专利名称：一种可诱发机体抗肿瘤免疫的异种抗原-Fc融合蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可诱发机体抗肿瘤免疫的异种抗原一Fc融合蛋白及其应用。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，占女性恶性肿瘤的18%，全世界每年约 有120万妇女患乳腺癌，50万人死于乳腺癌。在西欧、北美等发达国家，乳腺癌发 病率占女性恶性肿瘤的首位。亚洲是乳腺癌的低发区，但是近年来，我国乳腺癌的 发病率正在呈逐年上升的趋势，从1999年的十万分之十七增加到2003年的十万分 之五十二，上升三倍。手术、化疗和放疗是乳腺癌的常规治疗手段，随着医疗水平 的不断迸步，原发性肿瘤的治疗技术，尤其是早期诊断患者的外科治疗效果得到了 明显提高。但对晚期患者则难以奏效，且大多数肿瘤患者就诊时己处于晚期，其疗 效大大受限，特别是当肿瘤发生远处器官转移或多发转移时，常规治疗不能达到肿 瘤局部及全身的控制。肿瘤的主动免疫治疗以激发或增强机体的免疫功能为手段， 选择性地针对肿瘤细胞，特异性地发挥杀伤作用而不影响正常细胞的生存，进而达 到控制和杀伤肿瘤细胞的目的。
原癌基因Her2(又称ErbB2或Her2/neu)是表皮生长因子受体家族成员之一，位 于人染色体17q21，是由1255个氨基酸组成的蛋白质，分子量为185kDa。前653 个氨基酸为胞外区，富含半胱氮酸和2个配体结合域；第654 675位氨基酸为穿 膜区，起锚定作用；第676 1255位氨基酸为胞内区，具有内在酪氨酸激酶活性， 含有自身酪氨酸磷酸化位点。Her2在25X 30X的乳腺癌中过表达，在正常组织 中低表达，是与乳腺癌侵袭、转移及预后密切相关的肿瘤相关抗原之一 (Swiatoniowski G， Dabrowska M, Klaniewski T, et al. Erb-2 overexpression in breast cancer. Ginekol Pol, 2003， 74(4):332-338.)，己成为良好的肿瘤免疫生物治疗的耙分 子。临床前期研究发现，Her2高表达可促进乳腺癌细胞的转移潜能(Petit T， Borel C, Ghnassia JP, et al Chemotherapy response of breast cancer depends on HER-2 status and anthracycline dose intensity in the neoadjuvant setting [J]. Clin Cancer Res, 2001, 7(6):1577-1581.)，且与肿瘤细胞的化疗及激素治疗的耐药有关。Salmon等报道， Her2基因过表达的乳腺癌患者平均生存时间为3年，而Her2阴性患者为6 7年(Slamon DJ， Clark GM， Wong SG, et al. Human breast cancer correlation of relapse and survival with amplication of the HER-2/neu oncogene [J]. Science, 1987, 235(4785):177-182.)。目前已有大量证据显示，Her2过表达是预测乳腺癌预后的重 要指标。免疫组化染色发现，乳腺癌细胞的Her2蛋白水平比正常乳腺上皮高10 100倍。Her2高表达可抑制细胞凋亡，促进肿瘤细胞存活及肿瘤新生血管的生成等， Her2过度表达的肿瘤细胞对化疗不敏感。有报告显示乳腺癌患者唾液中Her2含量 较正常人高10倍以上，有望用于早期乳腺癌的筛选性诊断。Tutsi等对698例原发 性乳腺癌患者进行了持续54个月的追踪随访发现，无论是淋巴结阴性还是阳性组， 单因素或多因素分析均显示Her2基因的过表达是主要的预后指标(Tsutsui S， Ohno S， Murakami S, et al. Prognostic value of c-erbB-2 expression in breast and ovarian cancer[J].J Surq Oncol， 2002, 79(4):216-23.)。
Her2属自身蛋白，机体免疫系统对于过表达的自身蛋白往往处于耐受状态。因 此，如何打破机体对肿瘤抗原的免疫耐受、诱发有效的抗肿瘤免疫反应，是肿瘤免 疫治疗取得突破的关键。研究表明，同源异种抗原可诱发增强对相应自身抗原的免 疫应答。Disis等证实，用全长大鼠neu蛋白免疫大鼠时，不能诱导抗大鼠neu蛋白 的免疫应答，但是，用与neu蛋白有高度同源的Her2胞内段蛋白免疫大鼠，则可 导致大鼠产生较强的抗Her2及neu的细胞及体液免疫应答(Disis ML, Shiota FM， Cheever MA. Human HER-2/neu protein immunization circumvents tolerance to rat neu: a vaccine strategy for self tumor antigens [J]. Immunology, 1998, 93(2): 192-199.)。 因 此，利用异种抗原大鼠neu蛋白亦有可能打破机体对Her2的免疫耐受，产生抗Her2 的免疫应答。
人IgGlFc段可结合于FcYlII受体(FcYIIIR,CD16)，该受体存在于单核细胞、 树突状细胞、NK细胞及巨噬细胞膜表面，IgGl Fc与Fc7RIII结合后可介导抗体依赖 细胞介导的细胞毒(ADCC)，诱导细胞因子、趋化因子及炎症因子的释放。Fc受 体不但可有效地介导抗原抗体复合物内化，提高MHC-II类途径的抗原递呈效率，而 且Fc受体介导的抗原摄取还可通过MHC-I类途径交叉递呈(Albert ML, Sauter B, Bhardwaj N. Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells and induce class I-restricted CTLs. Nature 1998; 392:86—9. Ravetch JV. Fc receptors: rubor redux. Cell 1994; 78:553—60. Regnault A, Lankar D, Lacabanne V " a/. Fey receptor-mediated induction of dendritic cell maturation and major histocompatibility complex class
