氨基酸A取代。2.核苷酸序列，其编码项目1的通式(I)所示的氨基酸序列、且具有SEQIDNo:l所示的核苷酸序列。3.项目1的抗原表位，其中所述取代是指如项目1所定义的A,-Au中的A,、A2、A6、As和Au中的一个或者多个任选地被氨基酸A置换。4.项目l的抗原表位，所述通式(I)是未取代的，其具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列SSRTPSDKPVAH。5.编码项目4的SEQIDNO:2的氨基酸序列的核苷酸序列。6.项目l的抗原表位，所述通式(I)是被取代的，其具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列AARTPADAPVAA。7.编码项目6的SEQIDNO:3的氨基酸序列的核苷酸序列。8.肿瘤坏死因子cc的抗原表位模拟肽，其具有SEQIDNO4:FHLTPSERPVEA。9.多肽，其在肿瘤坏死因子ot的第4-15位是除SEQIDNO:2所示的氨基酸序列SSRTPSDKPVAH以外的、项目1的通式(I)所定义的氨基酸序列。10.核普酸序列，其编码项目9的多肽。11.多肽，其在胂瘤坏死因子a的第6、7、8或者IO位的氨基酸中的一个被氨基酸A置换。12.核苷酸序列，其编码项目ll的多肽。13.—种组合物，其含有项目1、3、4和6的抗原表位，项目8的肿瘤坏死因子a的抗原表位模拟肽，或者项目9和11的多肽。14.项目8的组合物，其中还含有药学上可接受的载体。15.—种组合物，其含有项目2、5、7、10或12的核苷酸序列。16.项目IO的组合物，其中还含有药学上可接受的载体。17.项目1、3、4和6的抗原表位，项目8的肿瘤坏死因子ot的抗原表位模拟肽，或者项目9和11的多肽在制备用于产生抗人肿瘤坏死因子oc的抗体的免疫原中的用途。18.项目1、3、4和6的抗原表位，项目8的肿瘤坏死因子cc的抗原表位模拟肽，或者项目9和11的多肽在制备疫苗中的用途。19.项目1、3、4和6的抗原表位，项目8的肺瘤坏死因子cc的抗原表位模拟肽，或者项目9和11的多肽在制备用于延緩类风湿性关节炎的CIA的进程的药物中的用途。20.项目2、5、7、10或12的核苦酸序列在制备用于产生抗人肺瘤坏死因子oc的抗体的免疫原中的用途。21.项目2、5、7、10或12的核苷酸序列在制备疫苗中的用途。22.项目2、5、7、10或12的核苷酸序列在制备用于延緩类风湿性关节炎的CIA的进程的药物中的用途。图1:表示阳性噬菌体克隆的竟争ELISA结果。图2:表示噬菌体结合肽与hTNFa的序列比对。图3:表示抗312-KLH抗血清与hTNFa交叉免疫反应的BLISA结果。图4:表示抗312-KLH抗血清与hTNFa交叉免疫反应的WesternBolt结果，其中1表示抗hTNFa,2表示抗312-KLH。图5:表示抗YG1-KLH抗血清与hTNFa交叉免疫反应的ELISA结果。图6:表示抗YG1-KLH抗血清与hTNFa交叉免疫反应的WesternBolt结果，其中l表示抗hTNFa，2表示抗YG1-KLH。图7:表示YG1与几种hTNFa抗体反应的ELISA结果。图8:表示YGl-KLH免疫的大鼠产生抗hTNFa抗体的ELISA结果。图9:表示KLH免疫组和YGl-KLH免疫组的大鼠关节炎评分比较。图IO:表示KLH免疫组和YGl-KLH免疫组的大鼠踝关节组织学评分比较。图11:表示阳性噬菌体克隆的竟争ELISA结果。图12:表示噬菌体结合肽与hTNFa的序列比对。图13:表示抗AP-KLH抗血清与hTNFa交叉免疫反应的ELISA结果。10图14:表,示抗AP-KLH抗血清与hTNFa交叉免疫反应的WesternBolt结果，其中1表示抗hTNFa，2表示抗AP-KLH。图15:表示抗YG1-KLH抗血清与hTNFa及其6个突变体结合的ELISA结果。图16:表示hTNFot及突变体T5、T6的细胞毒活性检测。