专利名称：：用于治疗自身免疫疾病的BLyS抑制和/或APRIL抑制与免疫抑制剂的组合的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于治疗自身免疫疾病的新型联合疗法，所述联合疗法牵涉BLyS或BLyS/APRIL抑制以及免疫抑制剂。
背景技术：
：淋巴细胞是几种白细胞群体之一；它们特异性地识别外来抗原并对其作出应答。淋巴细胞的三种主要类别为B淋巴细胞(B细胞)、T淋巴细胞(T细胞)和天然杀伤(NK)细胞。B细胞是负责抗体产生的细胞，并且提供体液免疫。B细胞在骨髓内成熟，并且伴随着在其细胞表面上表达抗原结合性抗体而离开骨髓。当幼稚B细胞首次遇到结合在其膜上的抗体所特异于的抗原时，细胞开始快速分裂，并且其后代分化为记忆B细胞和称为浆细胞的效应细胞。记忆B细胞具有更长的寿命，并且继续表达具有与原始亲本细胞相同的特异性的膜结合抗体。浆细胞不产生膜结合抗体而是产生分泌形式的抗体。分泌型抗体是体液免疫的主要效应分子。在各种条件下在B细胞表面上发现的一组肿瘤坏死因子(TNF)受体属于在免疫系统中的B细胞功能的细胞调节剂。特别地，三种TNF受体跨膜激活齐'J与CAML相互作用物(transmembraneactivatorandCAMLinteractor,TACI),属于TNF家族的B细胞激活因子的受体(BcellactivatorbelongingtotheTNFfamilyreceptor,BAFF-R)，以及B细万包成熟蛋白(Bcellmaturationprotein,BCMA)，已知与下列两种TNF配体之一或两者结合B淋巴细胞刺激剂(BLyS(BLymphocytestimulator)，也称为为BAFF、TAIX-1、ztnf4和THANK)和i曽歹直"i秀导酉己体(aproliferation—inducingligand,APRIL)。特别地，已知TACI和BCMA结合BLyS和APRIL两者，而BAFF-R只结合BLyS。已经开发了许多BLyS和/或APRIL拮抗剂以阻断BLyS的各种功能，所述功能包括但不应限于B细胞共刺激、成浆细胞和浆细胞存活、Ig类别转换、增强的B细胞抗原呈递细胞功能、恶性B细胞的存活、B-l细胞功能的形成、超过T-l期的B细胞发育、以及完全的生发中心的形成。这些分子中的一些还可以结合APRIL并阻断APRIL对于B细胞和免疫系统其他组分的效应(Dillon等人，(2006)Nat.Rev.DrugDis.5，235-246)。已开发的通过干扰BLyS和/或APRIL结合来影响B细胞功能的分子包括BLyS抗体例如Lymphostat-B(贝利木单抗(Belim画b))(Baker等人，(2003)ArthritisRh函，48，3253-3265和W002/02641);受体细胞外结构域/Fc结构域融合蛋白例如TACI-Ig，包括一个具体的实施方案，即atacicept(美国专利申请号20060034852)，BAFF-R-Fc(WO05/0000351),和BCMA-Ig或其他使用受体细胞外结构域的融合蛋白。BLyS和/或APRIL拮抗剂的另外类别包括其他依靠BLyS结合能力从而阻断与其受体结合的分子，例如AMG623、受体抗体以及在WO03/035846和WO02/16312中公开的其他分子。目前用于治疗自身免疫疾病的方法是抑制不希望的免疫反应。例如，在狼疮肾炎(LN)(—种牵涉患有系统性红斑狼疮(SLE)的患者的肾的严重并发症)的治疗中，几种免疫抑制药物已被证明是有益的。这些药物包括环磷酰胺(CYC)、硫唑噪呤(AZA)、环孢菌素A(CSA)和吗替麦考酴酸酯(固FX关于综合性的综述，可参见Mok等人，UOO3)AnnRheumDis62，799-804;和Iaccarino等人，(2007)AutoimmunityReviews6，190-195)。虽然这些药物是有益的，但在本领域中仍然需要改善对于免疫抑制药物的应答以有效地治疗自身免疫疾病。发明概述本发明的一个方面为用于降低哺乳动物中的免疫球蛋白水平的方法，所述方法包括施用BLyS和/或APRIL拮抗剂和免疫抑制药物。一种优选的方法是这样的，其中所述BLyS和/或APRIL拮抗剂为Fc融合蛋白，所述Fc融合蛋白可以是包含TACI的细胞外结构域或其功能性片段的TACI-Fc融合蛋白、包含BAFF-R的细胞外结构域或其功能性片段的BAFF-R-Fc融合蛋白或者包含BCMA的细胞外结构域或其功能性片段的BCMA-Fc融合蛋白。特别地，所述Fc融合蛋白包含SEQIDN0:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25或SEQIDNO:26的多肽序列。在另一个实施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂为BLyS抗体，其优选地在包含SEQIDNO:8的氨基酸162-275的区域内结合BLyS;或者称为LymphoStat-B的BLyS抗体。在进一步的实施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂为TACI抗体，其优选地在包含选自SEQIDNO:2的氨基酸72-109或SEQIDNO:2的氨基酸82-222的区域内结合TACI。在本发明的方法中，所考虑的免疫抑制药物中的一些包括环磷酰胺(CYC)、硫唑噤呤(AZA)、环孢菌素A(CSA)或吗替麦考酚酸酯(MMF)，尽管任何抑制免疫系统的药物可以是适合的。通过本发明方法而降低的免疫球蛋白水平可以是IgM、IgG、IgA、IgD或IgE或者其组合。本发明还包括用于减轻由B-细胞调节的自身免疫病症的方法，所述方法包括给患有所迷病症的患者施用治疗有效量的免疫抑制药物以及BLyS和/或APRIL拮抗剂。在一个实施方案中，所述自身免疫病症选自类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疳(SLE)、狼疮肾炎(LN)、韦格纳病(Wegener'sdisease)、炎症性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫瘕(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化症、银屑病、IgA肾病、IgM8多发性神经病、重症肌无力、脉管炎、糖尿病、Reynaud，s综合征、Sjorgen，s综合征和肾小球肾炎。特别用该方式治疗的一种疾病为狼疮肾炎。特别地，当自身免疫病症为类风湿性关节炎、系统性红斑狼瘉或狼疮肾炎时，在一个实施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂和所述免疫抑制药物可以以进一步与使用第二免疫抑制药物的疗法相联合的方式进行施用，所述第二免疫抑制药物例如为非类固醇抗炎药(NSAID)、糖皮质激素、泼尼松和疾病緩解抗风湿药(DMARD)。本发明的方法使用与BLyS和/或APRIL拮抗剂相组合的已显示在治疗自身免疫疾病方面有效的免疫抑制药物。被考虑用于本发明方法的免疫抑制药物包括环磷酰胺(CYC)、硫唑嘌呤(AZA)、环孢菌素A(CSA)或吗替麦考酚酸酯(醒F)。在其中给患者施用免疫抑制药物和BLyS和/或APRIL拮抗剂的用于治疗或减轻病症的任何方法中，所述免疫抑制药物和所述BLyS和/或APRIL拮抗剂可以同时或顺次施用。在一个特別的实施方案中，免疫抑制剂在BLyS和/或APRIL拮抗剂之前施用。还提供了包含免疫抑制剂和BLyS和/或APRIL拮抗剂的组合物。本发明进一步提供了制品，其包含免疫抑制剂、BLyS和/或APRIL拮抗剂以及标签，其中所述标签指明所述組合物用于治疗由B细胞调节的自身免疫病症。在本发明的方法、组合物和制品的任何实施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂，如果是抗体，那么包括嵌合抗体和人源化抗体。在本发明的方法、组合物和制品的任何实施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂，在一个实施方案中，为结合BLyS的受体的细胞外结构域和免疫球蛋白的Fc结构域之间的融合蛋白，或者Fc融合蛋白。在特别的实施方案中，所述Fc融合蛋白选自包含TACI的细胞外结构域的TACIFc融合蛋白，特别是atacicept;包含BAFF-R的细胞外结构域的BAFF-RFc融合蛋白，特别是BR3-Ig;和包含BCMA的细胞外结构域的BCMAFc融合蛋白。在其他实施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂为BLyS抗体，特别是在包含残基162-275的BLyS的区域内结合BLyS的BLyS抗体，特别是LymphosUtB。在另一个实施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂为BAFF-R抗体，包括在包含人BAFF-R的残基23-38的区域中进行结合的BAFF-R抗体。在另一个实施方案中，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂为TACI抗体、BCMA抗体或与这两种分子都结合的抗体，如美国专利申请号2003-0012783中所描述的。附图简述图1显示了四个治疗组的IgG的平均值(±标准差)媒介物(vehicle)，仅MMF,仅atacicept,以及atacicept和MMF。通过使用经对数转换的数据，除了"媒介物"对"仅MMF"之外，这些值的所有成对比较都是统计学上显著的(P<0.05)。图2显示了四个治疗組的IgM的平均值(土标准差)媒介物，仅薩F，仅atacicept,以及atacicept和MMF。通过4吏用经对数转换的数据，除了"媒介物"对"仅MMF"之外，这些值的所有成对比较都是统计学上显著的(p<0.05)。图3显示了四个治疗组的IgA的平均值(土标准差)媒介物，仅丽F，仅atacicept,以及atacicept和固F。通过使用经对数转换的数据，除了"媒介物"对"仅MMF"之外，这些值的所有成对比较都是统计学上显著的(p<0.05)。优选实施方案的详细描述尽管免疫抑制治疗看起来在自身免疫疾病的治疗中有用，但是从此处所描述的实验中发现，施用免疫抑制剂与BLyS和/或APRIL拮抗剂的组合是一种将会阻断B细胞中的多条信号途径的治疗方法，所述信号途径被认为负责针对自身抗原的抗体的产生，从而触发和/或维持10自身免疫状况。这导致在经历此类治疗的哺乳动物中循环免疫球蛋白减少。由于此类循环免疫球蛋白被认为至少部分地负责触发自身免疫疾病的负'f生症状(negativesymptoms),因jt匕免疫抑命J药物和4十对BLyS途径的疗法的组合提供了用于治疗由B细胞介导的疾病(例如基于B细胞的自身免疫疾病)的新型方法。免疫抑制药物与BLyS和/或APRIL拮抗剂的联合疗法可以为某些疾病例如狼疮肾炎的现有治疗提供更有效的备选方案。在本文中，"自身免疫疾病，，为任何起因于针对个体自己(自身)抗原和/或组织而产生的抗体的非恶性疾病或病症。如本文中所使用的，"B细胞耗竭"是指在药物或抗体治疗后，与治疗前的水平相比较，动物或人中的B细胞水平的降低。使用众所周知的测定法，例如通过获得全血细胞计数，通过对于已知的B细胞标志物进行FACS分析染色，和通过诸如在实验性实施例中所描述的方法，可以测量B细胞水平。B细胞耗竭可以是部分的或完全的。在接受B细胞耗竭性药物的患者中，一般地，在当药物在患者体内循环和恢复B细胞的时间期间，B细胞被耗尽。"免疫抑制药物"为干扰免疫系统并钝化其对于外来或自身抗原的应答的任何分子。环磷酰胺(CYC)和吗替麦考酚酸酯(醒F)是两种此种类型的分子。该术语意欲包括任何在下调免疫系统中可用作治疗剂的药物或分子。该方法特别考虑了已被用于治疗自身免疫疾病，d如类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎(LN)、韦格纳病、炎症性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化症、银屑病、IgA肾病、IgM多发性神经病、重症肌无力、脉管炎、糖尿病、Reynaud，s综合征、Sjorgen，s综合征和肾小球肾炎的药物。当在本文中使用时，术语"BLyS"或"BLyS多肽"、"TALL-1"或"TALL-1多肽，，、或者"BAFF，，或"BAFF多肽，，包括"天然序列BLyS多肽"和"BLyS变体"。"BLyS"是给予由人BLyS序列(SEQIDNO:7)或小鼠BLyS序列(SEQIDNO:9)所编码的那些多肽的名称。显示出BLyS生物学活性的多肽也被包括在此名称之内。例如，具有生物学活性的BLyS在体外或在体内加强下列事件中的任何一个或组合增加的B细胞存活、增加的IgG和/或IgM水平、增加的浆细胞数目以及在脾B细胞中NF-Kb2/100被加工成p52NF-Kb(例如，Batten,M等人，(2000)J.Exp.Med.192:1453-1465;Moore等人，(1999)Science285:260-263;Kayagaki等人，(2002)10:515-524)。几种可用于测试BLyS和/或APRIL拮抗剂的测定法，例如WO00/40716中所描述的B细胞增殖测定法，尤其是本领域普通技术人员所熟知的。简而言之，根据制造商的指导，用CD19磁珠和VarioMacs磁力分离系统(MiltenyiBiotecAuburn,CA)从外周血单核细胞中分离人B细胞。将经纯化的B细胞与可溶性BLyS(25ng/ml)和重组人IL-4(10ng/mlPharmingen)相混合，并且以1x105个细胞/孔将细胞铺板在圆底96孔平板上。待测试的BLyS和/或APRIL拮抗剂可以从约5jag/ml稀释至约6ng/ml,并与B细胞一起温育五天，其中在第四天用liiiCi3H-胸苷/孔进行脉冲过夜。作为对照，还可以将BLyS和/或APRIL拮抗剂与没有BLyS的B细胞和IL-4一起温育。用Packard平板收获器来对平板进行收获，并用Packard阅读器进行计数。"天然序列"多肽包括具有与源自自然界的相应多肽相同的氨基酸序列的多肽。此类天然序列多肽可以从自然界中分离，或者通过重组和/或合成手段来产生。特别地，术语"天然序列"包括所迷多肽的天然出现的截短的、可溶性的或分泌的形式(例如，细胞外结构域序列)，所述多肽的天然出现的变体形式(例如，选择性剪接的形式)，和所述多肽的天然出现的等位基因变体。一般地，在本说明书中公开的任何多肽的"变体"多肽包括这样的多肽，其中在全长或"天然序列"氨基酸序列的N-和/或C-末端以及一个或多个内部结构域内添加或删除了一个或多个氨基酸残基。当讨论受体的细胞外结构域时，还考虑了与天然序列BLyS多肽结合的片段。反过来，当讨论BLyS片段时，考虑了与三种BLyS受体中的一种或多种结合的片段。一般地，变体多肽将会与所述多肽或其指定片段具有至少约80%的氨基酸序列同一性，更优选地至少约81%的氨基酸序列同一性，更优选地至少约82%的氨基酸序列同一性，更优选地至少约83%的氨基酸序列同一性，更优选地至少约84%的氨基酸序列同一性，更优选地至少约85%的氨基酸序列同一性，更优选地至少约86%的氨基酸序列同一性，更优选地至少约87%的氨基酸序列同一性，更优选地至少约88%的氨基酸序列同一性，更优选地至少约89%的氨基酸序列同一性，更优选地至少约90%的氨基酸序列同一性，更优选地至少约91%的氨基酸序列同一性，更优选地至少约92%的氨基酸序列同一性，更优选地至少约93%的氨基酸序列同一性，更优选地至少约94%的氨基酸序列同一性，更优选地至少约95%的氨基酸序列同一性，更优选地至少约96%的氨基酸序列同一性，更优选地至少约97%的氨基酸序列同一性，更优选地至少约98。/。的氨基酸序列同一性和更加优选地至少约99%的氨基酸序列同一性。一般地，变体多肽不包括天然多肽序列。通常，变体多肽的长度为至少约10个氨基酸，经常至少约20个氨基酸，更经常至少约30个氨基酸，更经常至少约40个氨基酸，更经常至少约50个氨基酸，更经常至少约60个氨基酸，更经常至少约70个氨基酸，更经常至少约80个氨基酸，更经常至少约90个氨基酸，更经常至少约IOO个氨基酸，更经常至少约150个氨基酸，更经常至少约200个氨基酸，更经常至少约250个氨基酸，更经常至少约300个氨基酸，或者更长。如上面所提及的，BLyS和/或APRIL拮抗剂可以在体外或在体内以直接或间接的方式发挥功能，以部分地或完全地阻断、抑制或中和BLyS信号传导。例如，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂可以直接结合BLyS。例如，直接的结合剂为包含BLyS受体例如TACI、BAFF-R和BCMA的细胞外结构域(ECD)的多肽。可以如下来描述在本发明中涉及的BLyS受体。本发明的TACI多肽包括包含或由SEQIDNO:2的氨基酸1-246组成的TACI多肽。总括的术语"TACI"包括在WO98/39361、WO00/40716、WO01/85782、WO01/87979、WO01/81417和WO02/094852中描述的TACI多肽。本发明的TACI多肽可以分离自各种来源，例如人組织类型或其他来源，或者通过重组和/或合成方法来制备。本发明的BAFF-R多肽包括包含或由SEQIDNO:4的氨基酸残基1至184的邻接序列组成的BAFF-R多肽。总括的术语"BAFF-R"包括在WO02/24909和WO03/14294中描述的BAFF-R多肽。本发明的BAFF-R多肽可以分离自各种来源，例如人组织类型或其他来源，或者通过重组和/或合成方法来制备。本发明的BCMA多肽包括包含由SEQIDNO:6的氨基酸残基1-184组成的BCMA多肽。总括的术语"BCMA"包括了在Laabi等人，EMBOJ.，11:3897-3904(1992);Laabi等人，NucleicAcidsRes.，22:1147-1154(1994);Gras等人，Int.Immunology,7:1093-1106(1995);和Madry等人,Int.Immunology,10:1693-1702(1998)中描述的BCMA多肽。本发明的BCMA多肽可以分离自各种来源，例如人组织类型或其他来源，或者通过重组和/或合成方法来制备。为了发挥作为BLyS和/或APRIL拮抗剂的功能，这些受体的ECD为基本上没有跨膜或胞质结构域的多肽，其一般保留了结合BLyS的能力。特别地，TACI的细胞外结构域可以包含TACI多肽序列(SEQIDNO:2)的氨基酸1至154。此外，ECD可以是该序列的片段或变体，例如在vonBulow等人(同上)、WO98/39361、WO00/40716、WO01/85782、W001/87979和WO01/81417中描述的TACI的ECD形式。特别地，这些ECD形式可以包含SEQIDNO:2的氨基酸1-106、SEQIDNO:2的氨基酸卜142、SEQIDNO:2的氨基酸30-154、SEQIDNO:2的氨基酸30-106、SEQIDNO:2的氨基酸30-110、SEQIDNO:2的氨基酸30-119、SEQIDNO:2的氨基酸1-166、SEQIDNO:2的氨基酸1-165、SEQIDNO:2的氨基酸1-114、SEQIDNO:2的氨基酸1-119、SEQIDNO:2的氨基酸1-120和SEQIDNO:2的氨基酸1-126。此外，TACIECD可以包括只具有一个富含半胱氨酸的结构域的那些分子。BAFF-R的ECD形式包括包含BAFF-R多肽序列(SEQIDNO:4)的氨基酸卜71的那些。此外，ECD可以是该序列的片段或变体，例如在WO02/24909、WO03/14294和WO02/38766中描述的BAFF-R的BCD形式。特别地，这些ECD形式可以包含SEQIDNO:4的氨基酸1-77、SEQIDNO:4的氨基酸7-77、SEQIDNO:4的氨基酸1-69、SEQIDNO:4的氨基酸7-69、SEQIDNO:4的氨基酸2-62、SEQIDNO:4的氨基酸2-71、SEQIDNO:4的氨基酸1-61和SEQIDNO:4的氨基酸2-63、SEQIDNO:4的氨基酸1-45、SEQIDNO:4的氨基酸1-39、SEQIDNO:4的氨基酸7-39、SEQIDNO:4的氨基酸1-17、SEQIDNO:4的氨基酸39-64、SEQIDNO:4的氨基酸19-35和SEQIDNO:4的氨基酸17-42。此外，BAFF-RECD可以包括具有富含半胱氨酸的结构域的那些分子。BCMA的ECD形式包括包含BCMA多肽序列(SEQIDNO:6)的氨基酸l-48的那些。此外，BCD可以是该序列的片段或变体，例如在WO00/40716和WO05/075511中描述的BCMA的ECD形式。特别地，这些ECD形式可以包含SEQIDNO:6的氨基酸1-150、SEQIDNO:6的氨基酸1-48、SEQIDNO:6的氨基酸l-41、SEQIDNO:6的氨基酸8-41、SEQIDNO:6的氨基酸8-37、SEQIDNO:6的氨基酸8-88、SEQIDNO:6的氨基酸41-88、SEQIDNO:6的氨基酸1-54、SEQIDNO:6的氨基酸4-55、SEQIDNO:6的氨基酸4-51和SEQIDNO:6的氨基酸21-53。