4I-restricted antigen presentation after immune complex internalization. J Exp Med 1999; 189:371-80.)。研究表明，FcYR介导的抗原摄取效率比吞噬及吞饮强100 1000倍， 可有效促进抗原的递呈(Akiyama K, Ebihara S, Yada A, " a/. Targeting Apoptotic Tumor Cells to FcR Provides Efficient and Versatile Vaccination Against Tumors by Dendritic Cells. J Immunol, 2003， 170(4): 1641-1648. You ZY, Huang XF， Hester J, " a/. Induction of vigorous helper and cytotoxic T cell as well as B cell responses by DCs expressing a modified antigen targeting receptor-mediated internalization pathway. J Immunol, 2000, 165:4581-4592.)。
佐剂可决定免疫反应的类型，增强抗原的刺激作用。粒细胞-巨噬细胞集落剌激 因子(Granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)可激活抗原提呈细 胞、参与T细胞的活化、诱导特异性CTL的产生、提高抗原递呈细胞(antigen-presenting cell, APC)的递呈效率，是细胞免疫的重要增强因子(Lefrance F, Cool V, Velu T, "a/. Granulocyte macrophage colony stimulating factor gene transfer to induce a protective antitumoral immune response against the 9L rat gliosarcoma model [J]. Int J Oncol, 2002, 20(5):1077-1085.)，其在基因疫苗、分子疫苗及肿瘤疫苗等各类疫苗中的免疫佐剂 作用已被广泛石开究(Disis ML, Bernhard H， Shiota FM, " /. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; an effective adjuvant for protein and peptide-based vaccines [J]. Blood, 1996， 88(1):202-210.) 。GM-CSF可促进多种炎细胞如淋巴细胞、巨噬细胞、 中性粒细胞及浆细胞等参与抗肿瘤免疫反应。Dranoff将GM-CSF作为黑色素瘤疫苗 的免疫佐剂，发现GM-CSF相对于其它细胞因子佐剂可产生更持久、更有效的免疫 促进作用(Dranoff G. GM-CSF-secreting melanoma vaccines [J] . Oncogene, 2003， 22 (20) : 3188-3192.)。卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin， BCG)是最早应用于肿瘤生 物治疗的制剂，也是最强的免疫佐剂之一。作为结核分支杆菌的减毒活疫苗，具有 很强的非特异性免疫刺激作用，能活化巨噬细胞、T细胞等免疫细胞，诱导产生 IFN-Y和IL-12等Thl型细胞因子，介导以细胞免疫为主的免疫应答(Lammd L, Thor DE， Harris SC, W a/. Bacillus Calmette-Guerin immunotherapy of superficial bladder cancer[ J]. JUrol, 1980, 124:38-40.)。 BCG在临床上已成功地应用于表浅型膀胱癌的 膀胱内注射治疗，在预防膀胱肿瘤复发和治疗残存癌、原位癌中已经取得了肯定疗 效(O，Donnell MA， DeWolf DC. Bacillus Calmette-Gu6rin immunotherapy for superficial bladder cancer. New prospects for an old war horse. Surg Oncol Clin N Am,
51995,4:189-202.)。 ？干扰素(IFN-y )是重要的免疫调节因子，主要由活化的T细胞 和NK细胞产生。IFN-Y能促进多种细胞表面表达MHC-I类和II类分子，促进ThO细胞 分化为Thl细胞，激活巨噬细胞、DC和NK细胞等，在诱导Thl类免疫反应中起着主导 作用。IFN-Y参与控制肿瘤的生长及转移，在肿瘤免疫监视过程中发挥重要的作用 (Doherty GM, Alexander HR, Merino MJ， Venzon DJ, Norton JA. Role of endogenous interferon gamma in murine tumor growth and tumor necrosis factor alpha antitumor efficacy. Ann Surg Oncol 1996; 3:198—203. Street SE, Cretney E， Smyth MJ. Perforin and interferon-gamma activities independently control tumor initiation, growth and metastasis. Blood 2001; 97:192-7.)。在肿瘤基因治疗研究中显示，IFN-y可提高肿瘤 的免疫原性(Kaplan DH， Shankaran V， Dighe AS Demonstration of an interferon gamma-dependent tumor surveillance system in immunocompetent mice. Proc Nat Acad Sci 1998;95:7556-61.)。
