专利名称：抗-EpCAM抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗人EpCAM单克隆抗体及其功能性衍生物，用于获得它们的方法和材 料，所述抗体用于表达EpCAM的肿瘤的诊断和治疗的用途以及含有所述抗体的适用于医疗 领域的材料。发明背景 能够选择性地识别在肿瘤部位超表达的抗原的抗体对肿瘤组织的靶向是所有抗 肿瘤免疫治疗的目标。上皮细胞粘附分子(EpCAM，SWiSSprot no. P16422)也称为肿瘤相关 钙信号转导蛋白l，TR0P-l，GA733-2等，是在单纯性上皮的基底外侧膜上表达的I型跨膜糖 蛋白，其中其参与钙无关性同嗜性细胞粘附。胞外结构域由一个上皮生长因子样重复，接着 甲状腺球蛋白重复和半胱氨酸缺乏区域组成，而胞内结构域是26个氨基酸长，并且存在两 个α-辅肌动蛋白的结合位点，用于与肌动蛋白细胞骨架连接(Winter MJ等，2003)。来自 成人恶性肿瘤的细胞强烈超表达EpCAM，如Went和同事(2006)最近证实的，其报道了对大 量结肠、胃、前列腺和肺肿瘤样本所获得的免疫组织化学结果。EpCAM超表达细胞易于与正 常的细胞隔离开来，这与增殖性和恶性表型的产生相关联(Winter等，2003)。基于这些数 据，探究了靶向EpCAM用于免疫治疗的可能性。鼠IgG2a抗体，依决洛单抗，对EpCAM阳性细胞具有一定的抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)，在德国被批准用于临床使用并用于治疗已经经历了医疗外科手术的结直肠或胰腺 癌的患者。在Dukes’ C结直肠癌患者的依决洛单抗治疗后，微小残留病的七年跟踪结果表 明32%的降低死亡率和降低23%的复发率(Riethmuller G等，1998 ；Weiner LM等，1993)。 然而，由于其有限的抗肿瘤功效(Punt CJ等，2002)以及打算将抗体用于用其他活性化疗 化合物辅助的情况下提出了新的临床试验(Frodin JE等，2002)，临床研究的整体结果导致 取消该药物作为单药治疗。针对该靶的其他抗体已经用于临床前或临床环境中。MT-201(Adecatumumab)是 完全的人单克隆IgGl抗体，对EpCAM具有适度的亲和性(Naundorf S等，2002)。使用结肠 癌细胞系HT-29在裸鼠异种移植物模型中证明了其功效(Naundorf S等，2002)。对各种 肿瘤细胞系的体外研究已经表明MT201通过ADCC和补体依赖性细胞毒性(CDC)来介导靶 细胞裂解(Prang N等，2005)。该抗体目前处于治疗激素难治疗性前列腺癌的临床研发中 (Oberneder R 等，2006)。ING-I是靶向EpCAM阳性细胞的高亲和性人工程化单克隆抗体。其已经用于标准 治疗难治性晚期腺癌患者的I期临床试验中，而来自该研究的数据表明对EpCAM具有高亲 和性同时对肿瘤细胞的细胞毒性更大的抗体也可以诱导急性胰腺毒性损伤，因此限制了它 们用于全身性给药的治疗窗口(De Bono JS等，2004)。对于抗体亲和性与免疫治疗功效的 关联性存在分歧的意见。Velders等(1998)在体外数据中提出了抗体亲和性和抗原密度对 ADCC的影响，这通过比较两种对EpCAM具有不同亲和性的抗体来获得。从该研究获得的数 据揭示了高亲和性抗体可能介导低抗原表达水平或在相当的结合水平的细胞杀伤，并具有 较高的功效。因为靶抗原表达的异质性是所有肿瘤的共有特征，因此使用高亲和性抗体能改善临床结果。这种可能的全身性毒性作用，与高亲和性抗-EpCAM抗体的治疗使用相关， 可以通过预靶向策略来降低，这种策略包括追踪步骤，以在给定的时间消除循环抗体。或 者，可以将高亲和性抗-EpCAM抗体的使用限制于局部区域治疗。已经研发了人源化单链Fv抗体片段，NR-LU_10，EpCAM抗原特异性的，遗传工程化 为抗生物素蛋白链菌素融合蛋白，用于预靶向放射免疫性疗法或放射免疫导向乳房外科手 术。临床前数据表明NR-LU-10后给予的单剂量的800 μ Ci 90Y-D0TA-生物素，治愈了带有 建立的皮下人小细胞肺癌或结肠癌异种移植物的小鼠(Goshorn S等，2001)。在Burak WE Jr等(2001)的第二个报告中，标记的NR-LU-IOFab的使用在10名患者的7名中，在用于揭 示肿瘤位置的术中探测中是有用的，因此证实了其作为靶向剂的能力。