此外，BCMAECD可以包括只具有部分富含半胱氨酸的结构域的那些分子。在进一步的实施方案中，BLyS受体的BLyS结合区域(例如BAFF-R、BCMA或TACI的细胞外结构域或其片段)可以与免疫球蛋白分子的Fc部分相融合以促进其在体内的溶解性。根据一个实施方案，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂以100nM或更低的结合亲和力与BLyS多肽结合。根据另一个实施方案，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂以10nM或更低的结合亲和力与BLyS多肽结合。根据另外一个实施方案，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂以1nM或更低的结合亲和力与BLyS多肽结合。在另一个实例中，BLyS和/或APRIL拮抗剂包括这样的BLyS结合多肽，其不是天然序列或其变体。此类多肽的一些例子为在WO1505/000351中描述的具有式I、式II、式III的序列的那些多肽。特别地，一些结合多肽包括ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQIDNO:13)、ECFDLLV丽VPCGLLR(SEQIDNO:14)、ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQIDNO:15)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQIDNO:16)、ECFDLLV丽VACGLLR(SEQIDNO:17)、或在WO05/000351的图32中所列出的序列。备选地，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂可以在体外、原位或在体内，在其BLyS结合区域处与天然序列TACI、BAFF-R或BCMA的细胞外结构域结合，从而部分或完全地阻断、抑制或中和BLyS结合。例如，此类间接拮抗剂为TACI抗体，所述TACI抗体在TACI的区域中进行结合，从而在空间上阻碍了BLyS的结合。例如，在氨基酸72-109或邻近区域处的结合被认为阻断了BLyS结合。阻断APRIL与该分子结合也可以是有利的，所述结合被认为发生在氨基酸82-222的区域中。另一种BLyS和/或APRIL拮抗剂为BAFF-R抗体，所述BAFF-R抗体在BAFF-R的区域中进行结合，从而在空间上阻碍了人BAFF-R与BLyS的结合。例如，在氨基酸23-38或氨基酸17-42或者邻近区域处的结合被认为阻断了BLyS结合。最后，另外的间接拮抗剂为BCMA抗体，所述BCMA抗体在BCMA的区域中进行结合，从而在空间上阻碍了BLyS的结合。例如，在氨基酸5-43或邻近区域处的结合被认为阻断了BLyS(或APRIL)结合。在一些实施方案中，根据本发明的BLyS和/或APRIL拮抗剂为BLyS抗体。当提及时，术语"抗体"以最宽的意义进行使用，并且特别地涵盖例如单克隆抗体、多克隆抗体、具有多表位特异性的抗体、单链抗体、和抗体的片段。根据一些实施方案，将本发明的多肽融合入抗体框架中，例如在可变区中或在CDR中，从而所述抗体可以与BLyS结合，并抑制BLyS与TACI、BAFF-R或BCMA的结合，或抑制BLyS信号传导。包含本发明多肽的抗体可以是嵌合的、人源化的或人的。包含本发明多肽的抗体可以是抗体片段。备选地，本发明的抗体可以通过用本发明的多肽对动物进行免疫接种来产生。因此，考虑了针对本发明的多肽的抗体。特别地，考虑了特异于BLyS的抗体，所述抗体在人BLyS(SEQIDNO:8)的区域内进行结合，所述区域包含残基162-275和/或选自人BLyS的162、163、206、211、231、233、264和265的氨基酸的邻近氨基酸。所述抗体的结合是这样的，即从而所述抗体在空间上阻碍BLyS与一种或多种其受体的结合。此类抗体描述于W002/02641和W003/055979中。特别优选的抗体为被描述为Lyphostat-B的抗体(Baker等人，(2003)ArthritisRheum，48，3253-3265)。本文所使用的术语"单克隆抗体"是指从基本上同质的抗体的群体中获得的抗体，即包含该群体的那些独个抗体是同样的，除了可能的天然出现的突变外，所述突变可以以较少的量存在。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单一抗原位点。此外，与常规的(多克隆)抗体制备物(其通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性外，单克隆抗体也是有利的，因为它们是通过杂交瘤培养物来合成的，没有被其他免疫球蛋白污染。修饰词"单克隆的"将抗体的特征指明为获自基本上同质的抗体群体，而并不是解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。例如，待根据本发明进行使用的单克隆抗体可以通过首次由Kohler等人，Nature,256:495(1975)所描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)来制备。还可以例如通过4吏用在Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol，222:581-597(1991)中所描述的技术，从噬菌体抗体文库中分离出"单克隆抗体"。特别地，此处的单克隆抗体包括"嵌合"抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源；以及此类抗体的片段，只要它们展示出所希望的生物学活性(美国专利号4,816,567;Morrison等人，Proc.Natl，Acad.Sci.USA，81:6851-6855(1984))。制备嵌合抗体的方法是本领域中已知的。20非人(例如，鼠类)抗体的"人源化"形式为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如抗体的Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或其他抗原结合亚序列)，其包含最小限度的源自非人免疫球蛋白的序列。在极大程度上，人源化抗体为这样的人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者的互补决定区(CDR)的残基被来自具有所希望的特异性、亲和力和能力的非人物种(供者抗体)(例如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基所替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基所替代。此外，人源化抗体可以包含这样的残基，所述残基既不在受者抗体中也不在所输入的CDR或构架序列中发现。进行这些修饰以进一步细化和最大化抗体性能。一般地，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，和通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环(hypervariableloop)相应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR区为人免疫球蛋白序列的那些，尽管FR区可以包括一个或多个改善结合亲和力的氨基酸置换。FR中的这些氨基酸置换的数目在H链中通常不多于6，和在L链中不多于3。最好地，人源化抗体还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常为人免疫球蛋白的Fc)的至少一部分。进一步的细节，参见Jones等人，Nature,321:522-525(1986);Reichmann等人，Nature,332:323-329(1988);和Presta，Curr.Op.Struct,Biol，2:593-596(1992)。人源化抗体包括灵长类化抗体(PRIMATIZEDantibody)，其中该抗体的抗原结合区域源自通过例如用目的抗原对猕猴进行免疫接种而产生的抗体。制备人源化抗体的方法在本领域中是已知的。还可以通过使用各种本领域中已知的技术(包括噬菌体展示文库)来产生人抗体。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.，227:381(1991);Marks等人，J.Mol.Biol.，222:581(1991)。Cole等人和Boerner等人的技术对于制备人单克隆抗体也是可用的。Cole等人，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77(1985);Boerner等人，J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。本发明的结合性抗体的"功能性片段"为这样的那些片段，所迷片段保持了以与它们所源自的完整全长链分子基本上相同的亲和力与BLyS、TACI、BAFF-R或BCMA结合，并且可以能够耗竭B细胞，如通过体外或体内测定法(例如本文所描述的那些)所测量的。抗体"效应子功能"是指归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性，并且随着抗体同种型而变化。抗体效应子功能的例子包括Clq结合和依赖补体的细胞毒性；Fc受体结合；依赖抗体的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞激活。"依赖抗体的细胞毒性"或"ADCC，，是指这样的细胞毒性形式，其中在存在于某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcRs)之上所结合的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性地与携带抗原的靶细胞结合并随后用细胞毒素杀伤靶细胞。抗体"武装"了细胞毒性细胞，并且是此类杀伤所绝对必需的。用于介导ADCC的初级细胞，NK细胞，只表达FcyRIII，而单核细胞表达FcyRI、FcyRII和FcyRIII。在Ravetch和Kinet，Ann.Rev.Immunol9:457-92(1991)的第464页上的表3中概括了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定法，例如在美国专利号5，500，362或5,821,337中所描述的那种。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或者另外地，目的分子的ADCC活性可以在体内进行评估，例如在动物模型中，例如Clynes等人，PNAS(USA)95:652-656(1998)中所公开的那种。"依赖补体的细胞毒性"或"CDC"是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的激活是通过补体系统的第一组分(Clq)与(合适亚类的)抗体结合来起始的，所述抗体结合至其关联抗原(cognateantigen)。为了评估补体激活，可以进4亍CDC测定法，例如如在Gazzano-Santoro等人，LImmunol.Methods202:163(1996)中所描述的。"分离的，，抗体是已被鉴定并且与其天然环境的组分分开和/或从中回收的抗体。其天然环境的污染物组分为干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，所述物质可以包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体(1)纯化至抗体的大于95重量％,如通过Lowry方法所测得的，和最优选地大于99重量％,(2)纯化至这样的程度，即足以通过使用旋杯式序列分析仪来获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基，或者(3)纯化至通过使用考马斯蓝或优选地银染色，经在还原或非还原条件下的SDS-PAGE而确定的同质性。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不会存在。然而，通常，经过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体。氨基酸可以根据其侧链性质的相似性进行分组(A.L.Lehninger，Biochemistry,第二版，第73-75页，WorthPublishers,NewYork(1975)):(1)非极性的Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M);(2)不带电荷且极性的Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gin(Q);(3)酸性的Asp(D)、Glu(E);(4)碱性的Lys(K)、Arg(R)、His(H-)。备选地，基于共同的侧链性质，可以将天然存在的残基划分为几个组(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性且亲水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gin;(3)酸性的Asp、Glu;(4)碱性的His、Lys、Arg;(5)影响链取向的残基Gly、Pro;(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。在本发明中所使用的术语"保守"氨基酸置换意指这样的氨基酸置换，其替换了功能上等价的氨基酸。保守氨基酸改变导致所得的肽的氨基酸序列中的沉默改变。例如，具有相似极性的一个或多个氨基酸充当了功能等价物，并导致在肽的氨基酸序列内的沉默改变。一般地，组内的置换可以被认为在结构和功能方面是保守的。然而，技术人员将会认识到，特定残基的作用是由它在分子(该残基出现在所述分子中)的三维结构中的情境所决定的。例如，Cys残基可以以氧化20(二疏化物)形式存在，这具有比还原(硫醇)形式更小的极性。Arg侧链的长脂肪族部分可以构成其结构或功能作用的关键特征，并且这可以通过非极性的而不是另一个碱性的残基的置换而最佳地得到保存。此外，还将会认识到，包含芳香族基团的侧链(Trp、Tyr和Phe)可以参与离子-芳香族相互作用或"阳离子-TT"相互作用。在这些情况下，用酸性的或不带电荷且极性的组的成员置换这些侧链之一可以是在结构和功能方面保守的。诸如Pro、Gly和Cys(二硫化物形式)的残基可以对主链构象具有直接的影响，并且常常不可能在没有结构变形的情况下被置换。关于本文所鉴定的配体或受体多肽序列，"氨基酸序列同一性百分比(％)"被定义为候选序列中这样的氨基酸残基的百分比，所述氨基酸残基在经过下列程序后与本文所鉴定的此类配体或受体序列中的氨基酸残基相同对这些序列进行比对，并如果需要则引入缺口以获得最大序列同一性百分比，并且不将任何保守置换考虑作为序列同一性的一部分。为了测定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以处于本领域技能之内的各种方式来达到，例如，使用公众可获得的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上获得最大比对所需的任何算法，然而，为了此处的目的，如下面所描述的，通过使用序列比较计算机程序ALIGN-2来获得氨基酸序列同一性％值，其中ALIGN-2程序的完整源代码提供在下表中。ALIGN-2序列比较计算机程序的创造者是Genentech，Inc.，并且下表中所显示的源代码已与用户文档一起提交给了美国版权局(U.S.CopyrightOffice,WashingtonD.C.，20559)，在那里它以美国版权注册号TXU510087进行了注册。ALIGN-2程序是通过Genentech，Inc.,SouthSanFrancisco,California而公众可获得的，或者可以从下表中所提供的源代码进行编译。为了在UNIX操作系统，优选地数字UNIXV4.OD上进行使用，应当对ALIGN-2程序进行编译。所有序列比较参数由ALIGN-2程序进行设置并且不再变化。用于鉴定在蛋白质中的作为优选的诱变位置的某些残基或区域的一种有用方法称为"丙氨酸扫描资变法(alaninescanningmutagenesis)，，,如由Cunningham和Wells，Science,244:1081-1085(1989)所描述的。鉴定出一个或一组把残基(例如，带电荷的残基例如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选地，丙氨酸或聚丙氨酸)来替代之以影响所述氨基酸与结合靼的相互作用。然后，通过在置换位点处或者为置换位点引入进一步的或其他的变体，来对那些显示出对于置换的功能敏感性的氨基酸位置进行细化。因此，虽然用于引入氨基酸序列变化的位点是预先确定的，但是突变本身的性质不需要预先确定。例如，为了分析在给定位点处的突变的性能，在靶密码子或区域处进行丙氨酸扫描或随机诱变，并且就所希望的活性来对所表达的变体进行筛选。术语"双面角"是指围绕键的旋转。参见例如，Creighton，T.E.，(1993)Protein:StructuresandMolecularProperties,第2版，W.H.FreemanandCompany,NewYork,NY。术i吾"<J>"是表示了围绕氨基酸的N-C键的旋转的双面角。参见例如，Creighton,T.E.，(1993)Protein:StructuresandMolecularProperties,第2版,W.H.FreemanandCompany,NewYork,NY。I型P转角描述于Hutchinson,E.G.&Thornton,J.M.(1994)Arevisedsetofpotentialsforbetaturnformationinproteins.ProteinScience3，2207-2216中。"融合蛋白"和"融合多肽"是指具有共价连接在一起的两个部分的多肽，其中每一部分为具有不同特性的多肽。所述特性可以是生物学特性，例如体外或体内活性。所述特性也可以是简单的化学或物理特性，例如与靶分子的结合、反应的催化等。所述两个部分可以通过单个肽键直接连接，或者通过包含一个或多个氨基酸残基的肽连接体来连接。一般地，所述两个部分和连接体将会彼此地处于阅读框中。"缀合物"是指任何杂合分子，包括融合蛋白以及包含氨基酸或蛋白质部分和非蛋白质部分的分子。缀合物可以通过本领域中已知的各种技术来合成，包括例如重组DNA技术、固相合成、液相合成、有机化学合成技术或这些技术的组合。合成的选择将依赖于待产生的特定分子。例如，性质上不是完全"蛋白质"的杂合分子可以通过重组技术和液相技术的组合来合成。如本文中所使用的，术语"Fc融合蛋白"是指抗体样分子，其组合了异源蛋白质的结合特异性和免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能。从结构上说，Fc融合蛋白包含了具有所希望的结合特异性的氨基酸序列(其不同于抗体的抗原识别和结合位点(即，是异源的))与免疫球蛋白恒定结构域序列的融合。Fc融合蛋白分子通常包括至少包含受体或配体的结合位点的邻接氨基酸序列。Fc融合蛋白中的免疫球蛋白恒定结构域序列可以获自任何免疫球蛋白，例如IgG-l、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型，IgA(包括lgA-l和IgA-2)，IgE,IgD或IgM。例如，根据本发明有用的Fc融合蛋白为包含BLyS受体的BLyS结合部分而没有BLyS受体的跨膜或胞质序列的多肽。在一个实施方案中，BAFF-R、TACI或BCMA的细胞外结构域与免疫球蛋白序列的恒定结构域相融合。术语"哺乳动物，，是指任何被归类为哺乳类的动物，包括人、家养和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，例如狗、马、猫、牛等。优选地，此处的哺乳动物为人。术语"治疗有效量"是指对于"减轻，，或"治疗"受试者或哺乳动物中的疾病或病症而言有效的抗体或拮抗剂药物的量。在癌症的情况下，治疗有效量的药物可以减少癌细胞的数目；减少肿瘤大小；抑制(即，在某种程度上减緩和优选地终止)癌细胞浸润入外周器官中；抑制(即，在某种程度上减緩和优选地终止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肺瘤生长；和/或在某种程度上緩解一种或多种与癌症相关的症状。