抗肿瘤免疫治疗纳米给药系统及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及药物递送系统，具体涉及一种抗肿瘤免疫治疗纳 米给药系统及其构建方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤免疫治疗是继手术治疗、药物治疗、放射治疗之后的一种新的肿瘤治疗手段， 在预防肿瘤复发、转移、治疗肿瘤病灶等方面具有其独特的优势。世界上首个肿瘤治疗性疫 苗，即表皮生长因子（EGF)肿瘤治疗性疫苗，已于2008年6月上市。该疫苗可以有效延长 晚期肺癌患者的生存期，副反应很轻，且在停药后自动消失，也未发生自身免疫反应症状。 可见，肿瘤治疗性疫苗在抗肿瘤治疗具有明显的优势。现有抗肿瘤免疫治疗的研究主要集 中在提高机体抗肿瘤免疫应答或者阻止肿瘤免疫逃逸，而肿瘤免疫响应是一个相当复杂机 制，单纯一方面的考虑是难以达到抗肿瘤治疗的目的。
[0003] 未成熟树突状细胞（Dendriticcells，DC)具有抗原递呈作用，它通过对肿瘤抗原 或相关质粒DNA内吞，加工处理，形成成熟树突状细胞。有研究表明，抗肿瘤疫苗的免疫效 应在体内中不甚理想的主要原因是质粒DNA或多肽在进入细胞核内前就被大量的降解，且 肿瘤患者的DC对抗原捕获和DNA的摄取能力较低，这也是为何现有许多抗肿瘤DNA或多肽 疫苗无法真正进入临床的主要原因之一。随着纳米技术的不断发展，已有微球、脂质体、纳 米粒、囊泡等纳米给药载体包裹DNA、多肽疫苗进行免疫研究的报道，纳米给药系统能增加 DC对DNA或多肽的摄取率，且纳米给药载体本身可以作为佐剂诱导增加T细胞反应而增强 免疫效应。
[0004] DC细胞膜表面分布三种受体：Fc受体、DEC-205受体、甘露糖受体（MMR)，且DC细 胞膜的表面带负电荷，表面带正电荷的纳米给药载体可增加DC对DNA的摄取率和保护作 用。通过药剂学及化学合成手段，纳米载体材料上引入甘露糖配体，通过甘露糖受体的介 导，将DNA疫苗或多肽疫苗纳米粒直接靶向于DC，增加了DC对DNA疫苗或多肽的细胞摄取。
[0005] 在肿瘤微环境中存在有许多抑制性的免疫细胞，其中调节性T细胞（RegμLatory TLymphoeyte，Treg)在肿瘤微环境中的比例高，是肿瘤微环境参与构建免疫抑制性重要因 素。研究表明阻断Treg增殖、或消除肿瘤部位的Treg能增强抗肿瘤免疫效果。现有研究 表明，化学治疗和免疫治疗的结合可以弥补各自治疗过程中的不足，同时可以增加抗肿瘤 效果。已报道少量的紫杉醇能消除Treg从而逆转肿瘤免疫逃逸，并促进DC成熟。
[0006] 综上所述，研制理想的新型给药系统以提高树突状细胞对DNA疫苗或抗原的摄取 率，防止DNA或多肽在进入细胞核内前被大量的降解，增加DNA疫苗或多肽进入树突状细胞 的量，是目前疫苗研究中迫切需要攻克的课题之一。因此，为达到理想的抗肿瘤免疫治疗效 果，有必要提供一种既能增加荷瘤机体抗肿瘤免疫应答，且能抑制或逆转肿瘤免疫逃逸的 综合免疫给药系统。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述现有抗肿瘤DNA或多肽疫苗在体内效应不佳的技术问题，本发明提 供一种既能增加荷瘤机体抗肿瘤免疫应答，且能抑制或逆转肿瘤免疫逃逸的抗肿瘤免疫治 疗纳米给药系统及其构建方法，并具有制备方法简捷，靶向效率高的优点。
[0008] 本发明提供一种抗肿瘤免疫治疗纳米给药系统，其特征在于，包括紫杉醇/阴离 子环糊精-DNA/甘露糖修饰三甲基壳聚糖纳米复合物，由紫杉醇、阴离子环糊精、DNA和甘 露糖修饰三甲基壳聚糖组成，其中，
[0009] 所述紫杉醇与所述阴离子环糊精以摩尔比1:1比例包合而成紫杉醇/阴离子环糊 精包合物；
[0010] 所述DNA与所述甘露糖修饰三甲基壳聚糖通过正负电荷吸附形成DNA/甘露糖修 饰三甲基壳聚糖纳米复合物；