单核细胞来源于骨髓起源的CD34+细胞。它们进入组织并最终分化为组织中的 驻留型巨噬细胞，包括肝脏的Kupffer细胞、肺泡中的巨噬细胞和骨髓中的破骨细 胞。免疫系统中，巨噬细胞可同时发挥正、负向的调节作用(Gordons. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol 2003; 3:23—35. Stout RD, Suttles J. T cell signaling of macrophage function in inflammatory disease. Front Biosci 1997; 2:dl97-d206.): —方面，它们可通过释放细胞毒性分子可对肿瘤细胞产生直接的 杀伤(Olikowsky T, Wang ZQ， Dudhane A W a/. Two distinct pathways of human macrophage differentiation are mediated by interferon-^ and interleukin-10. Immunol 1997; 91:96—112. Lopez M, Bony V， Martinache C a/. Tumoricidal potential of human macrophages grown Wfro from blood monocytes. J Exp Ther Oncol 1996; 1:143-54.)，或通过递呈抗原和产生白介素-12 (IL-12)刺激淋巴细胞应答(Verreck FA, de Boer T, Langenberg DM. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco) bacteria. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101:4560-5.);另一方面，肿瘤细胞通过释放高水平的抑制因 子来破坏免疫系统的平衡，导致巨噬细胞抗肿瘤功能的下调(ElgertKD， AllevaDG, Mullins DW. Tumor-induced immune dysfunction: the macrophage connection. J Leukoc Biol 1998; 64:275—90. Mantovani A, Sica A, Sozzani S a/. The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization. Trends Immunol
62004;25(12):677-86.)。研究发现，肿瘤组织中的巨噬细胞可抑制T细胞和NK细 胞的抗月中瘤活性(Kono K, Salazar-Onfray F, Petersson Ma/. Hydrogen peroxide secreted by tumor-derived macrophages down-modulates signal-transducing zeta molecules and inhibits tumor-specific T cell- and natural killer cell-mediated cytotoxicity. Eur J Immunol 1996;26:1308-13.)。
免疫系统由相互作用的多种细胞组成。来源于免疫系统的激活信号和抑制信号 以及周围细胞的代谢物之间复杂的相互作用调节局部免疫反应的范围和强度。不同 类型细胞之间广泛的相互作用和调节决定免疫应答的结果。
发明内容
本发明的目的是提供一种可诱发机体抗肿瘤免疫的异种抗原一Fc融合蛋白。
本发明所提供的融合蛋白是如下l)或2)的蛋白质
1) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2) 将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过-一个或几个氨基酸残基的取代和/
或缺失和/或添加且具有抗肿瘤活性的由1)衍生的蛋白质。
序列表中序列2自氨基末端第1 - 121位为neu的L2结构域，第122-241位为 neu的S2结构域，第242 - 464位为人IgGl Fc区。
上述融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。 所述融合蛋白编码基因的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示。 含有上述融合蛋白编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本 发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种治疗肿瘤的疫苗。 所述肿瘤具体可为高表达Her2的乳腺癌。 本发明所提供的疫苗的活性成分是上述融合蛋白。 所述疫苗中还可以含有如下l)或2)的佐剂
1) GM-CSF和BCG;
2) IFN-y禾口 BCG。
实验证明，本发明的融合蛋白对乳腺癌细胞具有较好的抑制效果，加入上述l) 或2)的佐剂后，抑制效果明显提高，所述融合蛋白和上述l)或2)的佐剂可以以 任一配比混合。
当然，所述疫苗中也可以只含有所述融合蛋白、佐剂GM-CSF和BCG或只含有
7融合蛋白、佐剂IFN-y和BCG。
具体的说，本发明是将大鼠neu L2-S2功能域的编码序列与人IgG Fc区编码序 列融合，构建真核表达载体；在CHO细胞中获得稳定表达，应用rProtein A Sepharose Fast Flow亲和层析纯化neu-Fc融合蛋白，应用SDS-PAGE和Western blot鉴定重 组蛋白；Ficoll密度梯度离心法分离人PBMC， MTT法检测融合蛋白对PBMC的促 增殖作用；通过ELISA法检测PBMC产生的IL-12和IL-10水平的变化；应用流式 细胞分析检测单核细胞表型的变化；LDH法检测PBMC在佐剂协同异种抗原刺激 下对靶细胞的杀伤作用；pcDNA3.0/Her2转染小鼠乳腺癌细胞EMT6，获得一株高 表达Her2的EMT6/Her2细胞株；利用该细胞株构建裸鼠移植瘤模型，观察佐剂和 融合蛋白联合应用对肿瘤生长的影响；对肿瘤组织作HE染色及组织学分析。
结果表明，neu-Fc是分子量约为66 kDa的蛋白；PBMC经MCF-7细胞上清诱 导后，IL-12水平降低，IL-10水平显著升高；10 nM neu-Fc对PBMC具有显著的促 增殖作用；neu-Fc与佐剂联合作用可显著促进PBMC中IL-12的表达并下调IL-10 的表达；佐剂协同融合蛋白作用下，单核细胞表面MHCII类分子表达上调；佐剂 协同融合蛋白刺激可导致PBMC对肿瘤细胞的杀伤活性显著增强；建立的 EMT6/Her2细胞中，Her2的表达率为99.59%;动物实验中，佐剂协同融合蛋白对 肿瘤生长有明显的抑制作用；肿瘤组织HE染色组织学分析观察到，佐剂协同融合 蛋白治疗组的肿瘤组织内和包膜周围有大量淋巴细胞及中性粒细胞浸润，肿瘤细胞 广泛坏死，而对照组肿瘤无明显包膜，肿瘤细胞生长活跃，无炎细胞浸润。结果表 明，佐剂辅助融合蛋白可诱导有效的抗肿瘤免疫反应。
图1为neu-Fc蛋白的SDS-PAGE检测结果
图2为neu-Fc对PBMC具有明显的促增殖作用
图3为MCF-7细胞上清诱导后PBMC分泌IL-12和IL-10的变化
图4为neu-Fc、 GM-CSF和BCG联合应用对PBMC分泌IL-12和IL-10表达的影
响
图5为neu-Fc、 IFN- y和BCG联合应用对PBMC分泌IL-12和IL-10表达的影