参见下面的"治疗"的定义。在药物可以阻止生长或杀死现有的癌细胞方面来说，它可以是抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。本发明的BLyS或BLyS受体抗体可以通过瞬时或稳定转染真核宿主细胞例如CH0细胞来产生。本文所用的"载体(carrier)"包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度的情况下对暴露于它们的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学上可接受的栽体为pH被緩冲的水溶液。生理学上可接受的载体的例子包括緩冲液，例如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螫合剂，例如EDTA;糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；和/或非离子型表面活性剂，例如TWEEN、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。多核苷酸，载体(vector)，宿主细胞根据本文公开的许多实施方案，所述BLyS和/或APRIL拮抗剂可产生的特定多肽。本发明的各种类型的多肽可以宽泛地进行描述，并且选自基于受体的序列、基于抗体的序列和人工的(即非天然的)结合序列。基于受体的序列的例子为结合BLyS的那些序列，其分离自或源自在体内结合BLyS的受体(例如TACI、BAFF-R或BCMA)的结构域。基于抗体的序列为通过使用抗体形成技术而产生的并保持了抗体分子一般结构的那些序列。基于抗体的序列的例子为LymphoStat-B或针对BLyS的受体的抗体。人工的结合序列的例子包括本文所描述的17肽，掺入了一个或多个17肽作为核心区的多肽，以及17肽和多肽的经共价修饰的形式(例如Fc融合蛋白、经标记的多肽、受保护的多肽、经缀合的多肽、融合蛋白等)。用于制备这些形式的多肽各种技术在本文中进行了描述。用于标记多肽和将分子缀合至多肽的方法是本领域中已知的。本发明的组合物可以通过使用本领域中已知的重组技术来制备。24宿主细胞并从细胞培养物中回收多肽来产生此类特定多肽的方法。(参见例如,Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)jDieffenbach等人，PCRPrimer:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995))。为了进一步的克隆(DNA的扩增)或表达，可以将编码所希望的多肽的核酸(例如，cDNA或基因组DNA)插入可复制的载体中。各种载体是公众可获得的。栽体组分一般包括但不限于下列中的一种或多种信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，它们中的每个均在下面进行了描述。可以采用的可选的信号序列、复制起点、标记基因、增强子元件和转录终止子序列是本领域中已知的并在WO97/25428中作了进一步详细的描述。通常，表达和克隆载体包含被宿主生物体所识别并有效连接至编码性核酸序列的启动子。启动子是位于结构基因的起始密码子上游(5')的非翻译序列(一般在约100至1000bp之内)，其控制与它们有效连接的特定核酸序列的转录和翻译。通常，此类启动子分为两类，即诱导型的和组成型的。诱导型启动子为这样的启动子，所述启动子响应于培养条件的某些变化(例如，营养物的存在或不存在，或者温度的变化)而起始从在其控制之下的DNA上所进行的转录的水平增加。目前，众所周知许多被各种潜在的宿主细胞所识别的启动子。通过经限制酶消化从源DNA中移除启动子并将分离的启动子序列插入到载体中，将这些启动子有效连接至编码性DNA。包含一种或多种上面所列的组分的合适载体的构建采用标准连接技术。将分离的质粒或DNA片段进行切割、剪裁、并重新连接为对于产生所需要的质粒而言所希望的形式。为了进行分析以确认所构建的质粒中的正确序列，可以使用连接混合物来转化大肠杆菌(AK12菌抹294(ATCC31,446)，并在合适时通过氨爷青霉素或四环素抗性来选择成功的转化体。从转化体中制备质粒，通过限制性核酸内切酶消化进行分析，和/或通过使用本领域中已知的标准技术进行测序。[参见例如，Messing等人，NucleicAcidsRes.，9:309(1981);Maxam等人，MethodsinEnzymology，65:499(1980)]。可以采用提供了编码性DNA在哺乳动物细胞中的瞬时表达的表达载体。一般地，瞬时表达牵涉使用这样的表达载体，其能够在宿主细胞中有效地复制，从而使得宿主细胞积累许多拷贝的该表达载体，并从而合成高水平的由该表达载体所编码的所希望的多肽[Sambrook等人，同上]。包含合适的表达载体和宿主细胞的瞬时表达系统使得能够方便而肯定地鉴定出由经克隆的DNA所编码的多肽，以及就所希望的生物学或生理学特性来快速地筛选此类多肽。适合于为了在重組脊推动物细胞培养物中合成所希望的多肽而进行调整的其他方法、载体和宿主细胞描述于Gething等人，Nature,293:620-625(1981);Mantei等人，Nature,281:40-46(1979);EP117，060;和EP117，058中。用于在此处的载体中克隆或表达DM的适合的宿主细胞包括原核细胞、酵母或高等真核细胞。用于此目的的适合的原核细胞包括但不限于真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(f/^ero6acter/aceae)，4列^口埃希氏菌属(fsc/er/cA/a)伊j^口大肠杆菌，肠杆菌属(^2"ro6s"er)，欧文氏菌属(Srw^3ia)，克雷伯氏菌属(iT/e^/e/"),变形菌属(ZVWe^)，沙门氏菌属(Sa7边o/e/7a)移'j:ft口鼠^f夷寒沙，门氏菌(Sa7迈o/7e/hOT^/迈f/r/"迈)，沙雷氏菌属(〃a)例如粘质沙雷氏菌(tora〃a迈flrce"m)，和志贺氏菌属(57;e7/a)，以及芽孢杆菌属(&"7/wi)例如枯草芽孢杆菌(A^6〃//s)和地衣芽孢杆菌(A//cAe/z//or/")(例如，在于1989年4月12日/>布的DD266，710中公开的地衣芽孢杆菌41P),假单胞菌属(/^e"f/o迈o"as)例如铜绿假单胞菌(户.aeri^/zzosa)，和链霉菌属(S打e/^o边/ces)。优选地，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶。除了原核生物以外，真核^:生物例如丝状真菌或酵母也是载体的合适的克隆或表达宿主。用于表达糖基化多肽的合适的宿主细胞源自多细胞生物体。所有此类宿主细胞的例子在W097/25428中作了进一步描述。用上面描述的表达或克隆栽体转染和优选地转化宿主细胞，并在营养基质中进行培养，所述营养基质经改良而适合于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所希望的序列的基因。"转染"是指，表达载体被宿主细胞吸收，不论编码序列是否事实上被表达。众多转染方法是普通技术人员已知的，例如，CaP04和电穿孔。一般地，当该载体的运转的任何指征出现在宿主细胞内时，认为是成功的转染。"转化"表示将DNA引入生物体中，从而该DNA作为染色体外元件或通过染色体整合体而成为可复制的。依赖于所使用的宿主细胞，可以通过使用适合于此类细胞的标准技术来进行转化。一般地，将采用氯化钙的钙处理(如在Sambrook等人(同上)中所描述的)或电穿孔用于原核细胞或包含实质性细胞壁屏障的其他细胞。将使用根瘤土壤杆菌(v^ro6ac^er/〃顶f咖e尸ac/e/^)的感染用于转化某些植物细胞，如由Shaw等人，Gene，23:315(1983)和于1989年6月29日公布的W089/05859所描述的。此外，可以通过使用超声处理来转染植物，如在于1991年1月10日公布的W091/00358中所描述的。对于没有此类细胞壁的哺乳动物细胞，可以采用Graham和vanderEb，Virology,52:456-457(1978)的磷酸钓沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转化的一般方面已在美国专利号4,399,216中作了描述。通常，根据VanSolingen等人，J.Bact.，130:946(1977)和Hsiao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，76:3829(1979)的方法来施行向酵母中的转化。然而，也可以使用用于将DNA引入细胞中的其他方法，例如通过核微量注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞融合、或者聚阳离子(例如polybrene、聚鸟氨酸)。关于用于转化哺乳动物细胞的各种技术，参见Keown等人，MethodsinEnzymology185:527-537(1990)，和Mansour等人，Nature,336:348-352(1988)。原核细胞可以在合适的培养基中进行培养，如在Sambrook等人(同上)中所一般性地描述的。商购可得的培养基的例子包括Ham'sFIO(Sigma)、极限必需培养基("MEM",Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良的Eagle培养基("DMEM"，Sigma)。在需要时，任何此类培养基可以补充有激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、緩沖液(例如HEPES)、核苷(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如庆大霉素)、痕量元素(其定义为通常以在微重量摩尔浓度范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等价的能量来源。还可以以本领域技术人员将会知晓的适当浓度包含任何其他必需的补充物。培养条件，例如温度、pH等，为先前关于被选择用于表达的宿主细胞所使用的那些，并且对于普通技术人员来说将会是显而易见的。一般地，用于最大化哺乳动物细胞培养物的生产力的原理、方案和实用技术可以在MammalianCellBiotechnology:APracticalApproach,M.Butler(编辑)(IRLPress,1991)中找到。经表达的多肽可以作为分泌型多肽从培养基中回收，虽然当直接产生而没有分泌信号时，也可以从宿主细胞裂解液中回收。如果多肽是膜结合的，可以通过使用合适的去污剂溶液(例如Triton-X100)从膜上将它释放出来，或者可以通过酶促切割来释放其细胞外区域。当在非人起源的重组细胞中产生多肽时，它没有人起源的蛋白质或多肽。但是，常常必需从重组细胞蛋白质或多肽中回收或纯化所述多肽，以获得基本上同质的制备物。作为第一步，可以离心培养基或裂解液以去除颗粒状的细胞碎片。下面是合适的纯化操作程序的示例性的操作程序在离子交换柱上进行分级；乙醇沉淀；反相HPLC;在二氧化硅或阳离子交换树脂(例如DEAE)上的色谱法；层析聚焦；SDS-PAGE;;琉酸铵沉淀；凝胶过滤，其4吏用例如SephadexG-75;和A蛋白Sepharose柱，以去除污染物例如IgG。噬菌体展示28根据一些实施方案，选自下列的本发明的多肽可以在噬菌体展示中使用式I、式II、式III、ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQIDNO:13)、ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQIDNO:14)、ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQIDNO:15)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQIDNO:16)、ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQIDNO:17)和在WO05/000351的图32中所列出的序列。使用噬菌体展示技术使得能够产生大的蛋白质变体文库，可以就那些以高亲和力与靶分子结合的序列来快速地对所述蛋白质变体进行分选。将编码变体多肽的核酸与编码病毒外壳蛋白(例如基因III蛋白或基因VIII蛋白)的核酸序列相融合。已开发出了单价噬菌体展示系统，其中编码所述蛋白质或多肽的核酸序列与编码基因III蛋白的部分的核酸序列相融合。(Bass，S.，Proteins,8:309(1990);Lowman和Weils，Methods:ACompaniontoMethodsinBnzymology，3:205(1991))。在单价噬菌体展示系统中，基因融合物以低水平表达，并且还表达了野生型基因III蛋白，从而保持了颗粒的感染性。用于产生肽文库和筛选那些文库的方法已在许多专利(例如，美国专利号5，723，286;美国专利号5，432，018;美国专利号5,580，717;美国专利号5,427,908;和美国专利号5，498，530)中公开。在一些实施方案中，式I、式II或式III被表达为在噬菌体上的肽文库。然后，使表达式I、式II或式III的多肽文库的噬菌体经历基于BLyS结合的选择。在一些实施方案中，选择过程牵涉允许某些噬菌体与生物素化的BLyS结合，后者随后被结合至中性抗生物素蛋白(neutravidin)平板。回收并繁殖通过BLyS-生物素-中性链霉抗生物素蛋白结合而结合至平板的噬菌体。在一些实施方案中，使所述噬菌体经历几轮选择。在一些实施方案中，将所述噬菌体与BLyS-生物素一起进行温育，随后添加未生物素化的BLyS作为竟争结合剂。在实施例中提供了在本发明的情况下使用噬菌体展示的另外的指导。融合或缀合至异源多肽的多肽进一步考虑在此处的方法中使用包含本发明的多肽的Fc融合蛋白分子。在一些实施方案中，所述分子包含本发明的多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定区域的融合。对于Fc融合蛋白的二价形式，这样的融合物有用地包含IgG分子的Fc区。在进一步的实施方案中，Fc区来自人IgGl分子。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白融合物包括IgGl分子的铰链、CH2和CH3区或者铰链、CH1、CH2和CH3区。关于免疫球蛋白融合物的产生，还可参见美国专利号5,428,130，美国专利号5,843,725，美国专利号6,018,026，和Chamow等人，TIBTECH，14:52-60(1996)。最简单和最直接的Fc融合蛋白设计常常将本发明的拮抗剂多肽(优选地，天然序列)的结合结构域与免疫球蛋白重链的Fc区相组合。在另一个实施方案中，所述多肽可以是人工的，例如可以将包含下列序列的多肽共价连接至免疫球蛋白的Fc部分式I、式II、式III、ECFDLLVRA證CSVLK(SEQIDN0:13)、ECFDLL額WVPCGLLR(SEQIDNO:14)、ECFDLL窗WVPCEMLG(SEQIDNO:15)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQIDNO:16)、ECFDLLVRHWVACGLLR(SBQIDNO:17)、或在图32中所列出的序列。此外，这些多肽中的一个或多个可以彼此连接和连接至免疫球蛋白的Fc部分。通常，当制备本发明的Fc融合蛋白时，将编码结合结构域的核酸在C-末端融合至编码免疫球蛋白恒定结构域序列的N-末端的核酸，然而，N-末端融合物也是可能的。通常，在此类融合物中，所编码的嵌合多肽将会至少保留免疫球蛋白重链恒定区的在功能上有活性的铰链、CH2和CH3结构域。也可以向恒定结构域的Fc部分的C-末端进行融合，或者在对于重链的CHI或轻链的相应区域而言紧N-末端处进行融合。进行融合的精确位点不是关键性的；具体位点是众所周知的并且可以进行选择以优化Fc融合蛋白的生物学活性、分泌或结合特征。在一个优选的实施方案中，将结合结构域序列融合至免疫球蛋白Gl(IgGl)的Fc区的N-末端。可以将整个重链恒定区与结合结构域序列相融合。然而，更优选地，在融合中使用这样的序列，所述序列开始于刚好在木瓜蛋白酶切割位点(其在化学上定义了IgGFc)(即残基216,将重链恒定区的第一个残基作为残基114)或其他免疫球蛋白的类似位点上游的铰链区。在一个特别优选的实施方案中，将结合结构域氨基酸序列融合至IgG重链的(a)铰链区以及CH2和CH3，或者(b)CH1、铰链、CH2和CH3结构域。对于双特异性Fc融合蛋白，将Fc融合蛋白装配为多聚体，和特别地异二聚体或异四聚体。一般地，这些经装配的免疫球蛋白将会具有已知的单元结构。基本的四链结构单元为IgG、IgD和IgE所存在的形式。四链单元在更高分子量的免疫球蛋白中重复；IgM—般作为通过二硫键而联合在一起的四基本单元的五聚体存在。IgA球蛋白，和偶然地IgG球蛋白，也可以以多聚体形式存在于血清中。在多聚体的情况下，所述四单元中的每一个可以是相同的或不同的。在本文范围内的各种示例性的经装配的Fc融合蛋白示意性地图解如下(a)ACL-ACL;(b)ACH-(ACH，ACL-ACH，ACL-VHCH，或VLCL-ACH);(c)ACL-ACH-(ACL-ACH,ACL-VHCH，VLCL-ACH,或VLCL-VHCH);(d)ACL-雷H-(ACH,或ACL-VHCH，或VLCL-ACH);(e)VLCL-ACH-(ACL-VHCH,或VLCL-ACH);和(f)(A-Y)n-(VLCL-VHCH)2，其中每个A代表相同或不同的多肽，所述多肽包含下列氨基酸序列源自BLyS受体结构域的序列，源自针对BLyS或针对BLyS受体的抗体的序列，或者人工序列，例如式I、式II、式III、ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQIDNO5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQIDNO6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQIDNO7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQIDNO8)、ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQIDNO9)或在图32中所列出的序列，或其组合。VL为免疫球蛋白轻链可变结构域；VH为免疫球蛋白重链可变结构域；CL为免疫球蛋白轻链恒定结构域；CH为免疫球蛋白重链恒定结构域；n为大于l的整数；Y指明了共价交联剂的残基。为了简洁，上述结构只显示关键特征；它们没有标明免疫球蛋白的连接(J)或其他结构域，也没有显示二硫键。但是，当此类结构域是结合活性所必需的时，应当将它们构建成存在于它们在免疫球蛋白分子中所占据的通常位置中。备选地，可以将Fc序列插入在免疫球蛋白重链和轻链序列之间，从而获得包含嵌合重链的免疫球蛋白。在该实施方案中，在铰链和CH2结构域之间，或者在CH2和CH3结构域之间，将Fc序列融合至在免疫球蛋白的每个臂中的免疫球蛋白重链的3'末端。Hoogenboom等人，Mol.Immunol,28:1027-1037(1991)已净艮道了类似的构建体。虽然在本发明的Fc融合蛋白中免疫球蛋白轻链的存在不是必需的，但是可以存在免疫球蛋白轻链，其或者共价联合至结合结构域-免疫球蛋白重链融合多肽，或者直接融合至结合结构域。在前一种情况下，编码免疫球蛋白轻链的DNA通常与编码结合结构域-免疫球蛋白重链融合蛋白的DM—起共表达。在分泌后，所述杂合的重链和轻链将会共价联合，从而提供包含两个经二硫键连接的免疫球蛋白重链-轻链对的免疫球蛋白样结构。适合于制备此类结构的方法例如在于1989年3月28日授权的美国专利号4，816，567中公开。最方便地，通过将编码结合结构域部分的cDNA按阅读框架融合至免疫球蛋白cDNA序列来构建Fc融合蛋白。然而，也可以使用与基因组免疫球蛋白片段的融合(参见例如，Aruffo等人，Cell,61:1303-1313(1990);和Stamenkovic等人，Cell,66:1133-1144(1991))。后一种类型的融合要求存在用于表达的Ig调节序列。基于所发表的来自源于脾或外周血淋巴细胞的cDNA文库的序列，通过杂交或通过聚合酶链式反应(PCR)技术可以分离出编码IgG重链恒定区的cDNA。将编码所述Fc融合蛋白的结合结构域和免疫球蛋白部分的cDM串联插入到指导在所选宿主细胞中的有效表达的质粒载体中。