尽管单克隆抗体在几种病理学中的临床成功，实体肿瘤的免疫治疗仍然是不能令 人满意的。预靶向抗体导向放射免疫疗法(PAGRIT )是允许放射性同位素在肿瘤中限制性 和扩大性累积的多重治疗方法。用作第一步的抗肿瘤单克隆抗体的特异性和亲和性是治疗 功效的基础。申请人:报道了 ST2146抗腱糖蛋白单克隆抗体在低和高抗原表达的人异种移植肿 瘤中特别高而特异性的累积(De Santis 等，ClinicalCancer Research，p. 2191，2006 年 4 月1日)。基于EP 0 496 074的教导，G. Paganelli等研发了这种三步预靶向方法，用于 肿瘤的全身性和局部性治疗(Cremonesi M.等，Eur. J. Nucl. Med. 26 (2).-110-120，1999 ； Paganelli G. Eur. J. Nucl. Med. 26(4) 348-357,1999 ；Paganelli G.等，Cancer Biother. &Radiopharm. 16(3) :227_235，2001)。关于三步预靶向方法的其他参考文献是W094/04702和US5，578，287。三步预靶向治疗是基于静脉内按序给予生物素化的抗-腱糖蛋白单克隆抗体、抗 生物素蛋白链菌素和9°γ-标记的生物素，并各自在抗生物素蛋白链菌素和9°Υ-标记的生物 素之前，两次追踪给予抗生物素蛋白和生物素化的白蛋白，以降低非特异性背景。在医学领域中，需要更多的并且改进的用于癌症诊断和治疗中，如例如用于 PAGRIT方法中的抗-EpCAM抗体。发明概述本发明涉及抗体和抗体片段，其还可以含有附加部分和诊断剂，含有这些抗体和 抗体片段的组合物以及含有它们的诊断和治疗组合物，它们在治疗和诊断中的用途以及制 备这些抗体和抗体片段的方法。本发明的目的是抗-EpCAM抗体或其功能性衍生物，其中抗体重链的可变区包含 至少一个具有选自SEQ ID No. 2 ；SEQ ID No. 4或SEQ IDNo. 6序列的互补性决定区(CDR)。优选，抗体重链的可变区包含至少两个具有选自SEQ ID No. 2 ；SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 6序列的互补性决定区(CDR)。仍然优选，抗体重链的可变区包含全部三个具有SEQ ID No. 2 ； SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 6序列的互补性决定区(CDR)。本发明的再一个目的是抗-EpCAM抗体或其功能性衍生物，其中抗体轻链的可变 区包含至少一个具有SEQ ID No. 8 ；SEQ ID No. 10或SEQID No. 12序列的互补性决定区 (CDR)。
优选，抗体轻链的可变区包含至少两个具有SEQ ID No. 8 ；SEQ IDNo. 10或SEQ ID No. 12序列的互补性决定区(OTR)。更优选，抗体轻链的可变区包含全部三个具有SEQ ID No. 8 ；SEQID No. 10和SEQ ID No. 12序列的互补性决定区(CDR)。本发明的再一个目的是抗-EpCAM抗体或其功能性衍生物，其具有包含至少一个、 两个或全部SEQ ID No. 2 ；SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 6序列的重链可变区和包含至少一 个、两个或全部SEQ ID No. 8 ；SEQ IDNo. 10或SEQ ID No. 12序列的轻链可变区。优选，根据本发明的抗-EpCAM抗体或其功能性衍生物能够完全并持久地抑制 EpCam表达肿瘤的生长。本发明还涉及通过突变⑶R序列中的一个或多个氨基酸来产生所公开的⑶R的突 变体。已知CDR中适当确定单个氨基酸置换的位置足以改善亲和性。研究者已经使用定向 突变使一些免疫球蛋白产物的亲和性增加了大约10倍。这种通过突变CDR来提高或降低 (即，调节)抗体的亲和性的方法是公知的(参见，例如，Paul, W. Ε.，1993)。因此，对本发 明的CDR进行氨基酸的置换、缺失或添加来提高或降低(S卩，调节)结合亲和性或特异性也 在本发明的考虑范围内。为了简洁，根据本发明的优选抗体应当以名称ST3232/10来标识。尽管本发明聚 焦于ST3232/10，但是作为本发明的范例，本领域的普通技术人员将认识到，一旦已知本发 明的公开内容，就可以在本发明的范围内生产和使用其他相似的抗体，和ST3232/10的抗 体片段以及这些相似抗体的抗体片段。本领域技术人员可以通过合理数量的实验来生产这 些相似的抗体。优选，抗-EpCAM抗体是单克隆抗体。更优选，通过根据布达佩斯条约在Advanced Biotechnology Center，热那亚，意大利，以No. PD06004保藏的杂交瘤细胞系来产生。仍然优选，抗体是SCFV、FV片段、Fab片段、F (ab) 2片段、多亚基抗体、肽或含有表 位结合片段的蛋白水解片段。仍然优选，抗体是嵌合的，与另一种蛋白质融合或与药剂或标记物连接。更优选， 嵌合蛋白是鼠-人嵌合体。优选，融合蛋白含有细胞因子、抗生物素蛋白家族的蛋白质、生 物素、标记的生物素或其他效应蛋白。本发明的抗体、抗体片段、抗体嵌合体或免疫球蛋白产物可以与药剂连接。连接可 以通过共价键或通过抗体-表位连接。例如，抗体、抗体片段、抗体嵌合体或免疫球蛋白产 物可以与第二种抗体交联，其中第二种抗体可以对药剂具有亲和性。药剂可以是细胞毒性 剂。如在此所用的术语“细胞毒性剂”指的是抑制或防止细胞功能和/或导致细胞破坏的 物质。术语用来包括放射性同位素(例如，I、Y、Pr)、化疗剂和毒素，如细菌、真菌、植物或动 物来源的酶活性毒素，或其片段。该药剂可以是化疗剂。化疗剂是用于治疗癌症的化合物。 