具体实施例方式为了更清楚地阐述本发明，具体提供了下述阐述性的实施方案，本领域的技术人员应该理解，本发明并不仅仅限定于下述实施例，任何与本发明的实施例等同的变体也包括在本发明中。实施例1、噬菌体展示肽库筛选抗rhTNFa的抗体结合肽Ph.D.-12肽库试剂盒购自NEB公司，库容量为2.7x109,滴度为1.5x1013/(il。f"力er/c力hco/2'ER2537为肽库的宿主菌。筛选过程参见噬菌体展示肽库使用说明书。每轮筛选以抗rhTNFoc抗体(每孔10卩g)包被，每孔投入lxl(T噬菌体。噬菌体富集通过抗入/产出比计算。经过三轮筛选，挑取阳性克隆测序。阳性噬菌体克隆与抗rhTNFoc抗体的特异性结合通过ELISA测定。抗rhTNFoc抗体(每孔10ng)包被96孔板(Nunc公司)4。C过夜。倾去不结合的抗体，3%BSA37X:封闭1小时。每孔投入lxl(T噬菌体37。C孵育2小时。洗涤液(PBS-O.05。/。Tween20)洗板5次，共3分钟。抗M13单抗(1:IOOQ稀释，AmershamBiosciences公司)37。C孵育l小时。洗涤方法同上，以TMB(Sigma)为底物检测结合的抗M13单抗，450nm检测光吸收，结果见图1。通过竟争ELISA确定阳性噬菌体克隆，即抗rhTNFoc抗体(每孔lO)ag)包被96孔板(Nunc公司)，加入不同剂量的rhTNFa与lx109噬菌体混合物孵育，抗M13单抗(1:1000稀释，AmershamBiosciences乂〉司)检测结合的嗟菌体，结果见图1。由图l可知，这12个克隆均为阳性克隆。2、rhTNFa抗原表位的获得及其活性验证对挑取的20个噬菌体克隆进行测序，获得了7条阳性克隆的展示肽序列(见表1)。通过比对这些结合肽序列，申请人发现其与hTNFa的4-13位氨基酸序列相似性很高(见图2)。申请人据此合成了312号肽，其具体的氨基酸序列为FHLTPSERPVEA(SEQIDN0:4)，并将其与KLH偶联以制备多抗。ELSIA和Westernblot结果表明，制备的抗血清能够与rhTNF发生交叉免疫反应(见图3、4),提示此多肽为hTNFa的模拟表位，而hTNFa的相应区段(4-15位氨基酸)可能是一个抗原表位。因此申请人合成了hTNFa的第4-15位氨基酸对应的肽段，其氨基酸序列为SSRTPSDKPVAH(SEQIDNO:2)将其偶联KLH后免疫动物。ELSIA和Westernblot结果显示，获得的抗血清能够与rhTNFa特异结合(见图5、6)，表明该区段是一个潜在的抗原表位(命名为YG1)。表l噬菌体展示肽序列测定结果噬菌体克隆序列31RPPADEPLLTSR33EHRWPADNPVPR34RTPAHDPIjEHRF38STPOLPRLSIjSIj39ATPSDLPIAPPY310YTPRDSP工ASSQ312314VSRTPSEHTVQP3.YG1是一个新的hTNFot抗原表位通过ELISA检测抗原表位YG1是否能与商品化的抗体结合。分别包被合成的抗原表位肽(SEQIDNO:)和rhTNFa(5jag/孔)，再分别加入三种商品化的抗hTNFa单克隆抗体(infliximab,adalimumab和Z12)和抗rhTNFa的多克隆抗体(2ng/孔)孵育。ELISA结果显示，该抗原表位肽不能与这些商品化的抗体结合(见图7)。因而，申请人认为YG1是新的抗原表位。4.YG1延緩类风湿性关节炎动物模型CIA的进程的验证申请人用胶原诱发的关节炎(CIA)研究YG1的生物学功能。其原理是类风湿性关节炎(RA)是一种慢性炎性疾病，特征为多关节炎伴随进行性关节损伤和机能障碍。在患者发炎的滑膜尤其是软骨与血管翳结合处TNF-oc高水平表达。事实上，英夫利西(Infliximab,人鼠嵌合型的抗hTNFoc单抗)与依那西普(可溶性TNF受体-Fc融合蛋白)均已在临床上用于RA治疗。胶原诱发的关节炎(CIA)是多关节炎实验模型，其许多组织病理学特征与RA相似。申请人采用此动物模型研究获得的抗原表位的功能。