进行了特定的修饰，以产生在形成用于在本发明中使用的融合分子(例如，BLyS和/或APRIL拮抗剂Fc融合分子)中有用的Fc序列。特别地，产生了六种形式的经修饰的人IgGlFc以用于形成Fc融合蛋白，并将它们命名为Fc-488以及Fc4、Fc5、Fc6、Fc7和Fc8。Fc-488(SEQIDNO:39)被设计用于方便地克隆包含人y1Fc区的融合蛋白，并且通过使用野生型人免疫球蛋白yl恒定区作为模板来构建它。对于由于未成对的半胱氨酸残基而引起的潜在有害影响的关注导致决定用丝氨酸残基替代通常与免疫球蛋白轻链恒定区形成二硫键的半胱氨酸。在编码EU索引(EUindex)位置218的密码子处引入另外的变化以引入BglII限制酶识别位点，从而方便将来的DNA操作。将这些变化被引入在PCR引物上所编码的PCR产物之中。由于BglII位点的位置并且为了使Fc铰链区完整，将EU索引位置216和217的密码子掺入到融合蛋白伙伴序列中。Fc4、Fc5和Fc6包含突变，以通过减少FcyRI结合和补体Clq结合来降低由Fc介导的效应子功能。Fc4包含被引入Fc-488中的相同氨基酸置换。引入另外的氨基酸置换以降低潜在的由Fc介导的效应子功能。特别地，引入三个氨基酸置换以减少FcyRI结合。这些为在EU索引位置234、235和237处的置换。在这些位置处的置换已显示减少了与FcyRI的结合(Duncan等人，Nature332:563(1988))。这些氨基酸置换还可以减少FcyRIIa结合，以及FcyRIII结合(Sondermann等人，Nature406:267(2000);Wines等人，J.Immunol.164:5313(2000))。几个小组已经描述了EU索引位置330和331(SEQIDNO:6的氨基酸残基134和135)在补体Clq结合和随后的补体固定中的相关性(Canfield和Morrison,J.Exp.Med.173:1483(1991);Tao等人，J.Exp.Med.178:661(1993))。在Fc4中引入在这些位置处的氨基酸置换以减少补体固定。Fc4的CH3结构域与在相应的野生型多肽中发现的相同，除了终止密码子外，所述终止密码子被从TGA改变为TAA以消除当所克隆的DM在大肠杆菌的dam+菌抹中生长时潜在的dam甲基化位点。在Fc5中，将EU索引位置218处的精氨酸残基突变回赖氨酸，因为在包含该特定Fc的融合蛋白中未使用BglII克隆流程。Fc5的其命部分与上面关于Fc4的描述相匹配。33Fc6与Fc5相同，除了已消除了羧基末端赖氨酸密码子外。常常在从B细胞中分泌之前在翻译后从成熟免疫球蛋白中去除成熟免疫球蛋白的C-末端赖氨酸，或者在血清循环期间去除。因此，在循环抗体上通常找不到C-末端赖氨酸残基。正如上面在Fc4和Fc5中，Fc6序列中的终止密码子被改变为TAA。Fc7与野生型ylFc相同，除了位于(:2结构域中的EU索引位置297处的氨基酸置换外。EU索引位置Asn-297是N-联碳水化合物附着位点。由于碳水化合物结构中潜在的批与批之间的(batch-to-batch)变化，因而N-联碳水化合物在重組表达的蛋白质中引入潜在的变异性来源。在消除这种潜在变异性的尝试中，将Asn-297突变为谷氨酰胺残基以防止N-联碳水化合物附着在该残基位置处。残基297处的碳水化合物还参与Fc与FcRIII的结合(Sondermann等人，Nature406:267(2000))。因此，一般地，碳水化合物的去除应当减少了包含重组Fc7的融合蛋白与FcyR的结合。如上面一样，将Fc7序列中的终止密码子突变为TAA。Fc8与seqidno:6中所显示的野生型免疫球蛋白y1区相同，除了在EU索引位置220处的半胱氨酸残基被丝氨酸残基替代外。该突变消除了通常与免疫球蛋白轻链恒定区形成二硫键的半胱氨酸残基。使用这些特定Fc结构域中的任一种来形成所述BLyS和/或APRIL拮抗剂在本发明的范围之内。本发明还考虑了这些分子的亮氨酸拉链形式。"亮氨酸拉链"是在本领域中用于指富含亮氨酸的序列的术语，所述富含亮氨酸的序列增强、促进或驱动其融合伙伴(例如，亮氨酸拉链所融合或连接至的序列或分子)的二聚化或三聚化。各种亮氨酸拉链多肽已在本领域中作了描述。参见例如，Landschulz等人，Science,240:1759(1988);美国专利5，716，805;W094/10308;Hoppe等人，FEBSLetters,344:1991(1994);Maniatis等人，Nature,341:24(1989)。本领域技术人员将会意识到，可以将亮氨酸拉链序列融合在本发明的多肽的5'或3'末端。还可以以这样的方式来修饰本发明的多肽，即通过将所述多肽融合至另一个异源多肽或氨基酸序列而形成嵌合分子。根据一些实施方案，此类异源多肽或氨基酸序列为发挥使嵌合分子低聚化的作用的多肽或氨基酸序列。在一些实施方案中，这样的嵌合分子包含所述多肽与标签多肽的融合，所述标签多肽提供了标签抗体可以选择性地与之结合的表位。该表位标签一般置于所述多肽的氨基或羧基末端。表位;示签的形式的存在。'此》卜，提供表位标i使得所述多肽能够容易地通过亲和纯化来进行纯化，其中使用标签抗体或与该表位标签结合的另一类型的亲和基质。各种标签多肽及其各自的抗体是本领域中众所周知的。例子包括多组氨酸(poly-his)或多组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；fluHA标签多肽及其抗体12CA5[Field等人，Mol.Cell.Biol.，8:2159-2165(1988)];c一myc标签及针对其的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体[Evan等人，MolecularandCellularBiology,5:3610-3616(1985)];和单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体[Paborsky等人，ProteinEngineering,3(6):547-553(1990)〗。其他标签多肽包括Flag-肽[Hopp等人，BioTechnology，6:1204-1210(1988)];KT3表位肽[Martin等人，Science,255:192-194(1992)];a-微管蛋白表位肽"[Skinner等人，J.Biol.Chem.，266:15163-15166(1991)];和T7基因10蛋白肽标签[Lutz-Freyermuth等人，Proc.Natl.Acad.Sci:USA,87:6393-6397(1990)]。肽-聚合物缀合物的构建在一些实施方案中，用于给合成肽缀合聚合物(例如PEG化)的策略在于，通过在溶液中形成缀合物连接来将肽和PEG部分相組合，它们各自携带有能相互反应的特殊官能度。可以用常规的固相合成而容易地制备所述肽。在特定位点处用合适的官能团来"预活化"所述肽。在与PEG部分反应之前，纯化并充分表征所述前体。所述肽与PEG的连接通常在水相中发生，并且可以通过反相分析型HPLC而容易地进行监测。PEG化的肽可以容易地通过制备型HPLC来进行纯化，并且通过分析型HPLC、氨基酸分析和激光解吸质镨法来进行表征。在一些实施方案中，主要依赖于反应条件、聚合物的分子量等，经由肽的一个或多个氨基酸残基将所述肽共价键合至聚合物上的末端反应性基团。具有反应性基团的聚合物在本文中被称为活化的聚合物。所迷反应性基团选择性地与所述肽上的游离氨基或其他反应性基团反应。潜在的反应位点包括N-末端氳基，赖氨酸残基上的e-氨基，以及其他氨基、亚氨基、羧基、巯基、羟基和其他亲水基团。然而，可以理解，为了获得最佳结果而选择的反应性基团的类型和数量以及所釆用的聚合物的类型将会依赖于所釆用的特定的肽，以避免使反应性基团与太多的在所述肽上的特别活跃的基团发生反应。在一些实施方案中，可以在适合于缀合的位置处置换反应性残基(例如，赖氨酸(K)、经修饰的非天然氨基酸或其他小分子)。在一些实施方案中，所述肽包含下列序列W005/000351的式I、式II、式III、ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQIDNO5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQIDNO6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQIDNO7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQIDNO8)、ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQIDNO9)、或在图32中所列出的序列，具有末端反应性基团。在一些实施方案中，所述肽包含至少一个，和更优选地多于一个的包含下列序列的多肽W005/000351的式I、式II、式III、ECFDLLVRAWVPCSVLK(SEQIDNO5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR(SEQIDNO6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQIDNO7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(SEQIDNO8)、ECFDLLVRHWVACGLLR(SEQIDNO9)、或在图32中所列出的序列。被连接在一起的多肽可以具有相同的序列或具有不同的序列和末端反应性基团。在一些实施方案中，这些多肽可以彼此连接，可选地，通过使用连接体。尽管缀合可以出现在所述多肽上的任何反应性氨基酸处，但在一些实施方案中，反应性氨基酸为赖氨酸，其通过其游离s-氨基而连接至活化的聚合物的反应性基团，或者为谷氨酸或天冬氨酸，其通过酰胺键而连接至所述聚合物。在一些实施方案中，所述肽的反应性氨基酸在位置X2和Xlz处不是半胱氨酸残基。与每种肽的聚合物缀合的程度将依赖于所述肽上反应位点的数目，聚合物的分子量、亲水性和其他特性，以及所选择的具体的肽衍生化位点。在一些实施方案中，所述缀合物具有1至io个聚合物分子/肽分子的最终摩尔比，但也考虑了更大数目的附着至本发明的肽的聚合物分子。在一些实施方案中，每个缀合物包含一个聚合物分子。通过使用实验矩阵(experimentalmatrix)(其中改变时间、温度和其他反应条件以改变置换的程度)容易地获得所希望的数量的衍生化，在这之后通过大小排阻层析或其他本领域中已知的手段来测定缀合物的聚合物取代的水平。在一些实施方案中，所述聚合物仅包含单个具有反应性的基团。这有助于避免蛋白质分子的交联。但是，在本文范围之内的是，使反应条件最大化以减少交联，或者通过凝胶过滤或离子交换色谱法来纯化反应产物以回收基本上同质的衍生物。在其他实施方案中，所述聚合物包含两个或更多个反应性基团，以便将多个肽连接至聚合物主链。再次，可以使用凝胶过滤或离子交换色谱法来以基本上均质的形式回收所希望的衍生物。在一些实施方案中，所述聚合物直接共价键合至所述肽，而不使用多官能的(通常双官能的)交联剂。在一些实施方案中，存在1:1的PEG链对肽的摩尔比。共价修饰反应可以通过一般用于使具有生物学活性的材料与惰性聚合物进行反应的任何合适的方法来进行，优选地，在约pH5-9,更优选地7-9，如果在所述肽上的反应性基团为赖氨酸基团。一般地，所述过程牵涉制备活化的聚合物(通常具有至少一个待活化的末端羟基的聚合物)，从该聚合物制备活性基材，和之后使所述肽与所述活性基材反应从而产生适合于配制的肽。上面的修饰反应可以通过几种方法来进行，所述方法可以牵涉一个或多个步骤。可以用于在一步反应中产生活化的聚合物的修饰试剂的例子包括氯化三聚氰酸(2，4，6-三氯-S-三溱)和氟化三聚氰酸。在一些实施方案中，修饰反应以两步发生，其中使聚合物首先与酸酐例如琥珀酸酐或戊二酸酐进行反应从而形成羧酸，然后使所述羧酸与能够与羧酸反应的化合物进行反应从而形成活化的聚合物，该活化的聚合物具有能够与所述肽反应的反应性酯基团。此类化合物的例子包括N-羟基琥珀酰亚胺、4-幾基-3-硝基苯磺酸等，并且优选地使用N-羟基琥珀酰亚胺或4-羟基-3-硝基苯磺酸。例如，可以在提高的温度，优选地约100-110'C下，使单甲基取代的PEG与戊二酸酐反应四小时。然后，在碳二亚胺试剂例如二环己基碳二亚胺或异丙基碳二亚胺存在下，使如此产生的单曱基PEG-戊二酸与N-羟基琥珀酰亚胺反应从而产生活化的聚合物，曱氧基聚乙二醇基-N-琥珀酰亚胺基戊二酸酯，它然后可以与GH反应。该方法在Abuchowski等人，CancerBiochem.Biophys.，7:175-186(1984)中详细作了描述。在另一个实施方案中，单曱基取代的PEG可以与戊二酸酐反应，随后在二环己基碳二亚胺存在下与4-羟基-3-硝基苯磺酸(HNSA)反应从而产生活化的聚合物。HNSA由Bhatnagar等人，Peptides:Synthesis-Structure-Function.ProceedingsoftheSeventhAmericanPeptideSymposium,Rich等人(编辑)(PierceChemicalCo.，Rockfordlll，1981)，第97-100页，以及在Nitecki等人，High-TechnologyRoutetoVirusVaccines(AmericanSocietyforMicrobiology:1986)，题名为"NovelAgentforCouplingSyntheticPeptidestoCarriersandItsApplications."中作了描述。在一些实施方案中，与氨基的共价结合通过基于氰尿酰氯、碳酰二咪唑、醛反应性基团(PEG醇盐+溴代乙醛的二乙基乙缩醛；PEG+DMS0和乙酸酐，或PEG氯化物+4-羟基苯甲醛的酚盐、活化的琥珀酰亚胺基酯，活化的二硫代碳酸酯PEG,2，4，5-三氯苯基氯曱酸酯或对硝基苯基氯甲酸酯活化的PEG)的已知化学来实现。通过使用碳二亚胺偶联PEG-胺来使羧基衍生化。通过偶联至经马来酰亚氨基取代的PEG(例如，烷氧基-PEG胺+4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-l-羧酸磺基琥珀酰亚胺基酯)(如在于1997年3月27日公布的WO97/10847中所描述的)，或者偶联至从NektarTechnologies,SanCarlos,CA(以前称为ShearwaterPolymers,Inc.)商购可得的PEG-马来酰亚胺来使巯基衍生化。备选地，可以将所述肽上的游离氨基(例如赖氨酸残基上的s-氨基)偶联至经N-羟基琥珀酰亚胺基取代的PEG(从NektarTechnologies可得的PEG-NHS),或者可以用2-亚氨基-四氩噻吩(Traut试剂)进行硫醇化，然后偶联至PEG的含有马来酰亚胺的衍生物，如在Pedley等人，Br.J.Cancer,70:1126-1130(1994)中所描述的。许多惰性聚合物(包括但不限于PEG)适合于在药物中使用。参见例如,Davis等人，BiomedicalPolymers:PolymericMaterialsandPharmaceuticalsforBiomedicalUse,第441-451页(1980)。在本发明的一些实施方案中，使用非蛋白质性质的聚合物。通常，非蛋白质性质的聚合物通常为亲水性的合成聚合物，即否则在自然界中找不到的聚合物。但是，存在于自然界中的并且通过重组或体外方法产生的聚合物也是有用的，如从天然来源分离出的聚合物。亲水性聚乙烯基聚合物在本发明的范围内，例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。特别有用的是聚亚烷基醚，例如聚乙二醇(PEG);聚氧化烯，例如聚氧乙烯、聚氧丙烯，以及聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物(Pluronics);聚甲基丙烯酸酯；卡波姆；支化的或非支化的多糖，其包含糖单体D-甘露糖、D-和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(例如，聚甘露糖醛酸或藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神经氨酸，包括同多糖和杂多糖，例如乳糖、支链淀粉、淀粉、羟乙基淀粉、直链淀粉、硫酸葡聚糖、葡聚糖、糊精、糖原或酸性粘多糖(例如，透明质酸)的多糖亚单位；糖醇的聚合物，例如聚山梨糖醇和聚甘露醇；肝素或乙酰肝素。缀合之前的聚合物不需要，但优选地，为水溶性的，但是最终的缀合物优选地为水溶性的。优选地，缀合物展示出至少约O.01mg/ml，和更优选地至少约O.1mg/ml，和更加优选地至少约lmg/ml的水溶解度。此外，聚合物在缀合物形式中不应是高度免疫原性的，也不应具有与静脉内输液、注射或吸入不相容的粘度，如果缀合物意欲通过此类途径进行施用的话。聚合物的分子量可以高至IOO，000D,和优选地至少约500D,或至少约1，000D，或至少约5，000D。在一些实施方案中，PEG或其他聚合物具有5000至20，000D的分子量。所选择的分子量可以依赖于待实现的缀合物的有效尺寸，聚合物的性质(例如，结构，例如线性或支化的)，和衍生化的程度，即聚合物分子的数目/肽，以及聚合物在肽上的附着位点。在一些实施方案中，支化的PEG可以用于引起肽的有效尺寸的大大增加。PEG或其他聚合物缀合物可以用于增加半衰期、增加溶解度、抵抗蛋白水解攻击和降低免疫原性。用于修饰本发明的肽的官能化的PEG聚合物是从NektarTechnologiesofSanCarlos,CA(以前称为ShearwaterPolymers,Inc.)可得的。此类商购可得的PEG衍生物包括但不限于，氨基-PEG、PEG氨基酸酯、PEG-N-羟基琥珀酰亚胺化学(NHS)、PEG-酰肼、PEG-硫醇、PEG-琥珀酸酯、羧曱基化的PEG、PEG-丙酸、PEG氨基酸、PEG琥珀酸琥珀酰亚胺基酯、PEG丙酸琥珀酰亚胺基酯、羧曱基化的PEG的琥珀酰亚胺基酯、PEG的碳酸琥珀酰亚胺基酯、氨基酸PEG的琥珀酰亚胺基酯、PEG-氧基羰基咪唑、PEG-碳酸硝基苯酯、PEG三氟乙磺酸酯、PEG-缩水甘油醚、PEG-醛、PEG乙烯基砜、PEG-马来酰亚胺、PEG-邻吡啶基二硫化物、杂官能的PEG、PEG乙烯基衍生物、PEG硅烷和PEGphospholides。用于偶联这些PEG衍生物的反应条件将会依赖于蛋白质、所希望的PEG化程度和所使用的PEG衍生物而变化。在选择PEG衍生物中所牵涉的因素包括所希望的附着点(例如，赖氨酸或半胱氨酸R-基团)，衍生物的水解稳定性和反应性，连接物的稳定性、毒性和抗原性，用于分析的适宜性等。关于使用任何特定衍生物的具体指导可从制造商处获得。所述缀合物可以通过SDS-PAGE、凝胶过滤、NMR、胰蛋白酶消化作图(trypticmapping)、液相色谦-质语法和体外生物学测定法来进行表征。例如，PEG缀合的程度可以通过SDS-PAGE和凝胶过滤来显示，然后通过NMR进行分析，该NMR具有关于PEG的亚曱基氢的特殊的共振峰。每个分子上PEG基团的数目可以由NMR镨或质谱法进行计算。合适地，在10mMTris-HClpH8.0，100mMNaCl(作为洗脱緩沖液)中进行在10%SDS中的聚丙烯酰胺凝胶电泳。为了证明哪个残基被PEG化了，可以进行胰蛋白酶消化作图。因此，在10QmM乙酸钠，10mMTris-HCl，1mM氯化钩，pH8.3中，在37T下，以100:1(以mg为基础)的蛋白质/酶比率，用胰蛋白酶消化PEG化的肽4小时，并且酸化至pH<4以终止消化，随后在HPLCNucleosilC-18(4.6mmxl50mm，5.mu.，100A)上进行分离。将色i昝图与非PEG化的起始材料的色镨图进行比较。然后，每个峰可以通过质谱法来进行分析，以验证该峰中的片段的大小。携带PEG基团的片段通常在注射后不滞留在HPLC柱上，并且从色镨上消失。这种从色谱上的消失是在应当包含至少一个赖氨酸残基的那个特定片段上的PEG化的指征。然后，可以通过常规方法就与BLyS结合的能力来分析PEG化的肽。在一些实施方案中，通过离子交换色谱法(例如离子交换HPLC)来纯化缀合物。许多经亲电活化的PEG的化学导致PEG化的产物的氨基负荷减少。因此，可以使用高分辨率离子交换色谱法来分开游离的和缀合的蛋白质，并且分辨出具有不同PEG化水平的种类。事实上，由于未反应的氨基酸的离子特性的差异，分辨不同的种类(例如，包含一个或两个PEG残基)也是可能的。在一个实施方案中，根据WO96/34015(国际申请号PCT/US96/05550，1996年10月31日公布)中所描述的方法来分辨具有不同PEG化水平的种类。以相同的方式，相互纯化出异质的缀合物种类。在一些实施方案中，PEG-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与伯胺(例如赖氨酸和N-末端)反应。在一些实施方案中，PEG-NHS与多肽的C-末端赖氨酸(K)反应。