化疗剂的实例包括阿霉素、亚德里亚霉素、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷(“Ara-C”)、环 磷酰胺、噻替派、白消安、Cytoxin、紫杉酚、顺钼、美法仑、长春花碱、博来霉素、足叶乙甙、异 环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、卡波钼、替尼泊甙、道诺霉素、洋红霉 素、氨基嘌呤、更生霉素、丝裂霉素、埃斯培拉霉素(参见美国专利No. 4，675，187)、美法仑 和其他相关的氮芥。药剂可以是细胞因子。术语细胞因子是由一个作为胞间介体作用于 另一个细胞的细胞群体释放的蛋白质的上位术语。这样的细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生 长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖 蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成 纤维细胞生长因子；促乳泌素；胎盘催乳质；肿瘤坏死因子；缪勒管抑制物质；鼠促性腺激 素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血栓形成素(TPO)；神经生长因 子，如NGF;血小板生长因子；转化生长因子(TGF)；胰岛素样生长因子-I和II ；促红细胞生 成素(EPO)；骨生成诱导因子；干扰素，如干扰素-α、-β和-Y，集落刺激因子(CSF)；粒细 胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)，如IL-U IL-Ia、 IL-2、I L-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IU IL-12 ；肿瘤坏死因子；和其他多 肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如在此所用的，术语细胞因子包括来自天然来源或来自 重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性等价物。
对于诊断，本发明的抗体、抗体片段、抗体嵌合体或免疫球蛋白产物可以连上标记 物，如连上可检测的化合物或组合物，其直接或间接缀合到抗体上。标记物可以是自身可检 测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记的情况下，可以催化可检测的底 物化合物或组合物的化学改变。
更优选，抗体是人或人源化抗体。因此，本发明提供了特异性结合EpCAM的抗体或抗体片段或抗体嵌合体(如，例 如，鼠-人嵌合体或与如细胞因子、抗生物素蛋白家族的蛋白质或其他效应蛋白的分子的 融合蛋白)或免疫球蛋白分子。本发明提供了包含至少一个ST3232/10的可变轻链的⑶R 和/或ST3232/10的可变重链的CDR的抗体或抗体片段或抗体嵌合体或免疫球蛋白分子。 本发明的抗体或抗体片段或抗体嵌合体或免疫球蛋白分子可以是抗体、Fv片段、Fab片段、 F(ab)2片段、单链抗体或多聚抗体。本发明的抗体或抗体片段或抗体嵌合体或免疫球蛋白 分子可以是或来自IgM、IgD、IgG、IgA或IgE同种型。本发明的另一个目的是所述抗体的重组衍生物。特别地，优选的重组衍生物是其 中鼠恒定区由人对应物替代的那些(Ferrer C.等，1996)或其中鼠恒定区由生物活性部分 替代的那些，生物活性部分如例如为抗生物素蛋白家族的成员(Penichet ML等，1999)、用 于刺激肿瘤定向免疫效应物的生长因子(如例如G-CSF、GM-CSF)，或其中鼠恒定区由药理 活性部分替代的那些，药理活性部分如例如毒素、超抗原、细胞因子或用于提高抗肿瘤治疗 功效的任何其他蛋白(DiMassimo A.M.等，1997 ；Parente D.等，1997)。用于获得所述重组衍生物的方法是本领域公知的。本发明的另一个目的是所述抗体的缀合衍生物。特别地，优选的缀合衍生物是其 中生物活性部分通过常规方法与抗体连接的那些。生物活性部分的实例是抗生物素蛋白家 族的成员，用于刺激肿瘤定向免疫效应物的生长因子(如，例如G-CSF、GM-CSF)，药理活性 部分，如例如毒素、超抗原、细胞因子或用于提高抗肿瘤治疗功效的任何其他蛋白、抗肿瘤 药物、放射性同位素。根据本发明，单克隆抗-人EpCAM或其片段的重组衍生物或缀合物也称为“衍生 物”。在本发明最特别优选的实施方案中，除了抗体和片段以外，其衍生物也是生物素化的。本发明的另外的目的是编码本发明的抗体或其功能性衍生物，或与以上核酸杂交 或由其简并序列组成的核酸。