响
图6为FACS分析单核细胞表型
图7为neu-Fc， IFN- y和BCG诱导的PBMC体外抗肿瘤活性
8图8为构建的细胞株EMT6/Her2表达Her2的情况
图9为neu-Fc、 IFN- y和BCG联合应用裸鼠体内抑瘤活性观察
图10为neu-Fc、 IFN-y和BCG联合应用裸鼠体内抑瘤活性观察、肿瘤的组织
学观察及体内毒性评价
具体实施例方式
人淋巴细胞分离液(相对密度为1.077)购自天津TBD生物技术发展公司，特级 胎牛血清购于北京元亨圣马生物技术研究所，无酚红RPMI-1640购于Hyclone公司， DMEM购于GIBCO公司，HRP-羊抗鼠抗体购自中杉公司，抗Her2抗体(Ab20)购于 Neomarkers公司，重组人GM-CSF (hGM-CSF)及IFN-y均购于ProSpec-Tany TechnoGene公司，BCG购于北京生物制品研究所，IL-12和IL-10 ELISA检测试剂 盒购于北京达克为生物技术有限公司，增强型ECL试剂盒购于北京普利莱基因技 术有限公司。
实施例1、融合蛋白neu-Fc联合GM-CSF和BCG的免疫调节效应 1、 neu-Fc的构建、表达及纯化
大鼠neu的胞外区包括Ll、 Sl、 L2和S2四个结构域。根据大鼠neu胞外区的 L2和S2结构域设计引物5'-tgccatggtccgagtgtgctatggtctg-3，禾口
5，-agtttagcggccgcgtgggtgcagttgatggg-3，， PCR扩增大鼠neu胞外区的L2和S2结构域 的编码序列(上游引物位于大鼠neu胞外区的L2结构域，下游引物位于大鼠neu 胞外区的S2结构域)。
提取健康人离体的外周血单个核细胞的总RNA，利用RT-PCR方法扩增出人 1gGl Fc段的cDNA。将人IgGl Fc段的cDNA经7VM和屈ol双酶切后插入到经同 样酶切的载体pCI-neo (购自Promega公司)中，得到重组表达载体pCI-neo/Fc。
将上述大鼠neu胞外区的L2和S2结构域的PCR扩增产物用五coi I和Wort双 酶切后与经同样酶切的重组表达载体pCI-neo/Fc相连接，使大鼠neu的L2和S2结 构域融合于人IgGlFc段的N端，将得到的重组表达载体命名为pCI/neu-Fc。将 pCI/neu-Fc进行测序，结果表明，大鼠neu的L2和S2结构域的编码序列已经和人 IgGl Fc段的编码序列正确相连接，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示， 将其编码的融合蛋白命名为neu-Fc，该融合蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所 示。
将重组表达载体pCI/neu-Fc转染二氢叶酸还原酶缺陷型的CHO细胞，转染48
9小时后，细胞在含有10X透析血清的DMEM培养基和甲氨喋呤中筛选，获得稳定 高表达融合蛋白neu-Fc的克隆。培养该细胞克隆，收获上清，应用rProteinA Sepharose Fast Flow亲和层析纯化表达上清，获得高纯度的融合蛋白neu-Fc。对融 合蛋白neu-Fc进行N端序列测定，结果表明，neu-Fc N末端的15个氨基酸残基和 序列表中序列4的自N末端的第1-15位氨基酸残基相同。
2、 neu-Fc蛋白的鉴定
将上述步骤1获得的neu-Fc蛋白经SDS-PAGE测定其分子量，结果如图1所 示。其中，M为蛋白质分子量标准，1为neu-Fc的SDS-PAGE电泳结果，2为neu-Fc 的Western blot结果。结果表明，neu-Fc的分子量为约66 kDa。由于neu与Her2 的同源性较高，可利用抗人Her2抗体(Ab20)(购于Neomarkers公司)对上述步骤 1获得的neu-Fc蛋白进行Western blot分析。结果表明，抗人Her2抗体可识别neu-Fc 融合蛋白，阳性反应条带的位置与上述步骤1纯化得到的neu-Fc蛋白在SDS-PAGE 中的位置一致。
3、 MTT法测定neu-Fc促进外周血单个核细胞(PBMC)增殖的作用
1) PBMC的分离与培养
采用Ficoll法分离人PBMC，将分离自健康人的新鲜离体白膜层细胞约30ml分别 加入到两个50ml的培养瓶中，再分别加入等体积的无酚红RPMI-1640培养液稀释。 将稀释好的白膜层细胞沿管壁缓慢滴加在淋巴细胞分离液液面上，每管滴加5 ml， 使白膜层与淋巴细胞分离液的体积比为l:l， 2000rpm离心30分钟。离心后可以看到 试管内液面分为4层。自上而下依次为黄色血浆层、白色薄膜层(PBMC层)、无 色透明的分离液层和红细胞层。
将上述PBMC层吸至另一50 ml培养瓶中，加入等体积的无酚红RPMI-1640培养 液稀释，800rpm离心10分钟。离心后试管底部有乳白色沉淀出现，用手指将沉淀轻 轻弹散开，加入无酚红RPMI-1640培养液吹悬细胞，800 rpm离心10分钟洗涤细胞3 次，离心后的上清液透亮，停止洗漆。将细胞沉淀用含20%胎牛血清的无酚红 RPMI-1640培养液重悬并计数。
2) MTT法测定neu-Fc促增殖作用
调整上述步骤l)获得的PBMC的密度为2X10Vml，加入96孔细胞培养板中， 每孔IOO ^d。用含20X血清的无酚红RPMI-1640培养液将上述步骤l获得的neu-Fc蛋 白稀释为2 nM、 10 nM和50 nM，并加入到培养有PBMC的细胞培养板中，每孔IOO pl。
10同时以不加neu-Fc蛋白作为对照。每个浓度设3个重复孔。37"培养箱中孵育96小时 后，每孔吸出IIO pl培养液，然后加入IO pl 5 mg/ml的MTT溶液。继续培养4 6小时， 2000rpm离心10分钟，弃上清。每孔中加入IOO ^d酸化SDS，充分混匀，37。C培养过 夜，酶联仪上测定A57o值，结果如图2所示。结果表明，2nM和10nM的neu-Fc均具 有显著的促细胞增殖作用(P<0.05) ， 10nMneu-Fc的促增殖作用最强。
4、 MCF-7细胞培养上清抑制PBMC分泌IL-12及刺激IL-10的分泌
用含20%血清的无酚红RPMI-1640培养液将PBMC的密度调为2X 106/ml，加 入96孔细胞培养板中，每孔100nl，然后加入MCF-7细胞培养上清100 pl。对照 孔中不加MCF-7细胞培养上清，补充RPMI-1640 100 pl，每个处理设3个重复孔。 培养48-72小时后，进行细胞因子检测，结果如图3所示。图中，表示P< 0.05， 表示P<0.01。结果表明，PBMC与MCF-7细胞培养上清共孵育后，
Thl型细胞因子IL-12水平明显降低(P<0.05) ，Th2型细胞因子IL-10水平显著升 高(P<0.01)，表明MCF-7细胞培养上清中存在可导致PBMC处于免疫抑制状态 的物质。
