高级脂肪酸衍生物的免疫抑制剂及其应用的制作方法

专利名称：高级脂肪酸衍生物的免疫抑制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高级脂肪酸衍生物的免疫抑制剂，特别涉及用作免疫抑制剂的高 级脂肪酸化合物或其衍生物，在免疫抑制、炎症、移植排斥及T细胞介导型自身免疫病治疗 中的应用，所述T细胞介导型自身免疫病例如是糖尿病、多发性硬化、关节炎和全身性红斑 狼疮等，通过给予动物有效剂量的高级脂肪酸化合物，治疗和/或预防免疫疾病如自身免 疫病或炎性疾病，减少移植物的免疫排斥。
背景技术：
在很多情况下期望调节免疫系统，从抑制自身免疫应答，到控制传染病和抑制移 植物/组织排斥。减轻排斥的主要途径是药理学上抑制受者的免疫系统。基于这种想法， 大部分目前使用的免疫调节化合物是抑制免疫的。从20世纪60年代早期起，可得的免 疫抑制剂仅限于少数药物。但是，在20世纪80年代早期，除了硫唑嘌呤和皮质类固醇以 外，环孢菌素开始得到并成为选择药物(Kobashigawa, trans, pro. 30 1095-1097，1998 ； Isoniemi，Ann. Chi. Gyn. 86 164-170，1997)。将环饱菌素 A(CsA)天然二级代谢产物、他克 莫司(Π(506)和雷帕霉素(RAPA)开发成免疫抑制剂，并通过发挥其在移植排斥(TIBS. 18 334-338,1993)和 GVHD(Ann hematol. 71 :301_306，1995)中的作用，是器官移植领域发生 了革命性的巨变。然而，这些药物在使用中存在严重过的副作用，例如肾毒性、神经毒性、 肝细胞毒性、内分泌并发症以及影响骨骼(New Engl. j. Med. 321 1725-1738，1989 ；外科学 97 :125，1985)。因此，需要为临床上提供一类有免疫抑制效果，但无上述毒副作用的新化合 物。目前使用的免疫抑制药包括抗增殖剂，如甲氨蝶呤、硫唑嘌呤和环磷酰胺。由于这 些药物影响有丝分裂和细胞分裂，它们对有高周转率的正常细胞如骨髓细胞等具有严重的 毒副作用(Miller Semin. Vet. Med. Surg. 12(3) 144-149，1997)。因此骨髓抑制和肝损伤 是常见的副作用。用于诱导免疫抑制的抗炎化合物包括肾上腺皮质类固醇，如地塞米松和泼尼松 龙。使用这些化合物观察到的常见的副作用为频繁的感染、异常代谢、高血压和糖尿病。其他目前用于抑制淋巴细胞活化和增殖的免疫抑制化合物包括CsA、Π(506和 RAPA。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(CsA和Π(506)或抑制诱导生长因子的 P70S6 激酶(RAPA)。(Liu 等，Cell. 66 :807_815，1991 ；Bierer 等，Curr. Opin. Immun. 5 763-773,1993)。CsA及其相关物是最常用的免疫抑制剂之一。CsA代表性的用于预防或 治疗肾、肝脏、心脏、胰腺、骨髓、和心肺移植的器官排斥，以及用于治疗自身免疫病和炎性 疾病如局限性回肠炎、再生障碍性贫血、多发性硬化、重症肌无力、胆汁性肝硬变等。但是 CsA治疗时间窗口小并具有严重的毒性作用，包括肾毒性，肝毒性、神经毒性等(Philip和 Gerson, Clin. Lab. Med. 18 (4) :755_765，1998 ；Hojo 等，Nature. 397 :530_534，1999)。此外，单克隆抗体，如0KT3已被用于预防和/或治疗移植物排斥。将单克隆抗 体引入患者，可导致严重的副作用，如寒战和呼吸困难(Richards等，Cancer Res. 59(9)2096-2101，1999)。在许多威胁生命的疾病中，器官移植被认为是一种标准治疗。在较多的情况下，仅 有的选择只是死亡。由主要组织相容性复合物(MHC)编码并存在所有细胞上的对移植物上 的外来细胞表面抗原的免疫应答，通常阻止组织和器官的成功移植。而且，随着供体器官需 求的增加，目前移植器官的不足也在增加。因此异种移植成为深入研究的领域，但它面临许 多与受体动物内排斥有关的困难(Kaufman等，Annu. Rev. Immunol. 13 :339_367，1995)。宿主对器官同种异体移植物的应答涉及复杂的一系列T和B淋巴细胞以及巨噬 细胞或识别外来抗原并被外来抗原激活的树突状细胞之间的细胞相互作用(Abbas等，WB saunders Co. perm.，1994)。由活化的佐细胞(如巨噬细胞和树突细胞)提供的共同刺激 因子和特异性细胞一细胞相互作用是T细胞增殖所必需的。这些巨噬细胞和树突状细胞 通过特异性粘附蛋白直接粘附在T细胞上，或者分泌刺激T细胞的细胞因子，如IL-12和 IL-15 (strom,Organ Transplantation :Current Clinical and Immunological Concepts, 1989)。