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优选，核酸包括至少一个以下的序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、 SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 11。另一个实施方案涉及编码本发明的抗体或抗体片段或抗体嵌合体或免疫球蛋白 分子产物的纯化核酸分子。可以使用常规技术制得编码本发明的免疫球蛋白产物的核酸分 子。例如，可以使用寡核苷酸合成仪合成寡核苷酸，并连接在一起形成编码本发明的免疫球 蛋白产物的功能开放阅读框。核酸分子一旦合成，可以将其克隆至核酸载体中。核酸载体， 如质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、噬菌体载体、TI质粒等是本领域已知的。载体可以是表达 载体。表达载体和表达系统可从供应商如Stratagene (La Jolla, CA)购得。本发明的另一个目的是含有本发明的核酸的表达载体。本发明的再一个目的是用本发明的表达载体转化的宿主细胞。可以通过转染制得细胞。转染的方法是已知的，并且用于原核细胞和真核细胞转 染的试剂盒可以购自商业来源(例如，Stratagene, La Jolla, CA)。本发明的另一个目的是产生本发明的抗EpCAM抗体的杂交瘤细胞系。优选，杂 交瘤细胞系是根据布达佩斯条约在AdvancedBiotechnology Center，热那亚，意大利，以 No. PD06004 保藏的杂交瘤 CST3232/10。用于制备单克隆抗体的方法是本领域技术人员知识范围内的，并且根据标准程 序，包括培养以上的杂交瘤细胞系和分离抗体。本发明进一步的目的是本发明的抗EpCAM抗体用作药物。优选，用作抗肿瘤药 物。更优选，肿瘤选自结肠癌、乳癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌或肺癌。本发明的另一个实施方 案涉及治疗肿瘤患者的方法，包括将本发明的抗体、抗体片段、抗体嵌合体或免疫球蛋白产 物或本发明的核酸给予所述患者。用于癌症免疫治疗的方法是已知的。参见，例如，Old， L. J. Immunotherapy for Cancer (癌症的免疫治疗),Scientific American, 1996 年 9 月。 可以将抗体缀合到生物素上并通过使用追踪剂如抗生物素蛋白从循环中除去，以防止全身 性给药可能的毒性作用。在此还公开了治疗实体肿瘤的方法，其包括，首先，从患病的人患者的实体组织器 官(例如，结肠)摘除实体肿瘤(例如，表达EpCAM的实体肿瘤)，然后给予患者抗肿瘤剂， 如本发明的抗体、抗体片段、抗体嵌合体或免疫球蛋白产物(例如，与EpCAM结合的抗体)， 其以治疗有效量选择性地对实体肿瘤的细胞是毒性的。在本发明的实施方案中，通过将抗 肿瘤剂放置于切除腔中来进行给药步骤。本发明的另外的目的是含有有效量的根据本发明的抗体或其衍生物和药物学上 可接受的载体或稀释剂的药物组合物。优选，本发明的药物组合物是用于放射性免疫治疗 的。药物组合物是该领域中常规的，并可以由本领域技术人员仅根据一般性常识来制造。本 发明中提及的参考文献中给出了药物组合物的实例。同样适用于诊断试剂盒。特别优选如 以上提及的Paganelli等的论文和EP 0 496 074中公开的用于肿瘤放射性免疫治疗的试 剂盒。本发明的范围中包括含有抗体和/或其片段和/或重组衍生物和/或缀合物并与 至少一种药物学上可接受的赋形剂和/或载体混合的药物组合物。本发明的再一个方面是用于肿瘤的放射性免疫治疗的药物，将其给予患有表达 EpCAM的肿瘤的患者，并且该药物包括所述单克隆抗体或其蛋白水解片段，或衍生物。在优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其蛋白水解片段或衍生物是生物素化的，在更特别优 选的实施方案中，该药物适用于放射性免疫治疗，特别是用于进行三步预靶向方法，如在本 领域中，例如在EP 0 496 074，Paganelli等，1999和美国专利No. 5，968，405中所述的。 在这后一个方面中，根据本发明的药物将是试剂盒的形式，所述试剂盒由4个小瓶组成，其 中第一个小瓶含有生物素化的抗体或其片段或衍生物，第二个小瓶含有抗生物素蛋白，第 三个小瓶含有生物素化的白蛋白，第四个小瓶含有放射性标记的生物素或生物素衍生物。 Paganelli等，1999中提供了这种试剂盒。抗生物素蛋白包括抗生物素蛋白、抗生物素蛋 白链菌素、PEG-抗生物素蛋白或PEG-抗生物素蛋白链菌素、野生型或去糖基化的双_或 多抗生物素蛋白或双_或多抗生物素蛋白链菌素。放射性标记的生物素含有放射性核素， 如在EP 0 496 074中所公开的，优选例如，在W002/066075中公开的9°Y生物素衍生物。 Paganelli等，1999中公开了这种试剂盒。优选，小瓶适用于人注射。优选，组合物在相同单位剂量中或分开地含有至少另一种肿瘤特异性抗体。优选， 肿瘤特异性抗体是不同于本发明抗体的EpCAM抗体。另一个实施方案涉及含有本发明的抗 体、抗体片段、抗体嵌合体或免疫球蛋白产物的治疗组合物。可以以含有抗体、抗体片段、抗 体嵌合体或免疫球蛋白产物和药物学上可接受的载体或稀释剂的组合物的形式来提供本 发明的免疫球蛋白产物。治疗组合物可以用于治疗哺乳动物如人的疾病。本发明还提供了 治疗哺乳动物的方法，包括将治疗有效量的本发明的抗体、抗体片段、抗体嵌合体或免疫球 蛋白产物给予哺乳动物，其中哺乳动物患有需要使用该抗体、抗体片段、抗体嵌合体或免疫 球蛋白产物来治疗的疾病，如癌症。本发明的另一个目的是本发明的抗-EpCAM抗体用于诊断中。