5、 neu-Fc、 GM-CSF和BCG联合作用对细胞因子分泌的影响
用含20%血清的无酚红RPMI-1640培养液将PBMC的密度调为2X 106/ml，加 入96孔细胞培养板中，每孔100pl。实验组加入MCF-7细胞培养上清100 pl，培 养48-72小时后，吸去培养液，并分为如下四个处理1、补充RPMI-1640 100 pl
(对照组)；2、加入含终浓度为10 nMneu-Fc的无酚红RPMI-1640培养基100 3、加入含终浓度为20 ng/ml GM-CSF、 300吗/ml BCG的无酚红RPMI-1640培养基 100 pl ; 4、加入含终浓度为20 ng/ml GM-CSF、 300 (ig/ml BCG和10 nM neu-Fc的 无酚红RPMI-1640培养基100 pl。
每个处理设3个重复孔。72小时后2000 rpm离心10分钟，吸出上清，按照ELISA 检测试剂盒的要求检测上清中的细胞因子，统计学分析采用SPSS 10.0统计软件， 所有数据采用X土SD表示，组间比较采用one sample-ANOVA法分析，以P<0.05 表示有统计学意义，结果如图4所示。其中，黑色柱子表示加入融合蛋白neu-Fc， 白色柱子表示未加融合蛋白neu-Fc。
结果表明，neu-Fc单独作用于PBMC时，IL-12分泌水平略有升高，而IL-10分泌 水平明显受到抑制(P<0.01);当同时用GM-CSF、 BCG和neu-Fc处理PBMC时， IL-12的水平升高则更为显著(P〈0.01)，而IL-10水平进一步降低(P<0.05)。表明，
11neu-Fc促增殖的细胞群体主要为Thl型细胞，GM-CSF、 BCG和neu-Fc的联合应用能 强有力地诱导PBMC向Thl型应答转换。
实施例2、异种蛋白neu-Fc联合IFN- Y和BCG的免疫调节效应
1、 neu-Fc、 IFN-Y和BCG联合作用对细胞因子分泌的影响
用含20%血清的无酚红RPMI-1640培养液将PBMC的密度调为2X 106/ml，加 入96孔细胞培养板中，每孔100 ^。实验组加入MCF-7细胞培养上清100 pl，培 养48-72小时后，吸去培养液，并分为如下几个处理1、补充RPMI-1640 100 2、加入含终浓度为10 nM neu-Fc的无酚红RPMI-1640培养基100 3、加入含终 浓度为40U/ml IFN- y的无酚红RPMI-1640培养基100 pi; 4、加入含终浓度为40U/ml IFN- Y和10 nM neu-Fc的无酚红RPMI-1640培养基100 5、加入含终浓度为300 |ig/ml BCG的无酚红RPMI-1640培养基100 pi; 6、加入含终浓度为300 |ig/ml BCG 和10 nM neu-Fc的无酚红RPMI-1640培养基100 (il; 7、加入含终浓度为40U/ml IFN-Y 、 300昭/ml BCG的无酚红RPMI-1640培养基100 ^ ; 8、加入含终浓度为40U/ml IFN- Y 、 300 (ig/ml BCG和10 nM neu-Fc的无酚红RPMI-1640培养基100 (il。对照 组不加MCF-7细胞培养上清，分别补充RPMI-1640 100^1或含10 nM neu-Fc的 RPMI-1640培养基100 pl。每个处理设3个重复孔。72小时后2000 rpm离心10分 钟，吸出上清，按照ELISA检测试剂盒的要求检测上清中的细胞因子，统计学分析 采用SPSS 10.0统计软件，所有数据采用X±SD表示，组间比较采用one sample-ANOVA法分析，以P<0.05表示有统计学意义，结果如图5所示。其中， 黑色柱子表示加入融合蛋白neu-Fc，白色柱子表示未加融合蛋白neu-Fc。
结果表明，neu-Fc单独作用可导致细胞分泌IL-12水平显著增高，IL-10的分 泌受抑制；IFN- Y单独作用不能逆转MCF-7细胞上清对Thl细胞的抑制作用；但是， 当与neu-Fc共同作用时，IL-12的水平升高及IL-10的水平明显降低，与neu-Fc 单独作用相比具有统计学意义(P〈0.01)。 BCG与IFN- Y联合作用能显著上调IL-12 的水平，与两者单独作用相比作用明显增强；而当BCG、 IFN-Y和neu-Fc共同作 用时，IL-12的分泌水平进一步提高；BCG单独作用可显著抑制IL-10的分泌，而 与IFN- y联合应用并未能进一步下调IL-10的水平。
2、 neu-Fc和BCG、 IFN-Y联合诱导逆转单核细胞表型
单核细胞是体外诱导DC的来源，单核细胞在体外通过内皮细胞迁移或在体内 吞噬抗原后亦可分化为DC。按照文献报道的方法(TangCB，InmanMD，RooijenNV
12e/ a/. Th Type 1-Stimulating Activity of Lung Macrophages Inhibits Th2-Mediated Allergic Airway Inflammation by an IFN个Dependent Mechanism. J Immunol 2001; 166:1471-81.)，利用单核细胞的黏附特性分离单核细胞，具体方法如下
按照上述实施例1步骤3的方法，将分离的PBMC培养于50 ml细胞培养瓶中， 在含20y。胎牛血清的无酚红RPMI 1640培养液中培养。2小时后，在倒置显微镜下 观察，可见部分细胞己贴壁，此时将上清吸去，并用无酚红的RPMI 1640培养液清 洗贴壁细胞，此贴壁细胞即为单核细胞。
将单核细胞培养于含20%血清的无酚红RPMI-1640培养液中，加入MCF-7细 胞培养上清100 pl。培养24-48小时后，加入含终浓度为40 U/ml IFN-Y 、 10 nM neu-Fc和300吗/ml BCG的无酚红RPMI-1640培养基，同时以未用MCF-7细胞培 养上清作用及未加刺激物的细胞分别作为对照。培养48-72小时后，6000rpm离心 30秒收集细胞，用FACS洗液(PBS+2%BSA或2X胎牛血清+0.1。/。NaN3)洗涤3 次。然后分别加入抗-CDllb-PE抗体、抗-CD14-FITC抗体、抗-CD80-FITC抗体、 抗-CD86-PE抗体和抗-MHC-DR-PE抗体(以上抗体均购于Ebioscience公司)，冰 浴、避光轻摇20-40分钟。6 000rpm离心30秒后，弃上清，再洗涤3次。最后一 次离心后，弃上清，用1%的多聚甲醛固定，流式细胞仪分析单核细胞表型。
单核细胞膜表面CD14和CDllb的表达如图6所示。其中，A为单核细胞CD14 的表达，B为单核细胞CDllb的表达。从图中可以看出，单核细胞的CDllb阳性率 约为96%， CD14的阳性率约为90%。