按照文献方法，以bovineCII(Sigma公司)免疫7周龄Lewis大鼠。将A组、B组分别用bovineCII(Sigma>&司)免疫两次，C组作为对照。CII以终浓度4mg/ml溶于0.1M乙酸，与等体积与完全弗氏混合，第0、7天皮内注射尾巴末梢。每只大鼠注射150jal(含300ngofCII)。关节炎的发生和严重程度通过体重减轻和爪子肿胀程度、红斑和关节变形进行评估。关节损伤的评分标准为0-4，0分为无改变，1分为肿胀和趾上出现红斑，2分为轻微肿胀和肢体上红斑，3分为明显肺胀和肢体上红斑，4分为明显变形和肢体运动障碍。每只大鼠的关节评分为各爪的评分相加，最高为16分。将大鼠分为三组，分别用KLH偶联的YG1或KLH预先免疫两次。ELISA结果显示，YG1能够诱导大鼠产生特异性的抗hTNFa抗血清(见图8)。第一次免疫后12至14天，A组和B组的16只大鼠均出现了关节肿胀，发病率为100%。预先用YG1免疫的大鼠关节炎评分明显低于预先用KLH免疫的大鼠(见图9)。C组大鼠未出体重减轻和皮肤病损。实验结束时，切去后爪固定于10%中性緩沖液配制的福尔马林溶液48小时，10%(w/v)EDTA-2Na脱钙至骨易弯曲。组织在梯度浓度酒精中胶脱水，石蜡包埋，4nim切割，苏木精和伊红染色。显微镜下观察炎症程度和软骨和骨的破坏，评分标准为0分为滑膜正常，1分为滑膜肿胀和炎症细胞浸润，2分为血管翳和软骨侵蚀，3分为大多数软骨和软骨下骨侵蚀，4分为关节不完整和僵硬。预先用YG1免疫的大鼠踝关节组织学评分也明显低于预先用KLH免疫的大鼠(见图10)。这些结果表明，通过抗原表位YG1免疫动物能够延緩CIA的进程。5.构建丙氨酸扫描肽库并应用该肽库确定抗原表位YG1中的关键氨基酸残基丙氨酸扫描肽库是基于噬菌体展示肽库技术进行的高通量、快速的丙氨酸扫描方法，即由丙氨酸残基替代目标序列中的各个氨基酸残基，由此验证所述氨基酸的在所述序列中的作用[WeissG.A.,etal.(2000)ProcNatlAcadSci，16:8950-8954]。具体地，申请人利用载体M13KEgffl进行用于丙氨酸扫描的肽库构建，Ph.D.PeptideDisplayCloningSystem购自NEB/>司。合成了一条寡核苷酸链5，-CATGTTTCGGCCGAAKSAGCARCAGSCKYAKCAGMAGSAGYCSYAGMAGMAGAGTGAGAATAGAAAGGTACCCGGG-3，(SEQIDNO:以IUB编码表示，即K=G/T，M-A/C，N=A/C/G/T，R=A/G，S-G/C，W=A/T,Y=C/T))，其中含有编码hTNFa(4-15)(具体氨基酸序列为SSRTPSDKPVAHSEQIDNO:1)或丙氨酸突变的序列(见表2)。表2:丙氨酸扫描肽库中的展示肽密码子天然序列中的丙氨酸扫描对丙氨酸扫描对应氨基酸残基应的密码子的氨基酸sKCTA/SsKCTA/SRRSGA/G/T/RTRCTA/TPSCTA/PSKCTA/SDGMTA/DK墜A/E/T/KPSCTA/PVGYTA/VAGCTAHSMTA/D/P/H14将该DM片段与延伸引物退火，进而用DM聚合酶，Klenow大片段延伸成双链。Acc65I和EagI双酶切该双链DNA，得到约60bp大小的片段，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，洗脱緩沖液(0.5MNH4AC，10mMMg(AC)2，和lmMEDTA)洗脱，并通过乙醇沉淀纯化、浓缩。Acc65I和Eagl双酶切的M13KE载体与纯化的DNA片段连接，连接产物转化ER2537感受态细胞，共转化10次，转化后的混合物接种于200ml对数早期的LB培养基中培养4.5h。噬菌体的纯化参见产品说明书。随机挑取20个原始转化子测序鉴定。通过生物淘洗和竟争ELISA，获得了抗hTNFa抗体特异性的结合肽(见图11)。然后进行测序，并将获得的序列和建库的模板序列进行比对，发现其中的7个氨基酸残基为关键残基，即XXRTPXDXPVAX，其中X为任意氨基酸(见图12)。