优选，作为抗肿瘤诊 断。更优选，作为体内的抗肿瘤诊断。疾病的检测或诊断包括以下步骤在允许所述抗体、 抗体片段、抗体嵌合体或免疫球蛋白产物与EpCAM抗原之间形成复合物的条件下用本发明 的抗体、抗体片段、抗体嵌合体或免疫球蛋白产物靶向来自患者的组织样本，并测定所述复 合物的形成。根据本发明的抗体可以应用于各种类型的免疫或生化诊断技术中。例如，诊断 技术包括(1)使用荧光抗体或化学染色方法，其中用染料例如荧光染料标记单克隆抗体， 以允许可明显观察到单克隆抗体与抗原之间的连接的存在，(2)酶-抗体方法，使用酶替代 荧光染料来标记单克隆抗体，(3)ELISA方法，使用蛋白标记的二抗来测量抗原的量等，(4) 放射性免疫测定方法，其中用同位素标记单克隆抗体和(5)免疫沉淀方法，利用由抗原-抗 体反应引起的聚集反应。诊断技术进一步包括Western印迹方法，其中通过电泳分级分离蛋白质，并通过 单克隆抗体来检测。对于单克隆抗体，Western印迹方法在编码抗原蛋白的多核苷酸的直 接克隆中是有利的。Western印迹方法包括各种改进，如Western方法，South Western方 法，Northffestern 方法禾口 West Western 方法。在本发明的另一个实施方案中，抗体及其片段可以进一步含有附加的标记和/或 诊断剂。所述标记和/或诊断剂是本发明所属领域的技术人员公知的。根据本发明的优选 实施方案，所述抗体或其蛋白水解片段是生物素化的。本发明的另外的目的是用于体内肿瘤诊断的可注射的可溶性组合物，其含有本发 明的抗-EpCAM抗体。本发明的另外的目的是免疫检测样品中能够与根据本发明的抗体或其衍生物结
9合的抗原的方法，其包括以下步骤在适当条件下用根据权利要求1至14的抗体或其衍生 物培养样品，以具有抗原_抗体复合物，并检测抗原_抗体复合物。本发明的另外的目的是用于根据权利要求30的方法的诊断试剂盒，其含有根据 权利要求1至14的抗体或其衍生物和抗原_抗体复合物检测装置。在本发明的另一个实施方案中，在治疗试剂盒中，将生物素化的抗体与其他EpCAM 特异性抗体结合。或者，将生物素化的抗体与其他肿瘤特异性抗体结合。EP 0 496 074、 Paganelli等，1999和美国专利No. 5，968，405中提供了这种试剂盒的一般教导。特别地，本发明还包括容器，任选包括多个隔间，含有生物素化抗体或其片段或衍 生物，适用于三步预靶向方法的治疗试剂盒中的缓冲剂和试剂。本发明的另一个目的是所述单克隆抗体或片段，或其重组衍生物或缀合物或其生 物素化衍生物用于制备诊断装置、用于检测表达EpCAM的疾病，特别是用于肿瘤体内成像 的用途。如以下实施例中详细给出的，从相应的杂交瘤细胞克隆CST3232/10中获得 ST3232/10。就本发明的工业方面而言，应当将在此公开的抗体适当地配制在药物组合物或诊 断试剂盒中，如该技术领域中通常所做的。在下列描述中还应当参照以下附图
通过非限制性实施例来详细地公开本发明。图 1 在蛋白 A 柱(MabSelect SuRe, GE Healthcare)上纯化的 cST3232/10 收集 物的 4-12% BisTris SDS-PAGE(Precast, Invitrogen, USA)。泳道 1-3 在非还原条件下 的纯化的ST3232/10Mab ；泳道4_6 在还原条件下的纯化的ST3232/10Mab。跑胶缓冲液Ix MES0通过考马斯(Simplie Blu, Invitrogen, USA)进行凝胶染色。图2 纯化的ST3232/10在TSGK3000柱上的凝胶过滤，在pH7的PBS中跑胶。横 坐标为时间(分钟)，而纵坐标为毫吸收单位(mAU)。图3 抗EpCAM抗体的FACS特异性测试。用没有天然地表达EpCAM (1 μ g/106细 胞，Ih 4°C)小鼠纤维肉瘤L细胞培养ST3232/10或其他对照抗体(M104，HT29/26和T16)， 该L细胞用人TR0P-1分子(图A-C)、人TR0P2分子(图D-F)或在没有引入外源蛋白时 用空载体(图G-I)转染过。根据制造商的说明使用PE-缀合的二抗(BD，USA)，并通过用 7-AAD(FACSCalibur, BD Biosciences, USA)染色来评价细胞死亡率。使用TR0P-1阳性细 胞(图A)，ST3232/10显示出阳性，而使用野生型L细胞或用TR0P2分子转染的那些(分别 为图G和D)显示出阴性。用其他EpCAM特异性抗体观察到相似的结果(图B、Ε、H :M104 ； C、I :HT29/26)。T16抗体用作TR0P2-L细胞中的阳性对照(图F)。图4 :MCF7乳房肿瘤细胞系上用Alexa488缀合的ST3232/10的共焦显微镜检查。 将MCF7细胞涂布于15x15mm盖玻片上，通过在PBS/4%多聚甲醛中培养48小时后在室温 下固定30分钟。然后将细胞透化并用抗体染色，通过共焦显微镜检查法分析几个视野。 Alexa488-ST3232缀合物证明了预期的染色模式，细胞-细胞边界强度最高，以及分离斑块 的染色。在图A和B中记录了两个分离斑块的实例。图5 :ST3232/10和单克隆抗体HT29/26抗EpCAM对HT29结肠癌细胞系上表达的 抗原的免疫反应性。数据表示为在用HT29结肠癌培养的两个抗体的递增浓度(yg/ml，对 数标度，X轴)下的光密度(0D，在405nm测量的)变化(线性标度，Y轴)。