在一些实施方案中，将赖氨酸残基添加至所迷17聚体多肽的C-末端，而在其他实施方案中，Xi被赖氨酸置换。在一些实施方案中，聚合物与N-末端反应。在一个优选的实施方案中，通过在下面实施例中所描述的衍生化和纯化方法来产生缀合物。在一个方面，本发明提供了任何由其组成部分(即一个或多个共价附着于一个或多个聚合物分子的肽)形成的上面所描述的缀合物，在所述缀合物的共价分子结构中没有任何无关物质。本发明的方法和制品使用或掺入了抗体，所述抗体与BLyS或者其三种受体中的一种或多种结合。因而，将在此处描述用于产生此类抗体的方法。用于产生或筛选抗体的BLyS或BLyS受体可以例如是包含所希望的表位的抗原或其部分的可溶性形式。如在上面所描述的，BLyS序列和BLyS受体序列是已知的，如这些多肽的各种结构域的边界是已知的一样。可以将细胞外结构域(ECD)的肽片段用作免疫原。基于这些已知的序列和结构域描绘，本领域技术人员可以表达出BLyS或BLyS受体多肽及其片段以用于产生抗体。为了产生针对BLyS或其受体的抗体，可以将全长多肽或者长度为6个或更多个残基的肽片段用作免疫原，以在啮齿动物(包括小鼠、仓鼠和大鼠)中，在兔、山羊或其他合适的动物中引起抗体。可以在合适的宿主细胞例如细菌或真核细胞中表达可溶性BLyS或BLyS受体多肽或其免疫原性片段。在一个实施方案中，在大肠杆菌中产生人和鼠类的经去污剂增溶的全长BLyS，并用于免疫接种和筛选产生BLyS抗体的杂交瘤。备选地，或者另外地，可以将在其细胞表面上表达BLyS或BLyS受体的B细胞或细胞系用于产生和/或篩选抗体。可用于产生抗体的其他形式的BLyS对于本领域技术人员来说是显而易见的，例如噬菌体展示方法也可以用于产生BLyS结合抗体。结合BLyS或BLyS受体的抗体可以是嵌合的、人源化的或人的。此类抗体和产生它们的方法在下面更详细地进4于描述。优选地，通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂，在动物体中引起多克隆抗体。将相关抗原缀合至在待进行免疫接种的物种中具有免疫原性的蛋白质(例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛曱状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)可以是有用的，其中使用双官能或衍生化试剂例如马来酰亚氨基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、S0C12或R1N-C-NR,其中R和IT为不同的垸基。通过将例如100wu或5g的蛋白质或缀合物(分别对于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂相组合并在多个位点处皮内注射溶液，而针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物对动物进行免疫接种。一个月后，用1/5至1/10原始量的在弗氏完全佐剂中的肽或缀合物，通过在多个位点处进行皮下注射来对动物进行加强免疫。7至14天后，抽取动物的血液，并就抗体滴度来分析血清。对动物进行加强免疫直至滴度的稳定水平。优选地，用相同的但缀合至不同蛋白质和/或通过不同交联剂的抗原的缀合物来对动物进行加强免疫。也可以在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物来制备缀合物。此外，聚集剂(aggregatingagent)例如明矾也合适地用于增强免疫应答。从基本上同质的抗体的群体中获得单克隆抗体，即包含该群体的那些独个抗体是同样的，除了可能的天然出现的突变外，所述突变可以以较少的量存在。因此，修饰词"单克隆的"将抗体的特征指明为不是互不相关的抗体的混合物。例如，单克隆抗体可以通过使用首次由Kohler等人，Nature,256:495(1975)所描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利号4，816，567)来制备。在杂交瘤方法中，如上面所描述的，对小鼠或其他合适的宿主动物例如仓鼠进行免疫接种以引发产生或能够产生抗体的淋巴细胞，所述抗体将会特异性地与用于免疫接种的蛋白质结合。备选地，可以在体外对淋巴细胞进行免疫接种。然后，使用合适的融合试剂(例如聚乙二醇)，使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合从而形成杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,第59-103页(AcademicPress,1986))。将如此制备的杂交瘤细胞接种在合适的培养基中并使其生长，所述培养基优选地包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄噤呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶这种酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将会包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。优选的骨髓瘤细胞为这样的那些骨髓瘤细胞，所述骨髓瘤细胞有效地进行融合，支持由所选择的抗体生成细胞稳定而高水平地产生抗体，并对培养基例如HAT培养基敏感。在这些骨髓瘤细胞中，优选的骨髓瘤细胞系为鼠类骨髓瘤系，例如源自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(从SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,CaliforniaUSA可获得)的那些，和SP-2或X63-Ag8-653细胞(从AmericanTypeCultureCollection,Rockville，MarylandUSA可获得)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系也被描述用于产生人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等人，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,第51-63页(MarcelDekker，Inc.，NewYork,1987)。就针对所迷抗原的单克隆抗体的产生而言，对其中正生长着杂交瘤细胞的培养基进行分析。优选地，通过免疫沉淀或者通过体外结合测定法，例如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，来测定由杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson等人，Anal.Biochem.，107:220(1980)的斯卡查德分析(Scatchardanalysis)来进行测定。在鉴定出了产生具有所希望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，所述克隆可以通过有限稀释程序进行亚克隆并且通过标准方法进行生长(Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPractice,笫59-103页(AcademicPress,1986))。用于该目的的合适的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以作为在动物中的腹水瘤在体内生长。合适地通过常规的免疫球蛋白纯化程序例如A蛋白-Sepharose、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和层析，从培养基、腹水或血清中分离出由亚克隆所分泌的单克隆抗体。通过使用常规的程序而容易地分离出编码单克隆抗体的DNA并进行测序(例如，通过使用能够与编码鼠类抗体的重链和轻链的基因特异性地结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞充当此类DNA的优选的来源。一旦经分离，就可以将DNA放置入表达载体中，随后将所述表达载体转染入否则不产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以获得在重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。关于在细菌中重组表达编码抗体的DM的综述文章包括Skerra等人，Curr.OpinioninIm隨o1.,5:256-262(1993)，和Pluckthun，ImmunolRevs.，130:151-188(1992)。在进一步的实施方案中，抗体或抗体片段可以分离自通过使用在McCafferty等人，Nature,348:552-554(1990)中所描述的技术而产生的抗体噬菌体文库。Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)描述了使用噬菌体文库来分别分离鼠类和人抗体。随后的出版物描迷了通过链改组(chainshuffling)(Marks等人,BiolZ'echraology，10:779-783(1992))，以及作为用于构建非常大的噬菌体文库的组合感染和体内重组(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.，21:2265-2266(1993))，来产生高亲和力(nM范围)的人抗体。因此，这些技术是对于用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行的备选方案。还可以^修饰DM，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源的鼠类序列(美国专利号4，816，567;Morrison等人，Proc.NatlAcad.Sci.USA,81:6851(1984))，或者通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分共价连接至编码免疫球蛋白的序列。通常，用这样的非免疫球蛋白多肽代替抗体的恒定结构域，或者用它们代替抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，从而形成嵌合的二价抗体，其包含一个对于抗原具有特异性的抗原结合位点和另一个对于不同抗原具有特异性的抗原结合位点。用于使非人抗体人源化的方法已在本领域中进行了描述。优选地，人源化抗体具有一个或多个被从非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常被称作"输入(import)，，残基，其通常取自"输入，，可变结构域。可以基本上依照Winter及合作者(Jones等人，Nature,321:522-525(1986);Riechmann等人，Nature,332:323-327(1988);Verhoeyen等人，Science,239:1534-1536(1988))的方法，通过用高变区序列代替人抗体的相应序列，来进行人源化。因此，此类"人源化"抗体为嵌合抗体(美国专利号4，816，567)，其中，实质上小于完整的人可变结构域被来自非人物种的相应序列所代替。实际上，人源化抗体通常为这样的人抗体，其中某些高变区残基和可能地某些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基所代替。待用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链)的选择对于降低抗原性是非常重要的。根据所谓的"最佳适配(best-fit)"方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库来对啮齿动物抗体的可变结构域的序列进行筛选。然后，将最接近啮齿动物序列的人序列当作用于人源化抗体的人构架区(FR)(Sims等人，J.Immunol.,151:2296(1993);Chothia等人，J.Mol.Biol.，196:901(1987))。另一种方法使用特定的构架区，其源自轻链或重链的特定亚群的所有人抗体的共有序列。相同的构架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等人，Proc.Natl.Acad,Sci.USA，89:4285(1992);Presta等人，J.Immunol.，15-1:2623(1993))。进一步重要的是，可以在使抗体人源化的同时保留对于抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。为了达到这个目标，根据优选的方法，通过下列方法来制备人源化抗体，即使用亲本和人源化序列的三维模型来分析亲本序列和各种概念上的人源化产品。三维免疫球蛋白模型是通常可得的，并且是本领域技术人所熟悉的。图解并展示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可得的。检查这些展示使得能够分析所述残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式，可以从受者和输入序列中选择出FR残基并将它们相组合，从而获得所希望的抗体特征，例如增加的对于耙抗原的亲和力。一般地，高变区残基直接且最实质上地参与影响抗原结合。作为人源化的一个备选方案，可以产生人抗体。例如，现在可以产生在免疫接种后能够在没有内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的完全储库的转基因动物(例如，小鼠)。例如，已描述了，在嵌合的和种系突变型的小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这样的种系突变型小鼠中将会导致在抗原攻击后产生人抗体。参见例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci,USA，90:2551(1993);Jakobovits等人，Nature,362:255-258(1993);Bruggermann等人，YearinI謹no.，7:33(1993);和美国专利号5，591，669、5，589,369和5,545，807。备选地，可以使用噬菌体展示技术(McCafferty等人，Nature348:552-553(1990))来从来自未免疫接种的供者的免疫球蛋白可变(V)结构域基因储库中在体外产生人抗体和抗体片段。根据该技术，将抗体V结构域基因按阅读框架克隆入丝状噬菌体(例如，M13或fd)的大或小外壳蛋白基因中，并作为功能性抗体片段而展示在噬菌体颗粒的表面上。因为所述丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能特性的选择也导致选择出编码显示那些特性的抗体的基因。因此，所述噬菌体模拟了B细胞的某些特性。噬菌体展示可以以各种形式来施行；关于其综述，参见例如Johnson,KevinS.和Chiswell，DavidJ.，CurrentOpinioninStructuralBiology3:564-571(1993)。V-基因区段的几种来源可用于噬菌体展示。Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)从V基因(源自经免疫接种的小鼠的脾)的小随机组合文库中分离了各种各样的一系列抗喁唑酮抗体。可以构建来自未免疫接种的人供者的V基因储库，并且可以基本上依照由Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)，或Griffith等人，薩0J.12:725-734(1993)所描述的技术，分离出针对各种各样的一系列抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利号5，565,332和5，573，905。也可以通过体外激活的B细胞来产生人抗体(参见美国专利5，567，610和5，229，275)。已开发了各种技术用于产生抗体片段。传统地，经由完整抗体的蛋白水解消化而得到这些片段(参见例如，Morimoto等人，JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992)，和Brennan等人，Science,229:81(1985))。然而，现在可以通过重组宿主细胞而直接产生这些片段。例如，可以从上面所讨论的抗体噬菌体文库中分离出抗体片段。备选地，可以直接从大肠杆菌中回收Fab'-SH片段，并进行化学偶联从而形成F(abO;片段(Carter等人，Bio/Technology10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物中直接分离出F(ab')2片段。用于产生抗体片段的其他技术对于技术人员来说将会是显而易见的。在其他实施方案中，所选择的抗体为单链Fv片段(scFv)。参见W093/16185;美国专利号5，571，894;和美国专利号5，587，458。抗体片段还可以为"线性抗体"，例如，如在美国专利5，641，870中所描述的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。双特异性抗体为对于至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。示例性的双特异性抗体可以与B细胞表面标志物的两种不同表位结合。其他的此类抗体可以结合第一B细胞标志物和进一步结合第二B细胞表面标志物。备选地，抗B细胞标志物结合臂可以与结合白细胞上的触发分子(triggeringmolecule)的臂相组合，所述触发分子例如为T-细胞受体分子(例如，CD2或CD3)，或关于IgG的Fc受体(FcyR)，例如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16)，以l更使细胞防御机制集中于B细胞。双特异性抗体也可以用于将细胞毒剂定位至B细胞。这些抗体拥有结合B细胞标志物的臂和结合细胞毒剂(例如，肥急草毒蛋白、抗干扰素、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、氨曱蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab02双特异性抗体)。用于制备双特异性抗体的方法在本领域中是已知的。全长双特异性抗体的传统产生过程基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中该两条链具有不同的特异性(Millstein等人，Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化(其通常通过亲和层析步骤来进行)是相当繁瑣的，并且产物产量低。在WO93/08829中，和在Traunecker等人，EMB0J.，10:3655-3659(1991)中公开了相似的程序。根据一种不同的方法，将具有所希望的结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)融合至免疫球蛋白恒定结构域序列。优选地，该融合物具有包含至少一部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域。优选的是，具有第一重链恒定区(CH1)，其包含对于在所述融合物的至少一个中存在的轻链结合而言所必需的位点。将编码免疫球蛋白重链融合物(和免疫球蛋白轻链，如果需要)的DNA插入到分开的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。这在当在构建中所使用的不等比率的三种多肽链提供了最佳产量这样的实施方案中，在调整所述三种多肽片段的相互比例方面提供了极大的灵活性。然而，当至少两种多肽链以等比率进行表达导致高产量或者当所述比率不是特别重要时，可以将两种或所有三种多肽链的编码序列插入到一个表达载体中。在该方法的一个优选的实施方案中，双特异性抗体由在一个臂中的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和在另一个臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现这种不对称的结构有助于将所希望的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开，因为仅在所述双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链提供了一种容易做到的分离方式。