[0011] 所述DNA与所述甘露糖修饰三甲基壳聚糖质量比为1:10~40 ;
[0012] 所述紫杉醇与所述DNA质量比为1:0. 25~4。
[0013] 在本发明提供的抗肿瘤免疫治疗纳米给药系统的一种较佳实施例中，所述紫杉 醇/阴离子环糊精-DNA/甘露糖修饰三甲基壳聚糖纳米复合物的纳米粒粒径为70nm~ 200nm，电位值为0~+45mV。
[0014] 在本发明提供的抗肿瘤免疫治疗纳米给药系统的一种较佳实施例中，所述紫杉 醇/阴离子环糊精-DNA/甘露糖修饰三甲基壳聚糖纳米复合物的纳米粒粒径的平均值为 148. 7±5. 9nm，电位值的平均值为 +22. 72± 1. 75mV。
[0015] 在本发明提供的抗肿瘤免疫治疗纳米给药系统的一种较佳实施例中，所述DNA为 pEGFP-Trp2-GM-CSF-Fc质粒，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0016] 在本发明提供的抗肿瘤免疫治疗纳米给药系统的一种较佳实施例中，所述紫杉醇 /阴离子环糊精-DNA/甘露糖修饰三甲基壳聚糖纳米复合物是所述紫杉醇/阴离子环糊精 包合物与所述DNA/甘露糖修饰三甲基壳聚糖纳米复合物通过形成离子交联结合而成。
[0017] 在本发明提供的抗肿瘤免疫治疗纳米给药系统的一种较佳实施例中，所述紫杉醇 /阴离子环糊精-DNA/甘露糖修饰三甲基壳聚糖纳米复合物的靶向基团为树突状细胞细胞 膜表面的甘露糖受体。
[0018] 本发明提供一种抗肿瘤免疫治疗纳米给药系统的构建方法，包括以下步骤：
[0019] 步骤一、将紫杉醇按至少1:1摩尔比，加入到0· 25~0· 75mg·mL1阴离子环糊精 中，常温下进行超声包合，再离心处理，最后经微孔滤膜过滤，得到紫杉醇/阴离子环糊精 包合物；
[0020] 步骤二、将DNA按1:10~40质量比，加入到0. 05~0. 25mg·mL1甘露糖修饰三 甲基壳聚糖中，进行漩涡电荷吸附，得到DNA/甘露糖修饰三甲基壳聚糖纳米复合物；
[0021] 步骤三、将步骤一制备的紫杉醇/阴离子环糊精包合物加入到步骤二制备的DNA/ 甘露糖修饰三甲基壳聚糖纳米复合物中，再次进行漩涡交联混合，得到紫杉醇/阴离子环 糊精-DNA/甘露糖修饰三甲基壳聚糖纳米复合物。
[0022] 相较于现有技术，本发明提供的抗肿瘤免疫治疗纳米给药系统及其构建方法具有 以下有益效果：
[0023] -、通过制备紫杉醇/阴离子环糊精-DNA/甘露糖修饰三甲基壳聚糖纳米复合物， 开发了一个综合免疫给药系统，既能增加荷瘤机体抗肿瘤免疫应答，且能抑制或逆转肿瘤 免疫逃逸。
[0024] 二、通过在给药系统中引入紫杉醇，使得纳米给药载体本身可以作为佐剂诱导调 节T细胞数目随着PTX的加入而降低，从而抑制或逆转肿瘤免疫逃逸。
[0025] 三、通过在给药系统中引入阴离子环糊精，使得紫杉醇可以通过包合于阴离子环 糊精成为阴离子交联剂。
[0026] 四、通过在给药系统中引入三甲基壳聚糖，使得整个给药载体带正电，有利于与带 负电的DNA结合。
[0027] 五、通过在给药系统中引入甘露糖配体，使得紫杉醇/阴离子环糊精-DNA/甘露糖 修饰三甲基壳聚糖纳米复合物能通过树突状细胞膜表面分布甘露糖受体的介导，将纳米粒 直接靶向于未成熟的树突状细胞，增加了未成熟的树突状细胞对DNA疫苗或多肽的细胞摄 取。
【附图说明】
[0028] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它 的附图，其中：
[0029] 图1为PEGFP-N2质粒载体构建图；
[0030] 图2是本发明提供的紫杉醇/阴离子环糊精-DNA/甘露糖修饰三甲基壳聚糖纳 米复合物纳米粒粒径分布柱状图；
[0031] 图3是本发明提供的紫杉醇/阴离子环糊精-DNA/甘露糖修饰三甲基壳聚糖纳米 复合物纳米粒Zeta电压分布曲线图；
[0032] 图4是本发明提供的紫杉醇/阴离子环糊精-DNA/甘露糖修饰三甲基壳聚糖