图6 :ST3232/10与固定于CM5传感器芯片上的EpCAM分子的胞外域结合的动力 学分析和参数。图A 注射的Mab浓度(500、250、62. 5、15. 6和7. 8nM)作为时间(分钟，X 轴)和共振单位(RU，Y轴)函数的传感图。图B 将BiaEvaluation软件中的二价模型用 于数据拟合；对于每个时间点(X轴)，图中记录了残数(Y轴)，表示观察到的和预期的曲线 之间的 RU 差异。动力学常数如下 ^a1 = 7. 75E+04士297，Iid1 = 7. 20E-05士8. 48E-06，Kd =9. 3E-10, X2 = L 97。图7 :ST3232/10对人肿瘤和正常组织的反应性。例如，显示了结肠和肺癌(分别 为图A和C)与其正常对应物(分别为图B和D)比较的免疫组织化学结果。人肿瘤组织强 烈染色为棕色。图8 裸鼠中的异源移植物以及用ST3232/10与依决洛单抗(Panorex )相比 较的治疗。将用人Trop-I转染(L/Trop-Ι)或未转染(L/载体)的鼠L纤维肉瘤细胞系皮 下注入裸鼠中。接种那天，用200 μ g ST3232/10(L/载体+ST3232和L/Trop-l+ST3232)、依 决洛单抗(L/Trop-1+Panorex)或无关鼠IgG(L/载体和L/Trop-Ι)治疗动物。在第7天、 第15天和第22天进行其他三次给药，如箭头所示。监控肿瘤进展直至第50天。图9 裸鼠中的异种移植物以及用ST3232/10与M104抗体比较的治疗。将天然 表达Trop-I的人结肠癌细胞系KM12-SM皮下植入裸鼠中。从接种那天开始，用200 μ g ST3232/10(ST3232组)、M104(M104组)或载体(对照组)进行四次治疗，一周一次。监控 肿瘤进展直至第30天。方法杂交瘤细胞为了产生新的抗EpCAM的杂交瘤细胞克隆，用人EpCAM分子(NCBIRefSeq NM_002354)稳定转染的L鼠纤维肉瘤细胞系(Alberti S等，1988)使彻让/(3小鼠免疫。 通过标准方法(Cianfriglia M等，1986)将来自免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0Agl4骨髓瘤细 胞融合，并通过对表达EpCAM的肿瘤细胞系如HT29的细胞荧光测量来筛选杂交瘤群体。通 过在含FCS的培养基中极限稀释两次和在无蛋白培养基(AnimalDerived Component Free Medium HyClone, HyQRPerbio)中极限稀释四次来克隆EpCAM特异性杂交瘤。将源自第四 次极限稀释克隆的阳性克隆之一命名为CST3232并在迷你生物反应器中发酵。CST3232细 胞系的稳定性为98. 65%。因此，选择阳性克隆CST3232/10并扩增用于进一步的研发。抗体ST3232/10是通过商业试剂盒(Roche，德国)测定的IgGl/k同种型的鼠免疫球蛋 白。使用退火到抗体恒定区的一对引物(5’-TGTCAAGAGCTTCAACAGGA-3’ (SEQ ID NO 13), 5，-AAGATGGATACAGTTGGTGC-3，(SEQ ID NO 14))，从环化的 cDNA 扩增 κ 轻链可变区，如 M-Sassano 等(1994)中所述的。使用退火到抗体恒定区的引物寡核苷酸鼠YlCHl 5’ -ATGGAGTTAGTTTGGGCAGCAG -3，(SEQ ID Ν0:15)和寡核苷酸鼠 Y 1CH35' -GCACAACCACCATACTGAGAAG-3‘ (SEQ ID N0: 16)，从环化的cDNA扩增γ重链可变区，如M. Sassano等(1994)中所述的。使用以下的条件进行PCR -MV，40秒，62°C，40秒，72°C，1分钟，30个循环。使用TA克隆试剂盒双启动子PCRII (Invitrogen，#K2050_01)，将扩增的片段在 PCRII克隆载体中直接克隆。将含有κ轻链的九个克隆和含有Y重链可变区的7个克隆测序。在德国的MWG Biotech进行测序。对两条链都进行了测序。没有发现不确定性。SDS-PAGE 分析在非还原条件和还原条件下，将抗体在4-12%梯度的Bis TrisNuPAGE上跑胶，使 用IxMES作为跑胶缓冲剂，并用考马斯溶液进行染色(所有试剂来自Invitrogen，USA)。饩谱特征将ST3232/10 以 Iml/ 分钟的流速在 TSGK3OOO 柱(TosohBioscience GmbH, Stuttgart，德国)上过柱，使用PBS+NaN30. 05%作为跑胶缓冲液。细胞转染根据Alberti S等，1988，进行使用Trop-I或Trop 2的转染。FACS 分析通过对一组人细胞系的流式细胞测量来分析与细胞表面上的天然Trop-I分子 结合的ST3232/10。在96-孔V底平板中进行两步反应，使用约3*105细胞/孔。首先用 Iyg/孔的ST3232/10抗体培养细胞悬浮液；然后，用2μ1 PE-缀合的抗鼠二抗(550589， BD Pharmingen, Erembodegem,比利时)。