因此设计合成了多肽AP(具体序列为AARTPADAPVAA，SEQIDNO:3)，其含有7个关键残基，其它位置上的氨基酸残基均由丙氨酸残基取代，将多肽AP与KLH偶联，免疫小鼠以制备多抗。ELSIA和Westernblot结果显示，获得的抗血清能够与rhTNFa特异结合(见图13、14)，说明这些关键的氨基酸残基足以诱导机体产生抗hTNFa的抗体。因为所述的抗原肽均是小肽，为了验证这些小肽在完整hTNFa上是否还能表现出抗原肽的作用，申请人对位于完整hTNFa上的、与YG1相对应的肽区域进行了选择性的点突变。表3:hTNF-a及6个突变体的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>突变的位点详见表3，并人工设计了用于hTNFa点突变的引物(表4),通过PCR扩增含有突变位点的基因片段，并将这些片段分别克隆到表达栽体pET28a(购自Novagen^^司)，表达纯化了6个突变体蛋白(T1-T6)。表4:hTNF-oc及6个突变体的引物引物序列(5'-3，)野生型正向引物R-A:CGT-GCTTl正向引物R-A:CGT-GCTT2正向引物T-A:ACT-GCTT3正向引物P-A:CCG-GCGT4正向引物D-A:GAC-GCCT5正向引物P-A:CCT-GCTT6正向引物V-A:GTA-GCA反向引物GGGAATTCCATATGGTACGTTCTTCTTCTCGTACTCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAG(SEQIDNO:5)GGGAATTCCATATGGTACGTTCTTCTTCTgcTACTCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAG(SEQIDNO:6)GGGAATTCCATATGGTACGTTCTTCTTCTCGTgCTCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAG(SEQIDNO:7)GGGAATTCCATATGGTACGTTCTTCTTCTCGTACT^GAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAG(SEQIDNO:8)GGGAATTCCATATGGTACGTTCTTCTTCTCGTACTCCGAGTGcCAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAG(SEQIDNO:9)GGGAATTCCATATGGTACGTTCTTCTTCTCGTACTCCGAGTGACAAG^TGTAGCCCATGTTGTAG(SEQIDNO:10)GGGAATTCCATATGGTACGTTCTTCTTCTCGTACTCCGAGTGACAA11)12)GCCTGcAGCCCATGTTGTAG(SEQIDNO:CCGCTCGAGTCACAGGGCAATGATCCCAA(SEQIDNO:注小写字母为突变位点，下划线对应的为酶切位点对6个突变体进行生物学功能验证，6个突变体与抗YG1-KLH抗血清的ELISA结合实验表明(见图15)，T5和T6不能与该抗血清反应，提示Pro"和Val"可能为抗原表位YG1中最重要的氨基酸残基。6.通过TNFa的细胞毒活性对突变体T5和T6的生物学活性进行鉴定。将L929细胞100(il以每孔4xl(T个细胞的密度接种于96孔板(Costar公司)，于含10。/。胎牛血清(Hyclone公司)的DMEM完全培养基(Gibco公司)16不同浓度，将稀释后的蛋白20nl与5|il放线菌素D(25pg/ml)加入细胞板中，37X:、5%C02条件下培养18-24小时。细胞存活率通过标准的MTT法测定，595nm测定光吸收，以计算存活细胞的百分比。