该方法公开在WO94/04690之中。关于产生双特异性抗体的进一步的细节，参见例如Suresh等人，MethodsinEnzymology，121:210(1986)。根据在美国专利号5，731,168中所描迷的另一种方法，可以改造抗体分子对之间的界面以使从重組细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面至少包含抗体恒定结构域的CH3结构域的部分。在该方法中，来自第一抗体分子的界面的一个或多个小的氨基酸侧链被更大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替代。通过用更小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替代大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生具有与所述大侧链相同或相似的大小的补偿性"空穴"。这为将异二聚体的产量增加超过其他不想要的最终产物(例如同二聚体)提供了机制。双特异性抗体包括交联的抗体或"杂缀合物(heteroconjugate)"抗体。例如，可以将杂缀合物中的抗体之一偶联至抗生物素蛋白，另一个偶联至生物素。此类抗体例如已被建议用于使免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利号4，676，980)，和用于治疗HIV感染(W091/00360、W092/200373和EP03089)。可以使用任何简便的交联方法来制备杂缀合物抗体。合适的交联剂在本领域中是众所周知的，并且在美国专利号4，676，980中与许多交联技术一起被公开。用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术已在文献中作了描述。例如，可以采用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等人，Science,229:81(1985)描述了其中对完整抗体进行蛋白水解切割以产生F(ab')2片段的程序。在二巯基络合剂((Uthiolcomplexingagent)亚砷酸钠存在下使这些片段还原，以稳定邻近的二巯基和防止分子间二硫化物的形成。然后，将所产生的FaV片段转化成硫代硝基苯曱酸酯(TNB)衍生物。然后，通过用巯基乙胺进行还原而将Fab'-TNB衍生物之一再转变成Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一Fab'-TNB衍生物相混合以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可以被用作用于酶的选择性固定化的试剂。最近的进展已促进了从大肠杆菌中直接回收FaV-SH片段，所述Fab'-SH片段可以进行化学偶联以形成双特异性抗体。Sha1aby等人，J.Exp.Med.,175:217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(abO2分子的产生。每个FaV片段分开地从大肠杆菌中分泌，并在体外经历直接化学偶联而形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够与过表达ErbB2受体的细胞和正常的人T细胞结合，以及触发人细胞毒性淋巴细胞对于人乳腺肿瘤靶标的裂解活性。还已描述了用于直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，已通过使用亮氨酸拉链来产生了双特异性抗体。Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽连接至两个不同抗体的Fab'部分。在铰链区使抗体同二聚体还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。该方法也可以用于产生抗体同二聚体。由Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993)所描述的"双抗体"技术为制备双特异性抗体片段提供了备选的机制。所述片段包含通过连接体而联接至轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)，所述连接体太短以致不能允许在同一条链上的两个结构域之间进行配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一个片段的互补的VL和VH结构域进行配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了用于通过使用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等人，J.Immunol,152:5368(1994)。考虑了具有超过两价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991)。考虑了此处所描述的蛋白质或肽拮抗剂和抗体的氨基酸序列修饰。例如，可以希望改善BLYS结合抗体或拮抗剂的结合亲和力和/或其他生物学特性。通过将合适的核苷酸变化引入拮抗剂核酸中，或者通过肽合成，来制备拮抗剂的氨基酸序列变体。此类修饰包括，例如在拮抗剂的氨基酸序列中的残基的删除和/或插入和/或置换。进行删除、插入和置换的任何组合以获得最终的构建体，条件是所述最终的构建体拥有所希望的特征。氨基酸变化还可以改变拮抗剂的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数目或位置。用于鉴定拮抗剂的作为优选的诱变位置的某些残基或区域的一种有用方法称为"丙氨酸扫描诱变法"，如由Cunningham和Wells，Science,244:1081-1085(1989)所描述的。在此，鉴定出一个或一组耙残基(例如，带电荷的残基例如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选地，丙氨酸或聚丙氨酸)来替代之以影响所述氨基酸与抗原的相互作用。然后，通过在置换位点处或者为置换位点引入进一步的或其他的变体，来对那些显示出对于置换的功能敏感性的氨基酸位置进行细化。因此，虽然用于引入氨基酸序列变化的位点是预先确定的，但是突变本身的性质不需要预先确定。例如，为了分析在给定位点处的突变的性能，在靶密码子或区域处进行丙氨酸扫描或随机诱变，并且就所希望的活性来对所表达的拮抗剂变体进行筛选。氨基酸序列插入包括长度为一个残基到包含成百或更多残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的拮抗剂或者融合至细胞毒性多肽的拮抗剂。拮抗剂分子的其他插入性变体包括将酶或增加拮抗剂的血清半衰期的多肽融合至拮抗剂的N-或C-末端。另一种类型的变体是氨基酸置换变体。这些变体具有至少一个在拮抗剂分子中的被不同残基替代的氨基酸残基。最令人感兴趣的用于抗体拮抗剂的置换诱变的位点包括高变区，但也考虑FR改变。保守置换显示在表l中的标题"优选的置换"之下。如果此类置换导致生物学活性的变化，那么可以引入更多的实质性变化(在表l中命名为"示例性的置换"，或如在下文中关于氨基酸类别而进一步描述的)，并筛选产物。拮抗剂的生物学特性的实质性修饰通过选择这样的置换来实现，所述置换在它们对于维持下列方面的影响方面显著不同(a)置换区域中的多肽主链的结构，例如，作为片层或螺旋构象，(b)所述分子在靶位点处的电荷或疏水性，或者(c)侧链的体积。基于共有的侧链特性，将天然出现的残基分成組(l)疏水性的正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile;(2)中性且亲水性的cys、ser、thr;(3)酸性的asp、glu;(4)碱性的asn、gln、his、lys、arg;(5)影响链取向的残基gly、pro;和(6)芳香族的trp、tyr、phe。非保守置换将会导致这些类别之一的成员交换成另一类别的成员。还可以置换不参与维持拮抗剂的正确构象的任何半胱氨酸残基(通常用丝氨酸来置换)，以改善所述分子的氧化稳定性和防止异常的交联。反过来，可以向拮抗剂添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当所述拮抗剂为抗体片段例如Fv片段时)。置换变体的一种特别优选的类型牵涉置换亲本抗体的一个或多个高变区残基。一般地，所得的被选择用于进一步开发的变体将会具有相对于亲本抗体(它们从中产生)而言经改善的生物学特性。用于产生此类置换变体的一种简便的方法为通过使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，使几个高变区位点(例如，6-7个位点)发生突变以在每个位点处产生所有可能的氨基酸置换。作为包装在每个颗粒中的与M13的基因III产物的融合物，将如此产生的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒进行展示。然后，就此处所公开的其生物学活性(例如，结合亲和力)对经噬菌体展示的变体进行筛选。为了鉴定出用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对于抗原结合作出显著贡献的高变区残基。备选地，或者另外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定出抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。此类接触残基和相邻残基是用于置换的候选者，根据此处所阐述的技术。一旦产生了此类变体，就使变体小组经历此处所描述的筛选，并且可以在一个或多个相关测定法中选择出具有优异特性的抗体以用于进一步的开发。拮抗剂的另一种类型的氛基酸变体改变拮抗剂的原始糖基化模式。"改变"意味着删除一个或多个在所述拮抗剂中发现的碳水化合物部分，和/或添加一个或多个在所述拮抗剂中不存在的糖基化位点。多肽的糖基化通常为N-联或O-联的。N-联是指碳水化合物部分附着至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列"天冬酰胺-X-丝氨酸"和"天冬酰胺-X-苏氨酸，，(其中，X为除了脯氨酸之外的任意氨基酸)为碳水化合物部分酶促附着至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，这些三肽序列中的任一个在多肽中的存在形成了潜在的糖基化位点。0-联糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖这些糖之一附着至羟基氨基酸，最通常为丝氨酸或苏氨酸，虽然也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。通过改变氨基酸序列从而使得其包含一个或多个上面所描述的三肽序列，方便地实现向拮抗剂添加糖基化位点(对于N-联糖基化位点)。所述改变也可以通过向原始拮抗剂的序列添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或者用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基进行置换来进行(对于0-联糖基化位点)。通过各种本领域中已知的方法来制备编码拮抗剂的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于从天然来源中分离(在天然出现的氨基酸序列变体的情况下)，或者通过早先制备的变体或非变体形式的拮抗剂的寡核苷酸介导的诱变(或位点定向诱变)、PCR诱变和盒式诱变进行制备。可以希望就效应子功能对本发明的拮抗剂进行修饰，例如，以便增强拮抗剂的依赖抗体的细胞毒性(ADCC)和/或依赖补体的细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体拮抗剂的Fc区中引入一个或多个氨基酸置换来达到。备选地，或者另外地，可以将半胱氨酸残基引入到Fc区中，从而允许在该区域中形成链间二硫键。如此产生的同二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或增加的由补体介导的细胞杀伤和依赖抗体的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人，J.ExpMed.176:1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)。还可以使用在Wolff等人，CancerResearch53:2560-2565(1993)中所描述的异双官能交联剂来制备具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体。备选地，可以改造出这样的抗体，其具有双重Fc区并由此可以具有增强的补体裂解和ADCC能力。参见Steve扁n等人，Anti-CancerDrugDesign3:219-230(1989)。为了增加拮抗剂的血清半衰期，可以将补救受体结合表位(salvagereceptorbindingepitope)捧入到户斤述枯抗齐'J(尤其是抗体片段)中，例如，如在美国专利5，739,277中所描述的。如在本文中所使用的，术语"补救受体结合表位"是指IgG分子(例如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的这样的表位，其负责增加所述IgG分子的体内血清半衰期。测定法通过计数003-/0040+细胞的？人03方法来测定外周8-细胞浓度。可以通过下述的门控(gating)策略来获得样品中总淋巴细胞的CD3-CD40+B细胞百分比。在前向散射/侧向散射散射图上对淋巴细胞群进行标记以定义区域1(RU。通过使用RI中的事件，关于CD"和CD3标志物，展示出荧光密度点图。使用经荧光标记的同种型对照来确定关于CD40和CD3阳性的各自的截止点。FACS分析洗涤50万个细胞并重悬浮于1001的FACS緩沖液中，所述FACS緩冲液为具有1%BSA的磷酸緩沖盐水，其包含5ul的染色或对照抗体。所有染色抗体(包括同种型对照)从PharMingen，SanDiego，CA获得。通过用Rituxan(美罗华)以及缀合有FITC的抗人IgGl二抗进行染色来评估人BLYS表达。使用FACScan和Cel1Quest(BectonDickinsonImmunocytometrySystems,SanJose，CA)来进行FACS分析。以前向和侧向光散射来定义所有淋巴细胞，而用细胞表面上B220的表达来定义所有B淋巴细胞。通过下列方式来评估B细胞耗竭和回收在注射后第一周每天和此后每周，分析外周B细胞计数和用FACS分析脾、淋巴结和骨髓中的hBLYS+B细胞。监测所注射的2H7变体抗体的血清水平。药物制剂通过将具有所希望的纯度的抗体与可选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳、定齐寸(Reraitgtorz'sPhamamaceuticalScience,第16版，Osol，A.编辑(198(J))相混合，以冻干制剂或水溶液的形式制备BLyS和/或APRIL拮抗剂(例如根据本发明所使用的BLyS结合抗体)的治疗制剂，以用于贮藏。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对于受者是无毒的，并且包括緩冲液，例如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基千基铵；六甲氯铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯类，例如对羟基苯曱酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间曱酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA;糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属复合物(例如锌-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如TWEEN、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。此处的制剂还可以包含超过一种活性化合物(对于正进行治疗的特定适应症而言所需要的)，优选地为具有不会不利地相互影响的互补活性的那些。例如，可以希望进一步提供细胞毒剂、化学治疗剂、细胞因子或免疫抑制剂(例如，作用于T细胞的那种，例如环孢菌素，或结合T细胞的抗体，例如结合LFA-1的那种)。此类其他试剂的有效量依赖于存在于制剂中的抗体的量、疾病或病症或者治疗的类型、和其他上面所讨论的因素。一般地，这些试剂以相同的剂量和用此处所描述的施用途径，或者以约1至99%的迄今所采用的剂量进行使用。还可以将活性成分包载入例如通过凝聚(coacervation):技术或通过界面聚合而制备的微胶嚢中，例如，分别为羟甲基纤维素或明胶微胶嚢和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶嚢，包载入胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳状液、纳米颗粒和纳米胶嚢)中，或者包载入粗乳状液中。此类技术公开在Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osol，A.编辑(1980)中。可以制备緩释制剂。緩释制剂的合适例子包括包含拮抗剂的固体疏水性聚合物的半渗透性基体，所述基体以成形的物品例如膜或微胶嚢的形式存在。緩释基体的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利号3，773,919)、L谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRONDEPOT(可注射的微球，其由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。用于体内施用的制剂必须是无菌的。这经由通过无菌滤膜进行过滤而容易地实现。疾病治疗疾病本发明的免疫抑制药物和BLyS和/或APRIL拮抗剂可用于治疗由B细胞调节的自身免疫病症。由B细胞调节的自身免疫疾病包括关节炎(类风湿性关节炎，青少年类风湿性关节炎，骨关节炎，银屑病关节炎)，银屑病，皮炎(包括特应性皮炎)；慢性自身免疫性荨麻疹，多肌炎/皮肌炎，中毒性表皮坏死溶解，全身性硬皮病和硬化，与炎症性肠病(IBD)(克罗恩病，溃疡性结肠炎)相关的反应，呼吸窘迫综合征，成人型呼吸窘迫综合征(ARDS)，脑膜炎，变应性鼻炎，脑炎，葡萄膜炎，结肠炎，肾小球肾炎，过敏性病状，湿疹，哮喘，牵涉T细胞浸润和慢性炎症反应的病状，动脉粥样硬化，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，系统性红斑狼疮(SLE)，狼疳(包括肾炎，非肾的，盘状的，脱发)，青少年糖尿病，多发性硬化症，变应性脑脊髓炎，与由细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫应答，结核病，结节病，肉芽肺病(包括韦格纳肉芽肺病)，粒细胞缺乏，脉管炎(包括ANCA)，再生障碍性贫血，Coombs阳性贫血，戴-布贫血，免疫性溶血性贫血(包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA))，恶性贫血，纯红细胞再生障碍(PRCA)，因子VIII缺乏，血友病A，自身免疫性中性白细胞减少症，各类血细胞减少症，白细胞减少症，牵涉白细胞渗出的疾病，CNS炎性病症，多器官损伤综合征，重症肌无力，由抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，抗磷脂抗体综合征，变应性神经炎，Bechet病，卡斯尔曼综合征，兰-伊肌无力综合征，Reynaud，s综合征，Sjorgen's综合征，斯-约综合征，固体器官移植排斥(包括关于高小組反应性抗体(highpanelreactiveantibody)滴度，IgA在組织中的沉积等的预处理)，移植物抗宿主病(GVHD)，大疱性类天疱疮，天疱疮(所有的，包括寻常性的，落叶性的)，自身免疫性多内分泌腺病，赖特尔病，僵人综合征，巨细胞动脉炎，免疫复合物肾炎，IgA肾病，IgM多发性神经病或由IgM介导的神经病，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，血栓性血小板减少性紫癜(TTP),自身免疫性血小板减少症，睾丸和卵巢的自身免疫疾病(包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎)，原发性甲状腺机能减退；自身免疫性内分泌疾病，包括自身免疫性甲状腺炎，慢性甲状腺炎(桥本曱状腺炎)，亚急性曱状腺炎，特发性曱状腺机能减退，艾迪生病，格雷夫斯病，自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌病综合征)，I型糖尿病(也称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM))和希恩综合征；自身免疫性肝炎，淋巴样间质性肺炎(HIV)，闭塞性细支气管炎(非移植的)对NSIP，吉-巴综合征，大血管脉管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安)动脉炎，中血管脉管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎)，强直性脊椎炎，贝格尔病(IgA病)，急进性肾小球肾炎，原发性胆汁性肝硬化，乳糜泻(麸质性肠病)，冷球蛋白血症，ALS，冠状动脉疾病。