对于每一步，将细胞在4°C下培养30分钟，用含有 1% FCS的PBS洗涤。最后一次洗涤后，将细胞重悬浮于PBS中，用于使用带有专用软件的 FACSArray 仪器(BD Biosciences, Erembodegem，比利时)来获取和分析。将其他 Tropl、 Trop2或无关抗体用作对照，并将7_AAD(BD Biosciences, Erembodegem,比利时)加入样品 中(5μ1/106细胞)，用于生活力染色。共焦显微镜检杳通过Alexaf luor-488标记的ST3232/10将乳房肿瘤细胞系MCF7染色，并通过共 焦显微镜检查法来分析。将MCF7细胞涂布于15x15mm的盖玻片上，并通过在PBS/4%多聚 甲醛中培养48小时后在室温下固定30分钟。在含有0. 05%皂苷的SM(PBS中10%血清) 中在室温下透化30分钟后，将一抗(lyg ST3232-Alexa488/载玻片)在SM+皂苷中在室 温下培养30分钟。在SM中洗涤3次后，将盖玻片固定好用于共焦显微镜检查。细胞ELISA最初用200 μ 1/孔lxPBS，10% FCS将96孔平板在37°C下阻断30分钟，然后接种 100 μ 1总体积中的250. 000细胞/孔加一抗。将平板在37°C下培养1小时，然后用lxPBS， 1 % FCS通过在2000rpm下离心几秒钟来洗涤三次。将碱性磷酸酶缀合的抗鼠IgG (Sigma A2429，1/1000稀释度)加入到一抗-细胞复合物中，并在室温下培养1小时，然后在洗涤五 次后，将200 μ 1 ρΝρρ底物(Sigma A3496)加入到每个孔中并在37°C下培养30分钟。最后 将平板离心并将170 μ 1上清液转移至新的平板中，并使用ELI SA分光光度计(SEAC Sirio S)在405nm下读数。表面等离子共振通过固定在CM5芯片上的可购得的嵌合融合蛋白Fc-EpCAM胞外域(R&D，USA)的 表面等离子共振(SPR, Biacore X，Biacore，Uppsala，瑞典)来评价 ST3232/10 对 EpCAM 的 亲和性。通过二价模型(Biaevaluation软件，v. 3. 1，Biacore, Uppsala，瑞典)来评价注 射500-7. 8nM浓度范围的ST3232/10获得的曲线。免疫组织化学将来自TRISTAR Technology实验室(USA)的冷冻切片用于选择性研究，这些
12切片为35个肺癌和10个正常肺(cod. #49561006)，35个结直肠癌和10个正常结肠 (cod. #49561004)，35个卵巢癌和10个正常(cod. #49561006)和带有正常组织的载玻片 (cod. #49561001)。将ST3232/10在阻断溶液(PBS+2. 5%标准马血清)中稀释至5 μ g/mL。 在复制载玻片上使用与测试物质相同的浓度的同种型匹配负对照。根据制造商的说明来处理载玻片，并通过使用Vectastain ABCElite试剂盒cod. PK6102试剂盒(Vector Laboratories)来揭示抗体结合。组织水合后，通过将载玻片浸入 0. 3%过氧化氢酶溶液中5分钟来进行内源性过氧化物的淬灭。在PBS中洗涤5分钟χ 3次 并用PBS+2. 5%马标准血清阻断切片后，将在阻断溶液中稀释至5μ g/mL的一抗加入，在室 温下持续2小时。用PBS洗涤3次后，用山羊抗鼠生物素缀合二抗将载玻片培养30分钟， 然后用抗生物素蛋白_生物素复合物过氧化物酶培养30分钟。再次洗涤后，将载玻片在 Vector DAB/Ni底物试剂盒(Cat. SK-4100)中的新鲜DAB溶液中培养2分钟，在自来水 中停止反应。通过浸入Meyer’s苏木精中10秒钟来进行复染色。最后，将载玻片在75%、 80%、95%或100%乙醇中分别脱水1分钟，在二甲苯中清洗，用合成的固定剂永久地固定， 并用显微镜观察。体内樽型无胸腺棵鼠中的同种异体移棺将用Trop-I转染的(L/Trop-Ι)或没有用人Trop-I转染的(L/载体)小鼠L 纤维肉瘤细胞系皮下注入三组无胸腺裸鼠中(10只动物/组)。接种那天，用200yg ST3232/10(L/ 载体 +ST3232 和 L/Trop_l+ST3232)、依决洛单抗(L/Trop+Panorex)或无关 小鼠IgG(L/载体和L/Trop-Ι)治疗动物。在第7天、第15天和第22天进行其他三次给药， 如箭头所示的。在所有组中，通过卡尺测量来评价肿瘤生长直至第50天。将天然表达Trop-I的人结肠癌细胞系KM12-SM皮下植入裸鼠中。从接种那天开 始，使用200 μ g ST3232/10 (ST3232组)、M104 (M104组)或载体(对照组)来进行四次治 疗，一周一次。监控肿瘤进展直至第30天。结果表I中显示了 ST3232/10可变重链(VH)互补性决定区和可变轻链(VL)互补性决 定区的序列。表I :ST3232/10抗体的VH和VL互补性决定区的序列
权利要求
抗 EpCAM抗体或其功能性衍生物，其中抗体重链的可变区包含至少一个具有选自SEQ ID No.2；SEQ ID No.4或SEQ ID No.6序列的互补性决定区(CDR)。