结果突变体T5和T6的细胞毒活性明显减弱(见图16)，表明这两个突变体突变的氨基酸残基Pro"和Val"可能为表位YG中最重要的氨基酸残基，其对于TNF-a发挥生物活性起着重要作用。综上可知，本申请的系列肽以SEQIDNo:2为基础，除了第3、4、5、8、9、IO位氨基酸以外，即使任选地替换为丙氨酸，也不影响其作为TNF-a抗原表位的功能，而且体外生物学活性试验也证明了这一点，由此，本申请提供了如式(I)所示的抗原表位。序列表〈110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所<120〉人肿瘤坏死因子a抗原表位及其制备方法和用途<130>IDC080040<160>12<170>Patentlnversion3.2<210〉1<211〉76<212〉腿<213〉人工序列，K:G/T，M=A/C，N=A/C/G/T，R=A/G,S=G/C，W=A/T,Y=C/T<400>1catgtttcggccgaaksagcarcagsckyakcagmagsagycsyagraagmagagtgagaa60tagaaaggtacccggg76<210>2<211>12<212〉PRT<213>人工序列，YGl,TNFa3—15位氨基酸〈400〉2SerSerArgThrProSerAspLysProValAlaHis1510<210〉3<211>12<212>PRT〈213〉人工序列，多肽AP〈400〉3AlaAlaArgThrProAlaAspAlaProValAlaAla1510<210>4<211>12<212>PRT<213〉人工序列，312号肽<400〉'4PheHisLeuThrProSerGluArgProValGluAla1510〈210〉5<211>66<212>DNA<213〉引物<400>5gggaattccatatggtacgttcttcttctcgtactccgagtgacaagcctgtagcccatg60ttgtag66<210>6<211>66<212>DNA<213〉引物<400>6gggaattccatatggtacgttcttcttctgctactccgagtgacaagcctgtagcccatg60ttgtag66<210>7<211>66<212〉DNA<213〉引物<400>7gggaattccatatggtacgttcttcttctcgtgctccgagtgacaagcctgtagcccatg60ttgtag66〈210〉8<211>66<212〉DNA19<213>引物<400>8gggaattccatatggtacgttcttcttctcgtactgcgagtgacaagcctgtagcccatg60ttgtag66<210〉9<211>66<212〉DNA<213〉引物<400>9gggaattccatatggtacgttcttcttctcgtactccgagtgccaagcctgtagcccatg60ttgtag66<210〉10<211>66<212〉DNA<213>引物<400>10gggaattccatatggtacgttcttcttctcgtactccgagtgacaaggctgtagcccatg60ttgtag66<210>11<211>66<212〉DNA<213〉引物〈400〉11gggaattccatatggtacgttcttcttctcgtactccgagtgacaagcctgcagcccatg60ttgtag66'<210〉12<211〉29<212>DNA<213>引物20<400>12ccgctcgagtcacagggcaatgatcccaa29权利要求1.