在MCF-7细胞上清的诱导下，单核细胞表面HLA-DR、 CD80和CD86分子的表达 显著下调。BCG、 IFN-Y和neu-Fc联合作用刺激48小时后，单核细胞表面HLA— DR的表达由50%提高至75%， CD80的表达由39%提高至47%， CD86的表达由44 %提高至64% ，具体结果如表1所示。结果表明，单核细胞在BCG、IFN- Y和neu-Fc 联合作用下被活化。
表l单核细胞共刺激分子和MHC n类分子的表达
CD80CD86HLA-DR
对照组75.63%±5.92%62.6%±10.14%91.99%±6.14%
MCF-7细胞培养上清38.60%±9.28%44.17%±13.46%50.00%±24.53%
neu-Fc+IFN-Y+BCG47.05%±4.61%64.28%±1.92%75.210/0±3.40%
13杀伤实验(LDH法)
为了观察neu-Fc、 IFN-Y和BCG是否可促进效应细胞(PBMC)对Her2过表 达肿瘤细胞的抑制活性，构建了 MCF-7/Her2细胞，并分析了 4种不同的乳腺癌细 胞(T47D、 MCF-7、 MCF-7/Her2和SKBR3细胞)表面MHC-II类分子的表达水平，具
体的实验过程如下
1) MCF-7/Her2细胞的构建
提取人乳腺癌细胞SKBR3的总RNA，利用RT-PCR方法扩增出Her2的cDNA。 将扩增得到的Her2的cDNA插入到真核表达载体pcDNA3 (购自Invitrogen公司) 的///"dl1和A7wl位点间，将得到的重组质粒命名为pcDNA3/Her2。
用pcDNA3/Her2质粒转染MCF-7细胞，800吗/ml G418 (Sigma)加压筛选 10天后，获得稳定表达Her2的MCF-7细胞。经过有限稀释法获得高表达Her2的细 胞克隆，将其命名为MCF-7/Her2。 MCF-7/Her2细胞在含200吗/ml G418的培养液 中维持。
MCF-7/Her2细胞、MCF-7细胞和T47D细胞表达Her2的情况如图7A所示。其 中，虚线表示T47D细胞表达Her2的情况，细的实线表示MCF-7细胞表达Her2的 情况，粗的实线表示MCF-7/Her2细胞表达Her2的情况。
2) 效应细胞的处理
用含20。/。胎牛血清的无酚红RPMI 1640培养液将上述实施例1分离的PBMC 细胞浓度调整至lX106/ml，分为4组1、阴性对照；2、加入neu-Fc; 3、加入IFN-y和BCG; 4、加入neu-Fc、 IFN-Y禾BBCG。 neu-Fc的终浓度为10 nM， IFN-Y的终 浓度为40 U/ml， BCG的终浓度为300吗/ml，作用96小时。
3) 靶细胞的处理
T47D、 MCF-7、 MCF-7/Her2禾n SKBR3是4种表达不同水平Her2和低水平 MHC-II的人类乳腺癌细胞系(T47D、 MCF-7和SKBR3均购自美国ADCC) 。 4种 细胞经过2000 U/ml的IFN- Y作用96小时后，应用FACS检测细胞表面細C-DR的 表达。结果如图7B和图7C所示。其中，图7B为IFN-Y作用前T47D、 MCF-7、 MCF-7/Her2和SKBR3细胞表面MHC-DR的表达情况，图7C为IFN- Y作用后T47D、 MCF-7、 MCF-7/Her2和SKBR3细胞表面MHODR的表达情况。
结果表明，IFN-y处理可使T47D、 MCF-7、 MCF-7/Her2三种细胞表面MHC-DR 的表达明显上调，而SKBR3无明显变化，因此选择T47D、 MCF-7和MCF-7/Her2
14作为杀伤实验中的靶细胞。
用2000 U/ml的IFN- Y分别作用于T47D、 MCF-7和MCF-7/Her2细胞96小时
后，将细胞分别用胰酶消化成单细胞悬液，800rpm离心5分钟，细胞洗涤两次后计 数，调整细胞密度为4X107ml，铺于96孔板中，每孔IOO pl。 4)效靶作用
收集上述步骤2)的效应细胞，用无酚红RPMI 1640洗两次并计数，调整细胞 密度为8X 105/ml，每孔100 pl。当上述步骤3)的靶细胞贴壁后，用无酚红的RPMI 1640培养液将耙细胞洗两次，然后将效应细胞加入培养有靶细胞的培养板中，使效 应细胞和耙细胞的数量比分别为20: 1和10: 1。同时以仅含效应细胞和仅含靶细 胞的孔作为对照，每种处理设三个重复孔。37。C培养3-4小时后，250g离心3分钟， 从每孔中吸出50pl上清液至另一96孔板中。采用细胞毒性检测试剂盒，按说明书 中的步骤首先配制反应试剂，然后将其加入到上述96孔板中，每孔50pl，室温避 光反应10 30分钟，测OD舰值。结果如图7D和图7E所示。其中，图7D为效应细 胞和靶细胞的数量比为20: 1时的测定结果，图7E为效应细胞和靶细胞的数量比 为10: 1时的测定结果。在仅含靶细胞的3个孔中加入1% (体积百分含量)的 Triton(曲拉通，用PBS稀释)10pl，作为最大靶细胞释放孔。
结果表明，neu-Fc、 IFN-Y和BCG联合作用刺激效应细胞对高表达Her2的细胞可 产生最有效的杀伤，与neu-Fc或BCG + IFN-Y刺激的效果相比，具有明显的差异 (P<aW)。且效应细胞对MCF-7/Her2细胞的杀伤率较T47D细胞和MCF-7细胞更高，提 示效应细胞对肿瘤细胞的杀伤依赖于细胞表面Her分子的密度。
实施例3、动物实验
1、 EMT6/Her2细胞的构建
用pcDNA3/Her2质粒转染来源于Balb/C鼠的小鼠乳腺癌细胞EMT6 (购自美国 ADCC),在800吗/mlG418压力下筛选表达Her2的EMT6细胞，经两次有限稀释法 及加压筛选，获得稳定表达Her2的EMT6细胞克隆，将其命名为EMT6/Her2。同 时以未转染pcDNA3/Her2质粒的EMT6细胞作为对照。采用抗Her2抗体(Ab20)购于 Neomarkers公司及FACS检测EMT6/Her2细胞表达Her2的情况，FACS检测结果 如图8所示。其中，图8A为对照组EMT6细胞的FACS检测结果，图8B为EMT6/Her2 细胞的FACS检测结果。结果表明，近100%的EMT6/Her2细胞表达Her2分子。
2、 动物实验
151) 注射抗原剂量的确定
EMT6/Her2细胞用无抗生素和血清的RPMI-1640培养液稀释成4X 106/ml，于 右侧腋下皮下注射4一6周龄的雌性Balb/C小鼠，每只小鼠注射0.1ml。注射后第 6天，可见小鼠注射部位有肿瘤生长，随机将小鼠分为4组，分别为对照组、佐剂 组、高剂量抗原加佐剂组和低剂量抗原加佐剂组，每组6只小鼠。其中，抗原为上 述实施例1获得的neu-Fc融合蛋白，高剂量组抗原用量为每只小鼠20吗，低剂量 组抗原用量为每只小鼠10 佐剂为IFN- Y (每只小鼠2000 U)和BCG (每只小 鼠0.5 mg)。