所希望的B-细胞耗竭水平将依赖于疾病。优选地，B细胞耗竭足以阻止疾病进展至少2个月，更优选地3个月，更加优选地4个月，更优选地5个月，更加优选地6个或更多个月。在一个更加优选的实施方案中，B细胞耗竭足以使緩解时间增加至少6个月，更优选地9个月，更优选地l年，更优选地2年，更优选地3年，更加优选地5或更多年。在最优选的实施方案中，B细胞耗竭足以治愈所述疾病。在优选的实施方案中，自身免疫患者中的B细胞耗竭至少暂时地为治疗前基线水平的约75%，和更优选地80%、85%、亂95%、99%和甚至100%。对于治疗自身免疫疾病，可以希望通过调整免疫抑制药物或者BLyS和/或APRIL拮抗剂的剂量而根据所述疾病和/或个体患者中病状的严重度来调节B细胞耗竭的程度。因此，B细胞耗竭可以但并非必须是完全的。或者，在初始治疗中可以希望全部的B细胞耗竭，但在随后的治疗中可以调整剂量以达到仅部分的耗竭。在一个实施方案中，B细胞耗竭为至少20%,即相比于治疗前的基线水平而言保留了80%或更少的B-细胞。在另一个实施方案中，B-细胞耗竭为25。/。、30%、40%、50%、60%、70%或更大。优选地，B细胞耗竭足以使所述疾病的进展停止，更优选地，减轻处于治疗下的特定疾病的征候和症状，更加优选地，治愈所述疾病。对于治疗应用，本发明的免疫抑制药物和BLyS和/或APRIL拮抗剂组合物可以以与另外的药物例如抗炎药(包括DMARDS和其他生物制品)的联合疗法形式进行使用。前面的治疗方法可以与用于自身免疫疾病的其他形式的常规疗法相联合地施行，与常规疗法相连续地、在常规疗法之前或在常规疗法之后。如果在施用了本发明的组合物后相比于治疗前而言在症状或其他适用的标准方面存在有可测量的改善，那么通过本发明的方法减轻了或成功地治疗了患者的由B细胞调节的自身免疫疾病。治疗的效果可以在施用本发明的組合物之后3-10周内是明显的。每种疾病的适用标准对于相称领域中的专业医生来说将是熟知的。例如，医生可以就疾病的临床或血清学证据(例如，疾病的血清学标志物、全血细胞计数(包括B细胞计数)和血清免疫球蛋白水平)来对所治疗的患者进行监测。疗的小鼠中降低。同样地，响应于atacicept治疗的人患者显示出血清IgG和IgM水平的降低。用于评估自身免疫疾病或自身免疫相关疾病的治疗的功效或成功的参数对于相称疾病中的专业医生来说将是已知的。一般地，专业医生将会期望所述特定疾病的征候和症状的减少。下面通过实例来进行说明。类风湿性关节炎(RA)是一种病因学未知的自身免疫病症。大多数RA患者遭受疾病的慢性过程，其(甚至在接受治疗的情况下)可以导致进行性关节破坏、变形、残疾和甚至过早死亡。RA疗法的目标为防止或控制关节损伤、防止功能丧失和减少疼痛。RA的初始疗法常常牵涉施用一种或多种下列药物非类固醇抗炎药(NSAID)、糖皮质激素(经由关节注射)和低剂量泼尼松。参见"Guidelinesforthemanagementofrheumatoidarthritis"Arthritis&Rhemmatism46(2):328-346(2002年2月)。大多数具有新诊断的RA的患者在诊断3个月之内以疾病緩解抗风湿药(DMARD)疗法开始。通常在RA中使用的DMARD为羟氯喹、柳氮磺吡啶、氨甲蝶呤、来氟米特、依那西普、英利昔单抗(+口服和皮下的氨曱蝶呤)、硫唑嘌呤、D-青霉胺、金制剂(Gold)(口服)、金制剂(肌内)、米诺环素、环孢菌素、葡萄球菌A蛋白免疫吸附。因为在RA期间机体产生肿瘤坏死因子a(TNFa)，所以已将TNFa抑制剂用于该疾病的治疗。依那西普(ENBREL)是一种在美国被批准用于活动性RA的治疗的可注射药物。依那西普与TNFa结合并用于从关节和血液中移除大多数的TNFa，从而防止TNFa促进类风湿关节炎的炎症和其他症状。依那西普是一种"Fc-融合蛋白"融合蛋白质，其由连接至人IgGl的Fc部分的人75kD(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的细胞外配体结合部分组成。英利昔单抗(以商品名REMICADE进行销售)是一种规定用于治疗RA和克罗恩病的免疫抑制药物。英利昔单抗是与TNF结合的嵌合单克隆抗体，并且通过靶向并结合产生炎症的TNFa来减少体内的炎症。阿达木单抗(HUMIRATM，AbbottLaboratories)(以前称为D2E7)是一种人单克隆抗体，其与TNFa结合，并被批准用于在具有中等至严重活动性RA的成人(其对于一种或多种传统的疾病緩解性DMARD具有不足的应答)中减少征候和症状以及抑制结构损伤的进展。通过施用免疫抑制药物和BLyS和/或APRIL拮抗剂来治疗类风湿性关节炎可以与使用一种或多种前面所提及的用于RA的药物的疗法相联合地施行。对于类风湿性关节炎，例如，治疗进展的测量可以包括肿胀和触痛的关节的数目和晨僵的时长。可以通过使用X-射线和称为Sharp得分的评分系统，就手和脚中有多少关节已被侵蚀来对患者进行检查。另一种评分系统基于用于评估对疗法的应答的美国风湿病学会(AmericanCollegeofRheumatology)标准。一种用于评价在RA中的治疗功效的方法基于美国风湿病学会(ACR)标准，其尤其测量在触痛和肿胀的关节方面改善的百分比。例如，相比于无抗体治疗(例如，治疗前的基线)或用安慰剂的治疗而言，RA患者可以被评分为ACR20(20%的改善)。用于评价抗体治疗的功效的其他方式包括X-射线评分，例如SharpX-射线得分，其用于对结构损伤例如骨质侵蚀和关节空间变窄进行评分。还可以在治疗期间或治疗后的时间段，基于健康评估调查表(HealthAssessmentQuestionnaire[HAQ])得分、AIMS得分、SF-36,就残疾的防止或改善来对患者进行评价。ACR20标准可以包括触痛的(疼痛的)关节计数和肿胀的关节计数改善了20%+5个另外的测量中的至少3个改善了20%:1.患者的疼痛评估，通过直观模拟标尺(visualanalogscale,VAS),2.疾病活动性的患者的总体评估(VAS)，3.疾病活动性的医生的总体评估(VAS)，4.通过健康评估调查表而测量的患者的自我评估的残疾，和5.急性期反应物，CRP或ESR。ACR50和70类似地进行定义。优选地，给患者施用对于达到至少ACR20的得分，优选地至少ACR30，更优选地至少ACR50，更加优选地至少ACR70，最优选地至少ACR75和更高得分而言有效的量的本发明的BLYS结合抗体。银屑病关节炎具有独特和明显的放射摄影术特征。对于银屑病关节炎，关节侵蚀和关节空间变窄也可以通过Sharp得分来进行评价。可该病症的疾病征4矣和症状。本发明的另外一个方面为通过给患有SLE的患者施用治疗有效量的本发明的与免疫抑制药物相組合的BLyS和/或APRIL拮抗剂来治疗狼疳或SLE的方法。SLEDAI得分提供了疾病活动性的数值定量。SLEDAI是已知与疾病活动性相关的24个临床和实验室参数的加权指数，具有0-103的数值范围。参见BryanGescuk或JohnDavis,"Noveltherapeuticagentforsystemiclupuserythematosus",CurrentOpinioninRheumatology2002，14:515-521。针对双链DNA的抗体被认为引起狼疮的肾脏突发(renalflare)和其他表现。可以就肾脏突发所需时间来对经历抗体治疗的患者进行监测，所述肾脏突发被定义为尿中的血清肌酸酐、尿蛋白和血液的显著且可重现的增加。备选地或者另外地，可以就抗核抗体和针对双链DNA的抗体来对患者进行监测。对SLE的治疗包括高剂量的皮质类固醇和/或环磷酰胺(HDCC)。对于系统性红斑狼疮，可以就抗核抗体和针对双链DNA的抗体的水平来对患者进行监测。本发明的一个特别的方面为用免疫抑制药物与BLyS和/或APRIL拮抗剂(例如atacicept)的组合来治疗狼疮肾炎。脊推关节病是一组关节病症，包括强直性脊推炎、银屑病关节炎和克罗恩病。治疗的成功可以通过经验证的患者和医生总体评估测量工具来进行测定。可以通过使用本发明的方法来治疗的其他自身免疫疾病为银屑病。目前，使用各种药疗法来治疗银屑病；治疗直接地与疾病严重性相关地而不同。具有更温和形式的银屑病的患者通常采用局部治疗(例如局部的类固醇、蒽林、卡泊三烯、氯倍他索和他扎罗汀)来对付该疾病，而具有中等和严重银屑病的患者更可能釆用全身性疗法(氨甲蝶呤、类视黄醇、环孢菌素、PLTVA和UVB)。还使用焦油。这些疗法具有治疗的安全性的关注、耗时的制度或不方便的过程的组合。而且，有些需要昂贵的设备和诊所布置中的专用空间。全身性的药疗法可产生严重的副作用，包括高血压、高脂血症、骨髓抑制、肝病、肾病和胃肠不适。此外，光疗法的使用可能增加皮肤癌的发病率。除了与使用局部疗法相关的不方便和不舒适之外，光疗法和全身性治疗还由于其副作用而需要使患者在进行治疗和不进行治疗之间循环，并监测终生暴露量(lifetimeexposure)。银屑病的治疗功效通过监测相比于基线状况而言该疾病的临床征候和症状的改变来进行评估，包括医生的总体评估(Physician'sGlobalAssessment,PGA)变化和《艮屑病面积和严重度指数(PsoriasisAreaandSeverityIndex,PASI)得分、银屑病症状评估(PsoriasisSymptomAssessment,PSA)。可以通过在直观模拟标尺上进行处理来周期性地对患者进行测量，所述直观模拟标尺用于指明在特定时间点处所经历的瘙痒的程度。具有自身免疫性起因的各种其他炎性疾病也在本治疗方法的范围之内。其中特别考虑的疾病为自身免疫性肝炎和自身免疫性曱状腺炎。自身免疫性肝炎牵涉由于患者自己的免疫系统进行自身攻击而引起的肝脏的炎症。类似地，甲状腺的自身攻击和所导致的炎症是自身免疫性曱状腺炎的生物学原因。预期诸如此类的疾病通过使用BLyS和/或APRIL拮抗剂与免疫抑制药物(例如匪F)的组合而得到减轻。按剂量给药(dosing)依赖于待治疗的适应症和本领域专业医生所熟悉的与按剂量给药相关的因素，本发明的BLyS和/或APRIL拮抗剂和免疫抑制药物将以这样的剂量来施用，所述剂量对于治疗该适应症来说是有效的，而同时最小化毒性和副作用。一般地，本发明的BLyS和/或APRIL拮抗剂将以约O.25mg/kg体重至约25mg/kg体重，优选地约lrag/kg至约10mg/kg的剂量范围施用给人患者。换另一种方式进行表述，BLyS和/或APRIL拮抗剂的优选剂量范围为约75至约190mg/剂。在一个优选的实施方案中，对于BLyS和/或APRIL拮抗剂，剂量为约150mg/剂。本发明的治疗方法包括同时和顺次地施用免疫抑制药物和BLyS和/或APRIL拮抗剂(在此均称为"治疗部分")的组合。在顺次施用中，所述治疗部分可以以任一种顺序进行施用，即先施用免疫抑制药物，随后施用BLyS和/或APRIL拮抗剂。患者可以用一种药物进行治疗，并就面对用该种药物进行治疗的功效进行监测。例如，如果免疫抑制药物产生了部分的应答，那么可以用BLyS和/或APRIL拮抗剂继续进行治疗以获得完全的应答，反之亦然。备选地，起初可以给患者施用这两种药物，随后可以只用一种药物或另一种药物进行按剂量给药。为了使患者适应于耐受所述药物和/或减少由于治疗化合物的初始和后续施用而引起的不良反应(例如与输注相关的症状)的出现，可以给有此需要的哺乳动物施用第一或初始调适剂量的所述一种或两种药物，然后施用至少第二治疗有效剂量的所述一种或两种药物，其中第二和任何后续的剂量比第一剂量高。第一剂量用于使哺乳动物适应于耐受更高的第二治疗剂量。如此，所述哺乳动物能够耐受比在初始时可施用的更高的剂量的治疗化合物。"调适剂量(conditioningdose)"为这样的剂量，其减弱或降低与施用治疗化合物相关的首次剂量不良副作用的频率或严重度。调适剂量可以为治疗剂量、亚治疗剂量、症状剂量(symptomaticdose)或亚症状剂量(sub-symptomaticdose)。治疗剂量为对于患者展现出治疗效应的剂量，和亚治疗剂量为对于所治疗的患者不展现出治疗效应的剂量。症状剂量为在施用时引起至少一种不良反应的剂量，和亚症状剂量为不引起不良反应的剂量。一些不良反应为发热、头痛、恶心、呕吐、呼吸困难、肌痛和寒战。64除了调适剂量给药方案之外，还有许多可以采用以达到本发明的疾病减轻的其他给药方案。一种这样的方法为用一种免疫抑制药物进行短期治疗，接着逐渐减少，随后用另一种免疫抑制药物与BLyS和/或APRIL拮抗剂的组合进行治疗。例如，可以通过在4周内每天两次口服来给予1000-1500mg皮质类固醇，随后在10周的过程中从5mg/周逐渐减少至IOmg/天。一旦到了开始BLyS和/或APRIL拮抗剂的时间，负荷剂量给药方案可以是合适的。特别地，atacicept可以每周施用两次并持续4周，随后在延长的时间段(例如48周)内每周进行施用。相反地，免疫抑制药物倾向于以逐步升高的剂量给药方案进行施用。例如，MMF可以以每天两次500mg的剂量进^f亍施用，并在两周后增加至每天两次750mg。如果患者的白细胞计数保持在可接受的水平(即，高于3.0x107L或3000/mm2)，剂量的每周的进展可以直至每天3次1000mg的最大剂量。特别地，可以预期，画F施用的最大范围为2000至3000rag/患者/天。施用途径根据已知的方法给人患者施用BLyS和/或APRIL拮抗剂和免疫抑制药物，例如通过静脉内施用，例如作为推注或者在一段时间内连续输注，通过皮下、肌内、腹膜内、脑脊髓内、关节内、滑膜内、鞘内或吸入途径。采用合适制剂的免疫抑制药物还可以口服或局部地进行施用。一般地，BLyS和/或APRIL拮抗剂和一些免疫抑制药物将通过静脉内或皮下施用来进行施用。不同的治疗部分可以通过相同或不同的途径来进行施用。制品和试剂盒本发明的另一个实施方案为制品，其包含BLyS和/或APRIL拮抗剂和免疫抑制药物以用于治疗上面所公开的由B细胞调节的自身免疫病症。在一个特别的实施方案中，所述制品包含用于治疗狼疮肾炎的actacicept和匪F。所述制品包含至少一个容器以及在容器上或与容器相连的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如瓶子(bottle)、小瓶(vial)、注射器等。所述容器可以由各种材料例如玻璃或塑料形成。所述容器装有对于治疗所述病状而言有效的本发明的组合物，并且可以具有无菌入口(例如，所述容器可以是静脉内溶液袋，或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。所述标签或包装说明书指明，所述组合物用于治疗特定的病状，例如狼疮肾炎或类风湿性关节炎。所迷标签或包装说明书将进一步包括关于给患者施用所述组合物的指导。另外，所述制品可以进一步包含第二个容器，其包含药学上可接受的緩冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸緩沖盐水、林格溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包括从商业或用户观点来看所希望的其他材料，包括其他緩冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。还提供了试剂盒，其可用于各种目的，例如用于B-细胞杀伤测定法。如关于制品一样，所述试剂盒包含容器以及在容器上或与容器相连的标签或包装说明书。所述容器装有包含本发明的至少一种免疫抑制药物和至少一种BLyS和/或APRIL拮抗剂的组合物。可以包括另外的容器，其包含例如稀释剂和緩冲液、对照抗体。所述标签或包装说明书可以提供关于该组合物的描述以及关于所预计的体外或诊断用途的指导。实验实施例实施例lBLyS和/或APRIL拮抗剂的制备产生了TACI-Fc的四种氨基末端截短的形式。所有这四种形式具有融合至SEQIDNO:2的氨基酸残基编号30的在WO02/094852中公开的经修饰的人组织纤溶酶原激活物信号序列(SEQIDNO:41)。然而，这四种蛋白质在其中Fc5被融合至SEQIDN0:2的TACI氨基酸序列的位点方面不同。表l概述了这四种融合蛋白质的结构。66<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>使用标准技术，通过重叠PCR来产生编码蛋白质的表达盒(参见例如，Horton等人，Gene77:61(1989))。将编码TACI的核酸分子和编码Fc5的核酸分子用作PCR模板。寡核苷酸引物列于表2和表3中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>对于所述四种氨基末端截短的形式中的每一种，第一轮PCR扩增由两个反应组成。所述两个反应分别如下来进行对于每一种形式，在一个反应中使用5'和3'TACI寡核苷酸，和在另一个反应中使用5'和3'Fc5寡核苷酸。第一轮PCR扩增的条件如下。向25ul的最终体积中添加约200ng的模板DNA，2.5|a110xPfu反应緩冲液(Stratagene)，2pl的2.5mMdNTPs，0.5pl的各20mM的5'寡核苷酸和3'寡核苷酸，和O.5inl的Pfu聚合酶(2.5个单位，Stratagene)。扩增的温度特性i普的组成如下94。C3分钟；以94。C15秒，50。C15秒，72°C2分钟进行35个循环；随后于72。C延伸2分钟。反应产物通过琼脂糖凝胶电泳来进行分级，并且将相应于预期大小的条带从凝胶上切除并根据制造商的指导使用QIAGENQIAQUICKGelExtractionKit(Qiagen)来进4亍回收。通过使用来自第一轮PCR的经凝胶純化的片段作为DNA模板来进行第二轮PCR扩增或重叠PCR扩增反应。第二轮PCR扩增的条件如下。向25ja1的最终体积中添加各约1Qng的TACI片段和Fc5片段的模板DNA，2.5pi10xPfu反应緩冲液(Stratagene)，2pl的2.5mMdNTPs,0.5u1的各20jjM的ZC24，903(SEQidno:27)和zc24，946(SEQidno:30)，和O.5jLil的Pfu聚合酶(2.5个单位，Stratagene)。扩增的温度特性谱的组成如下94。Cl分钟；以94。C15秒，55'C15秒，72匸2分钟进行35个循环；随后于72X:延伸2分钟。反应产物通过琼脂糖凝胶电泳来进行分级，并且将相应于预期大小的条带从凝胶上切除并根据制造商的指导4吏用QIAGENQIAQUICKGelExtractionKit(Qiagen)来进行回收。根据制造商推荐的方案，使用Invitrogen的ZEROBLUNTT0P0PCRCloningKit,分开地克隆所述四种形式的氨基末端截短的TACI-FcPCR产物中的每一种。表4列出了这些TACI-Fc构建体的核苷酸和氨基酸序列。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>在验证了核苷酸序列后，将包含所述四种形式的氨基末端截短的TACI-Fc融合物中的每一种的质粒用FseI和AscI进行消化，以释放出氨基酸编码区段。将FseI-AscI片段连接入包含CMV启动子和SV40polyA区段的哺乳动物表达载体中。如下面所描述的，将表达载体引入中国仓鼠卵巢细胞中。实施例2通过中国仓鼠卵巢细胞来产生TACI-Fc蛋白将TACI-Fc表达构建体用于经由电穿孔来转染生长在无动物蛋白质的培养基中的悬浮适应型中国仓鼠卵巢(CHO)DG44细胞(Urlaub等人，Som.Cell.Molec.Genet.12:555(1986))。CHODG44细胞由于在两个二氢叶酸还原酶染色体位置处发生缺失而缺乏功能性的二氢叶酸还原酶基因。所述细胞在浓度增加的氨曱蝶呤存在下的生长导致在所述表达构建体上的二氢叶酸还原酶基因以及所连接的编码重组蛋白质的基因的扩增。