2.根据权利要求1的抗-EpCAM抗体或其功能性衍生物，其中抗体重链的可变区包含至 少两个具有SEQ ID No. 2 ；SEQ ID No. 4或SEQID No. 6序列的互补性决定区(CDR)。
3.根据权利要求2的抗-EpCAM抗体或其功能性衍生物，其中抗体重链的可变区包含全 部三个具有SEQ ID No. 2 ；SEQ ID No. 4和SEQID No. 6序列的互补性决定区(CDR)。
4.抗-EpCAM抗体或其功能性衍生物，其中抗体轻链的可变区包含至少一个具有SEQ ID No. 8 ；SEQ ID No. 10 或 SEQ ID No. 12 序列的互补性决定区(CDR)。
5.根据权利要求4的抗-EpCAM抗体或其功能性衍生物，其中抗体轻链的可变区包含至 少两个具有SEQ ID No. 8 ；SEQ ID No. 10或SEQID No. 12序列的互补性决定区(CDR)。
6.根据权利要求5的抗-EpCAM抗体或其功能性衍生物，其中抗体轻链的可变区包含全 部三个具有SEQ ID No. 8 ；SEQ ID No. 10和SEQID No. 12序列的互补性决定区(CDR)。
7.具有根据权利要求1至3任一项的重链可变区和权利要求4至6任一项的轻链可变 区的抗-EpCAM抗体或其功能性衍生物。
8.根据之前任一项权利要求的抗-EpCAM抗体或其功能性衍生物，能够完全并持久地 抑制EpCAM表达肿瘤的生长。
9.根据权利要求8的抗-EpCAM抗体，是单克隆抗体。
10.根据权利要求9的抗-EpCAM抗体，是通过根据布达佩斯条约在Advanced Biotechnology Center，热那亚，意大利，以No. PD06004保藏的杂交瘤细胞系来产生的。
11.根据权利要求8的抗-EpCAM抗体，其中抗体是SCFV、FV片段、Fab片段、F(ab) 2片 段、多聚抗体、含有表位结合区域的肽或蛋白水解片段。
12.根据权利要求8的抗-EpCAM抗体，其中抗体是嵌合的，与另一种蛋白质融合或与药 剂或标记物连接。
13.根据权利要求12的抗-EpCAM抗体，其中嵌合蛋白是鼠_人嵌合体。
14.根据权利要求12的抗-EpCAM抗体，其中融合蛋白包括细胞因子、抗生物素蛋白家 族的蛋白、生物素、标记的生物素或其他效应蛋白。
15.根据权利要求8的抗-EpCAM抗体，其中抗体是人或人源化抗体。
16.编码根据之前任一项权利要求的抗体或功能性衍生物的核酸，或与以上核酸杂交 的核酸，或由其简并序列组成的核酸。
17.根据权利要求16的核酸，包含至少一个以下的序列SEQIDNo. 1、SEQ ID No. 3、 SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 11。
18.含有根据权利要求16或17任一项的核酸的表达载体。
19.用根据权利要求18的表达载体转化的宿主细胞。
20.产生根据权利要求1至8的抗-EpCAM抗体的杂交瘤细胞系。
21.根据权利要求20的杂交瘤细胞系，根据布达佩斯条约以No.PD06004保藏在 Advanced Biotechnology Center,热那亚，意大利。
22.权利要求1至15的抗-EpCAM抗体，用作药物。
23.权利要求22的抗-EpCAM抗体，用作抗肿瘤药物。
24.权利要求23的抗-EpCAM抗体，其中肿瘤选自结肠癌、乳房癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌或肺癌。
25.一种药物组合物，含有有效量的根据权利要求1至15任一项的抗体或其衍生物和 药物学上可接受的载体或稀释剂。
26.权利要求25的药物组合物，用于放射免疫治疗。
27.根据权利要求25或26的药物组合物，在相同单位剂量中或分开地含有至少另一种 肿瘤特异性抗体。
28.根据权利要求27的药物组合物，其中肿瘤特异性抗体是不同于权利要求1至15的 抗体的EpCAM抗体。
29.根据权利要求1至15的抗-EpCAM抗体，用于诊断中。
30.权利要求29的抗-EpCAM抗体，用作抗肿瘤诊断剂。
31.根据权利要求30的抗-EpCAM抗体，用作体内抗肿瘤诊断剂。
32.用于体内肿瘤诊断剂的可注射的可溶性组合物，含有根据权利要求31的抗-EpCAM 抗体。
33.用于免疫检测样品中能够与根据权利要求1至14任一项的抗体或其衍生物结合的 抗原的方法，包括在适当的条件下用根据权利要求1至15的抗体或其衍生物培养样品以具 有抗原_抗体复合物并检测抗原_抗体复合物的步骤。
34.用于根据权利要求33的方法的诊断试剂盒，含有根据权利要求1至15的抗体或其 衍生物和抗原_抗体复合物检测装置。
全文摘要
命名为ST3232/10的鼠来源的抗-EpCAM抗体呈现出适于治疗和诊断应用的特性。其显示出对天然抗原的高亲和性和良好的肿瘤选择性。
文档编号A61K39/395GK101970497SQ200880015767
公开日2011年2月9日 申请日期2008年4月2日 优先权日2007年4月4日
发明者A·M·安娜斯塔斯, F·派特隆泽里, R·德桑提斯, S·阿尔波提 申请人:希格马托制药工业公司