将上述成瘤小鼠尾静脉注射抗原及肿瘤周围皮下注射佐剂，对照组尾静脉和肿 瘤周围皮下均注射与实验组等体积的无抗生素和血清的RPMI-1640培养液；佐剂组 尾静脉注射无抗生素和血清的RPMI-1640培养液，肿瘤周围皮下注射佐剂；高剂量 和低剂量抗原加佐剂组尾静脉注射不同剂量的抗原，肿瘤周围皮下注射佐剂。每周 给药一次，共给药两次。每3天用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长径和短径，计算小鼠 肿瘤的体积(体积二长径X短径2《0.5)。注射EMT6/Her2细胞3周后，将小鼠断 颈处死，称量小鼠体重，将肿瘤剥出，称量肿瘤的重量。结果如图9所示。
结果表明，neu-Fc、 IFN-y和BCG联合作用可抑制肿瘤的生长，高剂量的neu-Fc 并未诱导更高的抗肿瘤活性，提示产生的保护性免疫应答不具有剂量依赖性特征。 根据该实验结果，下面的实验中采用10pg的抗原剂量。
2) 动物实验
EMT6/Her2细胞用无抗生素和血清的RPMI-1640培养液稀释成4 X 106/ml，于 右侧腋下皮下注射4一6周龄的雌性Balb/C小鼠，每只小鼠注射0.1ml。注射后的 第6天，可见小鼠注射部位有肿瘤生长，随机将小鼠分为4组，分别为对照组、佐 剂组、抗原组和抗原加佐剂组，每组6只小鼠。其中，抗原为上述实施例l获得的 neu-Fc蛋白，抗原的剂量为每只小鼠10吗，佐剂用量同第一批动物实验。注射方 法同上，每周给药一次，共给药四次。每3天用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长径和短 径，计算小鼠肿瘤的体积(体积二长径X短径2《0.5)。注射EMT6/Her2细胞30 天后，将小鼠断颈处死，称量小鼠体重，将肿瘤剥出，称量肿瘤的重量，并按组别 排列照相。肿瘤组织随后固定于10%中性福尔马林(Na2HP(X 12H20，3.28g; NaH2P04 *2H20，0. 9g;甲醛，24ral;加水至200ml)中，石蜡包埋，HE染色，显微镜 下观察照相。结果如图10所示。其中，图IOA为不同组别小鼠肿瘤体积的测定结
16果，图IOB为不同组别小鼠肿瘤重量的测定结果，图IOC为不同组别小鼠肿瘤的照片。
从图10A和10B可以看出，对照组肿瘤生长迅速，neu-Fc组和IFN- y +BCG 组均产生一定的抑瘤作用，而neu-Fc、 IFN-y和BCG联合应用则可更有效地抑制 肿瘤生长。图IOC中，肉眼观察可见，neu-Fc、 IFN-y和BCG联合应用组的肿瘤 血管形成减少，肿瘤组织苍白，而其它各组肿瘤表面可见明显的血管形成。组织学 观察发现，对照组小鼠肿瘤组织由大量低分化的细胞构成，肿瘤呈实性、无腺管样 结构，镜下易见核分裂象。neu-Fc、 IFN，和BCG联合治疗组肿瘤组织有纤维囊膜 包裹，包膜下可见大量细胞坏死，瘤组织内外有大量的中性粒细胞及淋巴细胞浸润， 如图IOG所示；而对照组肿瘤则无炎细胞浸润现象，如图10D -图IOF所示。对 小鼠体重的观察结果可知，治疗未引起明显的毒副作用，结果如图IOH和图IOI所 示。此外，小鼠的肝、肾和肺等脏器未见病理改变。
17序列表
〈160〉 2
<210> 1 〈211〉 1395 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈400〉 1
ggctgcaaga已gatctttgg gagcctggca tttttgccgg agagctttga tggggacccc 60
tcctccggca ttgctccgct gaggcctgag cagctccaag tgttcgaaac cctggaggag 120
atcacagg"U acctgtacat ctcagcatgg ccagacagtc tccgtgacct cagtgtcttc 180
cagaaccttc gaatcattcg gggacggatt ctccacgatg gcgcgtact:c attgacactg 240
c卿gcctgg ggatccactc gctggggctg cgctcactgc gggagctggg cagtggattg 300
gctctgattc accgcaacgc ccatctctgc tttgtacaca ctgtaccttg ggaccagctc 360
ttccggaacc cacatcaggc cctgctccac agtgggaacc ggccggaaga ggattgtggt 420
ctcgagggct tggtctgtaa ctcactgtgt gcccacgggc actgctgggg gccagggccc 480
acccagtgtg tcaactgcag tcatttcctt cggggccagg agtgtgtgga ggagtgccga 540
gtatggaagg ggctcccccg ggagtatgtg agtgacsagc gctgtctgcc gtgtcacccc 600
gagtgtcagc ctc肌犯cag ctcagagacc tgctttggat cggaggctga tcagtgtgca 660
gcctgcgccc actacaagga ctcgtcctcc tgtgtggctc gctgccccag tggtgtgaaa 720
ccgacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 780
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 840
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtx 960
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1140
agcctgacc"t gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200
aatgggcagc cggagaac船ctacaagacc acgcctcccg tgctggactx cgacggcccc 1260
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctxtccctg 1380
tctccgggta aataa 1395
〈210〉 2
18<211〉 464 <212> PRT 〈213〉 人工序列
〈400〉 2
Gly Cys Lys Lys lie Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe 15 10 15
Asp Gly Asp Pro Ser Ser Gly lie Ala Pro Leu Arg Pro Glu Gin Leu 20 25 30
Gin Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu lie Thr Gly Tyr Leu Tyr lie Ser 35 40 45