使CH0DG44细胞在PFCH0培养基(JRHBiosciences,Lenexa，KS)、4mML-谷氨酰胺(JRHBiosciences)和lx次黄噪呤-胸苷补充物(LifeTechnologies)中进行传代，并且在37。C和5。/。0)2下在旋转摇动平台上以120RPM在Corning摇瓶中培育所述细胞。分开地用线性化的表达质粒转染所述细胞。为了确保无菌，通过在Eppendorf管中将200jag质粒DNA与20n1经剪切的鲑精载体DNA(5'—3'Inc.Boulder，C0，10mg/ml)、22u13MNa0Ac(pH5.2)和484ja1画乙醇(GoldShieldChemicalCo.，Hayward，CA)相合并，在冰上进行单次乙醇沉淀步骤25分钟。在温育后，将管在置于4。C冷室中的微量离心机(microfuge)之中以14，000RPM进行离心，除去上清液，并且用O.5ml70%乙醇洗涤粒状沉淀两次并让其风干。在干燥DNA粒状沉淀的同时，通过在25ml锥形离心管中以900RPM使106个总细胞(16.5ml)离心5分钟来制备CH0DG44细胞。将CHODG44细胞重悬浮于总体积为300y1的PFCH0生长培养基中，并置于具有O.4cm电极隙的Gene-PulserCuvette(Bio-Rad)中。在大约50分钟的干燥时间后，将DNA重悬浮于500u1的PFCH0生长培养基中，并且以使总体积不超过800inl的方式添加至在杯池(cuvette)中的细胞，和让其在室温下静置5分钟以减少气泡形成。将杯池置于被设置在O.296kV(千伏)和0.950HC(高电容)的BioRadGenePulserII装置中，并立即进行电穿孔。在置于在CoStarT-75烧瓶中的20ml总体积的PFCHO培养基中之前，将细胞在室温下温育5分钟。将烧瓶置于37^和5%C02下48小时，然后采用台盼蓝排除法通过血细胞计数器来对细胞进行计数，并放置在没有次黄嘌呤-胸苷补充物且包含200mM氨甲蝶呤(CalBiochem)的PFCHO选择培养基中。在氨甲蝶呤选择过程恢复后，就通过Western印迹分析来检查包含分泌的TACI-Fc融合蛋白的该条件培养基。实施例3小鼠中Atacicept和醒F的组合在一个28天的研究中，在CD-1小鼠中测试atacicept和固F(CellCept)的共施用。将150只动物分为四个治疗組。组l接受用于atacicept和MMF的媒介物对照物品，其中使用与用于每个测试物品的相同的途径和给药方案。组2经由每天经口管饲法接受醒F(351mg/kg)。组3经由皮下注射每周三次接受atacicept(20mg/kg)。组4接受atacicept(20mg/kg，3次/周，SC)和固F(351mg/kg，每天，口月良)，通常在彼此30分钟内施用。将所施用的醒F的剂量选择为小鼠中的最大可行剂量，并通过使用体表面积将人剂量换算成小鼠剂量来模仿用于肝移植患者的29mg/kg的关于70kg的人而言的人等价剂量(约2g/天)。在基线(第l天)以及第14、28(治疗的最后一天)、42、56和112天处死动物。每天就死亡率、异常和疼痛或痛苦的征候对小鼠进行检查。在该研究的第l天和此后每周，以及在处死之前，测量和记录体重。为了全面的血液学和血清化学分析，淋巴细胞亚型的流式细胞术分析，以及总血清IgG、IgM和IgA浓度，从被处死的动物中收集血液。使用来测量总血清IgG、IgM和IgA。在被处死的动物上进行全面的尸体剖检，以评价器官重量变化、宏观病理学和组织病理学。使用小鼠IgGELISA定量试剂盒(目录号E90-131，BethylLaboratories,Montgomery,TX)，并结合ELISAStarterAccessoryPackage(目录号EIOI，BethylLaboratories,Montgomery,TX),来评价总IgG水平。所有的液体操作通过使用所整合的FreedomEvo150液体操作系统和ColumbusWasher(TECAN，Denmark)来进行。微量滴定孔用经亲和纯化的山羊抗小鼠IgG来进行包被，并在室温下温育l小时。对所述孔进行抽吸，用洗涤溶液进行洗涤，然后用封闭溶液封闭30分钟。除去封闭溶液，洗涤平板，并一式两份地添加样品/标准品。l小时后，抽吸掉样品/标准品，并用洗涤溶液洗涤所述孔。添加缀合有辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG，并将所述孔在室温下温育l小时。通过洗涤来除去未结合的经缀合的抗体，并通过与TMB底物(BethylLaboratories,Montgomery,TX)—起温育IO分钟来测量留存在孔中的缀合物的量。通过添加2MH2S04来终止颜色反应，并且在Spectramax190微量培养板阅读器上测量所得的吸光度(OD-450)。关于总IgG的数据计算如下来进行从每个样品和标准品中减去平均零标准(空白平板)OD-450值，并计算一式两份的读数的平均值。通过将每个标准品的平均OD对浓度进行作图来产生标准曲线，其中采用四参数对数曲线拟合。通过从标准曲线中进行内插法来获得样品浓度。将平均样品浓度乘以稀释倍数。使用SoftMax⑧Pro软件来分析的数据包括OD值，标准曲线，重复之间的标准差和y。cv，以及未知者的内插值。使用小鼠IgMELISA定量试剂盒(目录号E90-101，BethylLaboratories,Montgomery,TX),并结合EUSAStarterAccessoryPackage(目录号EIOI，BethylLaboratories,Montgomery,TX)，来评价总IgM水平。所有的液体操作通过使用所整合的FreedomEvo150液体操作系统和ColumbusWasher(TECAN,Denmark)来进行。二微量滴定孔用经亲和纯化的山羊抗小鼠IgM来进行包被，并在室温下温育l小时。对所述孔进行抽吸，用洗涤溶液进行洗涤，然后用封闭溶液封闭30分钟。除去封闭溶液，洗涤平板，并一式两份地添加样品/标准品。l小时后，抽吸掉样品/标准品，并用洗涤溶液洗涤所迷孔。添加缀合有辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgM，并将所述孔在室温下温育l小时。通过洗涤来除去未结合的经缀合的抗体，并通过与TMB底物(BethylLaboratories,Montgomery,TX)—起温育IO分钟来测量留存在孔中的缀合物的量。通过添加2MH^0,来终止颜色反应，并且在Spectramax190微量培养板阅读器上测量所得的吸光度(0D-450)。关于总IgM的数据计算如下来进行从每个样品和标准品中减去平均零标准(空白平板)OD-450值，并计算一式两份的读数的平均值。通过将每个标准品的平均0D对浓度进行作图来产生标准曲线，其中采用四参数对数曲线拟合。通过从标准曲线中进行内插法来获得样品浓度。将平均样品浓度乘以稀释倍数。使用SoftMax⑧Pro软件来分析的数据包括OD值，标准曲线，重复之间72的标准差和n/。CV，以及未知者的内插值。使用小鼠IgAELISA定量试剂盒(目录号E90-103，BethylLaboratories,Montgomery,TX),并结合ELISAStarterAccessoryPackage(目录号EIOI，BethylLaboratories,Montgomery,TX),来评价总IgA水平。所有的液体操作通过使用所整合的FreedomEvo150液体操作系统和ColumbusWasher(TECAN，Denmark)来进行。微量滴定孔用经亲和纯化的山羊抗小鼠IgA来进行包被，并在室温下温育l小时。对所述孔进行抽吸，用洗涤溶液进行洗涤，然后用封闭溶液封闭30分钟。除去封闭溶液，洗涤平板，并一式两份地添加样品/标准品。l小时后，抽吸掉样品/标准品，并用洗涤溶液洗涤所述孔。添加缀合有辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgM，并将所述孔在室温下温育l小时。通过洗涤来除去未结合的经缀合的抗体，并通过与TMB底物(BethylLaboratories,Montgomery,TX)—起温育IO分钟来测量留存在孔中的缀合物的量。通过添加2MH2SO,来终止颜色反应，并且在Spectramax190微量培养板阅读器上测量所得的吸光度(0D-450)。关于总IgA的数据计算如下来进行从每个样品和标准品中减去平均零标准(空白平板)ODM50值，并计算一式两份的读数的平均值。通过将每个标准品的平均0D对浓度进行作图来产生标准曲线，其中采用四参数对数曲线拟合。通过从标准曲线中进行内插法来获得样品浓度。将平均样品浓度乘以稀释倍数。使用SoftMax⑧Pro软件来分析的数据包括OD值，标准曲线，重复之间的标准差和n/。CV，以及未知者的内插值。免疫球蛋白测量值的变化的平均结果记录在下面的表5中，并且以图形形式记录在图l、2和3中。表5第28天时的数值平均IgG、IgM和IgA结果以及与媒介物的差异(pg/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>如可以从这些计算中所看出的，所述组合对于减少所有三种类型的免疫球蛋白具有协同效应(即，所述组合相对于媒介物的平均变化(A3)比从媒介物至仅醒F的平均变化(厶1)和从媒介物至仅Atacicept的平均变化(A2)的加合更大(或者，在数学上来说，A3>厶l+A2))。结论此处的实验显示了令人惊人的结果，因为相比于使用单独的免疫抑制药物和BLyS和/或APRIL拮抗剂所导致的减少水平而言，免疫抑制药物与BLyS和/或APRIL拮抗剂(例如，醒F与atacicept)的组合导致Ig水平的协同耗竭。实施例4Atacicept和MMF组合实验的重复和延伸74通过使用与在实施例3中所描述的那些相似的程序，并且按剂量给药直至第91天，来重复实施例3的结果并在时间上延伸至第35、91、126和182天。该实验的结果确证了在每个时间点处Atacicept和匪F对于所述三种类型的免疫球蛋白中至少之一的平均免疫球蛋白水平的协同效应。所述协同结果概括在下面的表6中。表6关于延伸实验的IgG、IgM和IgA结果的数值平均值的协同结果以及与媒介物的差异(Hg/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>应当注意，当所选择的免疫球蛋白亚型达到最大抑制时，观察到协同效应的能力由于低的绝对数目而被掩蔽了。这种"掩蔽效应"解释了为什么在后面的时间点处在所有三种免疫球蛋白亚型中较少一贯地看到协同作用。总之，这些结果确证了在实施例3中所看到的Atacicept与醒F的组合对于所示免疫球蛋白类型的水平的数值平均值的协同效应，并且将该结论延伸至在35、91、126和182天的时间过程中。为了完整起见，下面描述了在该重复和延伸实验中所使用的实验组、剂量、施用的体积和浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>施用方案ATACICEPT:每隔一天，进行3天/周，通过皮下途径。MMF:每天，通过口服途径。组l以与治疗组相同的处理频率接受用于ATACICEPT的媒介物和用于Ce11Cept的媒介物。组2只用ATACICEPT进行治疗。组3只接受CellCept。组4接受Cel1Cept经口管飼法，随后为在约30分钟的时间段内进行ATACICEPT皮下注射。将第一次治疗的那天视为所述研究的第l天。在整个研究期间，进行临床观察、血液学和血液化学测试、毒物动力学和另外的调查。总IgG、IgM和IgA测定/卫星组9、10、11和12将另外的卫星组(satellitegroup)动物用于总免疫球蛋白测定和抗体测定。根据与主研究相同的程序，对它们进行处理和称重。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>以3只小鼠/性别/笼，对动物进行圈养。从3只动物/性别/组中收集血液样品(以渐进的号数顺序)，以用于测定在下列时间处的IgG、IgM和IgA血清水平从对照组(组9)的动物中预剂量从组9、10、11和12的动物中-在5周治疗期的第34天一在13周治疗期的第90天-在5周恢复期的第34天一在13周恢复期的第90天。在用乙醚将它们完全麻醉后，在处死时从小鼠腹主动脉中收集血液(至少O.8-1mL)。将样品收集在没有任何抗凝剂的管中，并让其在室温下凝固大约l小时。凝块通过于+4。C以3000rpm离心15分钟来旋转沉降。弃去血细胞，并且将血清以100juL等份试样(对于每单个分析，4个等份试样)进行储放，并贮存于-80。C直至分析。通过经验证的ELISA方法来测定总IgG、IgM和IgA水平。在5周治疗期结束时对4只动物/性别/组(以号数顺序的第一只)施行处死；在13周治疗期结束时对8只动物/性别/组(以号数顺序的第二只)施行处死；在5周恢复期结束时对4只动物/性别/组(以号数顺序的第一只恢复的动物)施行处死；和在13周恢复期结束时对4只动物/性别/组(其余的动物)施行处死。结论此处所报道的延伸实验支持了实施例3的结果，其中令人惊奇地显示，相比于使用单独的免疫抑制药物和BLyS和/或APRIL拮抗剂所导致的减少水平而言，免疫抑制药物与BLyS和/或APRIL拮抗剂(例如，画F与atacicept)的組合导致Ig水平的协同耗竭。参考文献在本申请中所引用的参考文献(包括专利、公布的申请和其他出版物)通过提及而合并入本文。权利要求1.用于降低哺乳动物中的免疫球蛋白水平的方法，所述方法包括施用BLyS拮抗剂和免疫抑制药物。2.权利要求l的方法，其中所述BLyS拮抗剂为Fc融合蛋白。3.权利要求2的方法，其中所述Fc融合蛋白选自包含TACI的细胞外结构域或其功能性片段的TACI-Fc融合蛋白、包含BAFF-R的细胞外结构域或其功能性片段的BAFF-R-Fc融合蛋白以及包含BCMA的细胞外结构域或其功能性片段的BCMA-Fc融合蛋白。4.权利要求3的方法，其中所述Fc融合蛋白包含选自SEQIDN0:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23和SEQIDNO:25的多肽序列。5.权利要求3的方法，其中所述Fc融合蛋白包含SEQIDNO:26的多肽序列。6.权利要求l的方法，其中所述BLyS拮抗剂为BLyS抗体。7.权利要求6的方法，其中所述BLyS抗体在包含SEQIDNO:8的氨基酸162-275的区域内结合BLyS。8.权利要求6的方法，其中所述BLyS抗体为LymphoStat-B。9.权利要求l的方法，其中所述BLyS拮抗剂为TACI抗体。10.权利要求1的方法，其中所述TACI抗体在包含选自SEQIDNO:2的72-109和SEQIDNO:2的82-222的氨基酸的区域内结合TACI。11.权利要求10的方法，其中所述TACI抗体结合TACI和BCMA两者。12.权利要求1的方法，其中所述免疫抑制药物选自环磷酰胺(CYC)、硫唑嘌呤(AZA)、环孢菌素A(CSA)和吗替麦考酚酸酯(醒F)。13.权利要求12的方法，其中所述免疫抑制药物为吗替麦考酚酸酯(醒F)。14.权利要求l的方法，其中所述BLyS拮抗剂和所述免疫抑制药物协同作用从而降低免疫球蛋白水平。15.权利要求l的方法，其中被降低的免疫球蛋白水平选自IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。16.用于减轻由B-细胞调节的自身免疫病症的方法，所述方法包括给患有所述病症的患者施用治疗有效量的BLyS拮抗剂和免疫抑制药物。17.权利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗剂为Fc融合蛋白。18.权利要求17的方法，其中所述Fc融合蛋白选自包含TACI的细胞外结构域或其功能性片段的TACI-Fc融合蛋白、包含BAFF-R的细胞外结构域或其功能性片段的BAFF-R-Fc融合蛋白以及包含BCMA的细胞外结构域或其功能性片段的BCMA-Fc融合蛋白。19.权利要求18的方法，其中所述Fc融合蛋白包含选自SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23和SEQIDNO:25的多肽序列。20.权利要求18的方法，其中所述Fc融合蛋白包含SEQIDNO:26的多肽序列。21.权利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗剂为BLyS抗体。22.权利要求16的方法，其中所述BLyS抗体在包含SEQIDNO:8的氨基酸162-275的区域内结合BLyS。23.权利要求16的方法，其中所述BLyS抗体为LymphoStat-B。24.权利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗剂为TACI抗体。25.权利要求16的方法，其中所述TACI抗体在包含选自SEQIDNO:2的72-109和SEQIDNO:2的82-222的氨基酸的区域内结合TACI。26.权利要求24的方法，其中所述TACI抗体结合TACI和BCMA两者。27.权利要求16的方法，其中所述免疫抑制药物选自环磷酰胺(CYC)、硫唑嘌呤(AZA)、环孢菌素A(CSA)和吗替麦考酚酸酯(醒F)。28.权利要求27的方法，其中所述免疫抑制药物为吗替麦考酚酸酯(固F)。29.权利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗剂和所述免疫抑制药物协同作用从而降低免疫球蛋白水平。30.权利要求16的方法，其中被降低的免疫球蛋白水平选自IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。31.权利要求16的方法，其中所述自身免疫疾病选自类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎(LN)、韦格纳病、炎症性肠病、特发性血小板减少性紫瘕(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化症、银屑病、IgA肾病、IgM多发性神经病、重症肌无力、脉管炎、糖尿病、Reynauld，s综合征、Sjorgen，s综合征、肾小球肾炎、自身免疫性肝炎和自身免疫性曱状腺炎。32.权利要求31的方法，其中所述自身免疫疾病为狼疮肾炎。33.权利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗剂以约1至约2.5mg/kg的剂量进行施用，和所述免疫抑制药物以约1至约4mg/kg的剂量进行施用。34.权利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗剂和所述免疫抑制药物以与使用选自下列的第二免疫抑制药物的疗法相联合的方式进行施用非类固醇抗炎药(NSAID)、糖皮质激素、泼尼松和疾病緩解抗风湿药(DMARD)。35.包含BLyS拮抗剂和免疫抑制药物的组合物。36.包含BLyS拮抗剂和免疫抑制药物以及标签的制品，其中所述标签指明所述组合物用于治疗由B细胞调节的自身免疫病症。37.权利要求1的方法，其中所述BLyS拮抗剂也是APRIL拮抗剂。38.权利要求16的方法，其中所述BLyS拮抗剂也是APRIL拮抗剂。39.权利要求34的组合物，其中所述BLyS拮抗剂也是APRIL拮抗剂。40.权利要求35的制品，其中所述BLyS拮抗剂也是APRIL拮抗剂。41.用于降低哺乳动物中的免疫球蛋白水平的方法，所述方法包括施用APRIL拮抗剂和免疫抑制药物。42.用于减轻由B-细胞调节的自身免疫病症的方法，所述方法包括给患有所述病症的患者施用治疗有效量的APRIL拮抗剂和免疫抑制药物。43.包含APRIL拮抗剂和免疫抑制药物的组合物。44.包含APRIL拮抗剂和免疫抑制药物以及标签的制品，其中所述标签指明所述组合物用于治疗由B细胞调节的自身免疫病症。全文摘要本发明涉及用于治疗自身免疫疾病的新型联合疗法，所述联合疗法牵涉BLyS或BLyS/APRIL抑制以及免疫抑制剂。一种优选的方法是这样的，其中BLyS和/或APRIL拮抗剂为Fc融合蛋白，所述Fc融合蛋白可以是包含TACI的细胞外结构域或其功能性片段的TACI-Fc融合蛋白、包含BAFF-R的细胞外结构域或其功能性片段的BAFF-R-Fc融合蛋白或者包含BCMA的细胞外结构域或其功能性片段的BCMA-Fc融合蛋白。在本发明的方法中，所考虑的免疫抑制药物中的一些包括环磷酰胺(CYC)、硫唑嘌呤(AZA)、环孢菌素A(CSA)或吗替麦考酚酸酯(MMF)，虽然任何抑制免疫系统的药物可以是适合的。本发明的方法降低需要此类降低的患者(例如患有自身免疫疾病的那些患者)中各种免疫球蛋白的水平。文档编号A61K38/19GK101678106SQ200880015590公开日2010年3月24日申请日期2008年3月27日优先权日2007年3月27日发明者A·M·李特奥,C·皮纳罗斯,H·O·L·格拉夫尼尔,K·P·范尼斯,L·祖克曼,M·S·赫德伦,R·A·小庞斯,W·J·瓦利斯申请人:津莫吉尼蒂克斯公司;阿瑞斯贸易股份有限公司