一种人肿瘤坏死因子α的抗原表位，其具有下述通式(I)所示的氨基酸序列A1A2A3A4A5A6A7A8A9A10A11A12(I)其中A1表示氨基酸S，A2表示氨基酸S，A3表示氨基酸R，A4表示氨基酸T，A5表示氨基酸P，A6表示氨基酸S，A7表示氨基酸D，A8表示氨基酸K，A9表示氨基酸P，A10表示氨基酸V，A11表示氨基酸A，A12表示氨基酸H，上述通式(I)所示的氨基酸序列未取代或被取代，其中所述取代是指如上定义的A1-A12中的A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A12中的一个或者多个任选地被氨基酸A取代。2.核苷酸序列，其编码权利要求1的通式(I)所示的氨基酸序列、且具有SEQIDNo:l所示的核苷酸序列。3.权利要求1的抗原表位，其中所述取代是指如权利要求1所定义的A!-Au中的A,、A2、A6、As和A12中的一个或者多个任选地被氨基酸A置换。4.权利要求1的抗原表位，所述通式(I)是未取代的，其具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列SSRTPSDKPVAH。5.编码权利要求4的SEQIDNO:3的氨基酸序列的核苷酸序列。6.权利要求1的抗原表位，所述通式(I)是被取代的，其具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列AARTPADAPVAA。7.编码权利要求6的SEQIDNO:4的氨基酸序列的核苷酸序列。8.肿瘤坏死因子ot的抗原表位模拟肽，其具有SEQIDNO5:FHLTPSERPVEA。9.多肽，其在肿瘤坏死因子oc的第4-15位是除SEQIDNO:2所示的氨基酸序列SSRTPSDKPVAH以外的、权利要求1的通式(I)所定义的氨基酸序列。10.核苷酸序列，其编码权利要求9的多肽。11.多肽，其在肿瘤坏死因子oc的第6、7、8或者IO位的氨基酸中的一个被氨基酸A置换。12.核苷酸序列，其编码权利要求11的多肽。13.—种组合物，其含有权利要求l、3、4和6的抗原表位，权利要求8的肿瘤坏死因子ct的抗原表位模拟肽，或者权利要求9和11的多肽。14.权利要求8的组合物，其中还含有药学上可接受的载体。15.—种组合物，其含有权利要求2、5、7、10或12的核苷酸序列。16.权利要求10的组合物，其中还含有药学上可接受的载体。17.权利要求l、3、4和6的抗原表位、权利要求8的肺瘤坏死因子ct的抗原表位模拟肽或者权利要求9和11的多肽在制备用于产生抗人肺瘤坏死因子a的抗体的免疫原中的用途。18.权利要求1、3、4和6的抗原表位、权利要求8的胂瘤坏死因子a的抗原表位模拟肽或者权利要求9和11的多肽在制备疫苗中的用途。19.权利要求l、3、4和6的抗原表位、权利要求8的肺瘤坏死因子oc的抗原表位模拟肽或者权利要求9和11的多肽在制备用于延緩类风湿性关节炎的CIA的进程的药物中的用途。20.权利要求2、5、7、10或12的核苷酸序列在制备用于产生抗人肿瘤坏死因子oc的抗体的免疫原中的用途。21.权利要求2、5、7、10或12的核苷酸序列在制备疫苗中的用途。22.权利要求2、5、7、10或12的核苷酸序列在制备用于延緩类风湿性关节炎的CIA的进程的药物中的用途。全文摘要本发明涉及分子生物学和免疫学领域，具体地，本发明提供了人肿瘤坏死因子α的抗原表位，其具有通式(I)所示的氨基酸序列A₁A₂A₃A₄A₅A₆A₇A₈A₉A₁₀A₁₁A₁₂其中，A₁、A₂、A₆表示氨基酸S；A₅、A₉表示氨基酸P；A₃、A₄、A₇、A₈、A₁₀、A₁₁、A₁₂分别表示氨基酸R、T、D、K、V、A、H；通式(I)所示的氨基酸序列未取代或被取代，所述取代是指如上定义的A₁-A₁₂中的A₁、A₂、A₃、A₄、A₅、A₆、A₇、A₈、A₉、A₁₀和A₁₂中的一个或者多个任选地被氨基酸A取代；本发明还提供了所述抗原表位的制备方法和用途。文档编号C07K7/00GK101654475SQ200810147190公开日2010年2月24日申请日期2008年8月22日优先权日2008年8月22日发明者玉刘,光杨,沈倍奋,洁董,邵宁生,高亚萍申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所