Ala Trp Pro Asp Ser Leu Arg Asp Leu Ser Val Phe Gin Asn Leu Arg 50 55 60
lie lie Arg Gly Arg lie Leu His Asp Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu 65 70 75 80
Gin Gly Leu Gly lie His Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu 85 90 95
Gly Ser Gly Leu Ala Leu lie His Arg Asn Ala His Leu Cys Phe Val
19100 105 110
His Thr Val Pro Trp Asp Gin Leu Phe Arg Asn Pro His Gin Ala Leu 115 120 125
Leu His Ser Gly Asn Arg Pro Glu Glu Asp Cys Gly Leu Glu Gly Leu 130 135 140
Val Cys Asn Ser Leu Cys Ala His Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro 145 150 155 160
Thr Gin Cys Val Asn Cys Ser His Phe Leu Arg Gly Gin Glu Cys Val 165 170 175
Glu Glu Cys Arg Val Trp Lys Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Ser Asp 180 185 190
Lys Arg Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gin Pro Gin Asn Ser Ser 195 200 205
Glu Thr Cys Phe Gly Ser Glu Ala Asp Gin Cys Ala Ala Cys Ala His 210 215 220
20Tyr Lys Asp Ser Ser Ser Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys 225 230 235 240
Pro Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 245 250 255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met工le Ser Arg 260 265 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 275 280 285
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 290 295 300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 305 310 315 320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 325 330 335
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr
21340 345 350
lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 355 360 365
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys 370 375 380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser 385 390 395 400
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 405 410 415
Ser Asp Gly Pro Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 420 425 430
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 435 440 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460
2
权利要求
1、一种融合蛋白是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗肿瘤活性的由1)衍生的蛋白质。
2、 权利要求l所述融合蛋白的编码基因。
3、 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示。
4、 含有权利要求2或3所述融合蛋白编码基因的重组表达载体、转基因细胞 系或重组菌。
5、 一种预防和/或治疗肿瘤的疫苗，它的活性成分是权利要求1所述的融合蛋白。
6、 根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于所述肿瘤为乳腺癌。
7、 根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于所述疫苗中还含有佐剂，所述佐剂为GM-CSF和BCG。
8、 根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于所述疫苗中还含有佐剂，所述 佐剂为IFN-y和BCG。
全文摘要
本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的融合蛋白。该融合蛋白是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗肿瘤相关的由1)衍生的蛋白质。以该融合蛋白为活性成分并加入佐剂GM-CSF和BCG或IFN-γ和BCG制成的疫苗对肿瘤生长有明显的抑制作用，肿瘤HE染色切片中可以观察到，肿瘤组织内和包膜周围有大量炎性细胞浸润，证明佐剂辅助融合蛋白可诱导有效的抗肿瘤免疫反应。
文档编号C07K19/00GK101638440SQ20081014714
公开日2010年2月3日 申请日期2008年8月20日 优先权日2008年7月29日
发明者明 施, 解志刚, 宁 郭 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所