来源佐细胞的共同刺激信号刺激IL-2基因转录的活化和T细胞中高亲和力 IL-2 受体的表达(Cantrell 等，Science. 224 :1312，1991 ；Williams 等，J. Immunol. 132 2330-2337,1984)。IL-2—种15Kda蛋白，是由T淋巴细胞在抗原刺激时分泌的，并且是正 常免疫应答所需的。IL-2通过与IL-2细胞表面特异性受体(IL-2R)的结合刺激淋巴细胞 的增殖和分化。IL-2还引起辅助T细胞活化细胞毒性T细胞，并刺激干扰素(IFN- γ )的分 泌，其进而活化巨噬细胞的细胞杀伤能力(Farrar, J. Immunol. 126 :1120_1125，1981)。而 且，IFN- γ和IL-4还是移植器官的MHCII表达的重要活化剂，因而还通过增强移植器官的 免疫原性进一步扩展排斥级联(Kelley等，J. Immunol. 132 =240-245,1984)。T细胞介导的应答模型表明T细胞是在次级淋巴器官的T细胞区内，主要由树突 细胞致敏。最初的相互作用需要抗原呈递细胞(APCs)上携带抗原的MHC分子与T细胞上 的T细胞受体(TCR)/⑶3复合物之间的细胞接触。TCR/⑶3复合物的结合诱导主要在⑶4T 细胞上的⑶154表达，进而通过⑶40结合活化APC导致改善抗原提呈(Grewall等，Annu. Rev. Immunol. 16 :111_135，1998)。这一部分是通过APC上的CD80和CD86表达的上调而 引起的，上述两者都是T细胞上重要的CD28共刺激分子的配体。但是CD40的结合还导致 MHC-抗原复合物表面表达的延长，4-1BB和0X40的配体的表达，而且⑶40结合导致各种 细胞因子(IL-12、IL-15、TNF-a、IL_1、IL_6 和 IL-8)和趋化因子(ΜΙΡ-la 和 MCP-1)的分 泌，所有这些因子都对APC和T细胞的活化和成熟均具有重要作用(Mackey等，J. Leukoc. Biol. 63 :418-428，1998)。所有预防排斥和逆转自身免疫策略的目标是抑制患者对抗原组织或试剂的免疫 活性，同时具有最低的发病率和死亡率。因此，目前正使用或研究大量药物的免疫抑制性 质。正如以上讨论，最常用的免疫抑制剂为CsA，但使用CsA有许多副作用。因此考虑到具 有低毒性和可控的副作用的免疫抑制剂选择相对较少，现有技术需要找到可供选择的免疫 抑制剂。本发明正好满足了这种需要，并提供了其他相关优点。

发明内容
针对上述现有技术中的的问题，本发明的目的在于提供一种高级脂肪酸衍生物免 疫抑制剂及其应用，以抑制患有自身免疫病、炎性疾病或移植物抗宿主疾病的动物的免疫
5应答，并具有低毒性和可控的副作用。本发明的高级脂肪酸衍生物的免疫抑制剂，包括如下式所述的化合物及其药学上 可接受的盐，溶剂化物或水合物中的一种或多种组合(1)化合物 I :CH3 (CH2)mlCH = CH(CH2)nlC0R其中10 彡 ml+nl 彡 22，ml = 1 13，nl = 1 21 ;R 为_CH3、_CH2CH3、-CH( CH3)2、-(CH2)3CH3, -(CH2)2CH2CH3, -c(CH3)3、环己烷基、苯甲基、乙醇胺基、二甲氨基乙胺 基，-N(CH2CH2Cl)2, -N(R1)CONHR2 ；礼、R2可以相同，也可以不同，为如下结构 A、B、C、D、E 独立地选自-H、_0H、-NH2, -NO2, -CH3> -OCH3> _0CH2CH3、-CH2NH2 ；(2)化合物 II CH3(CH2)m2CH = CH(CH2)n2CH = CH(CH2)X1C0R其中m2+n2 彡 11 ;8 彡 m2+n2+xl 彡 20 ；m2 = 1、4、7、10 ；n2 = 1、4、7、10 ；xl 彡 1 ； R同化合物I式中的R ；(3)化合物 III =CH3(CH2)m3CH = CH(CH2)n3CH = CH(CH2)x2CH = CH(CH2)yC0R其中 m3+n3+x2 彡 9 ;6 彡 m3+n3+x2+y 彡 18 ；m2 = 1、4、7 ；n2 = 1、4、7 ；x2 == 1、 4、7 ；y ^ 1 ;R同化合物I式中的R ；(4)化合物 IV =CH3 (CH2) zC0R其中ζ = 12 24 ;R同化合物I式中的R。所述药学上可接受的盐是指与酸(如盐酸，硫酸，磷酸)所形成的盐，以及与强碱 (如氢氧化钠、氢氧化钾)所形成的盐。所述化合物包括化合物I、化合物II、化合物III、化合物IV的所有构象异构体 (例如顺反异构体，无论是否包括双键)；化合物还包括化合物I、化合物II、化合物III、化 合物IV的所有旋光异构体(例如对映异构体和非对映异构体)以及外消旋体，非对映异构 体和上述异构体的混合物；还包括化合物I、化合物II、化合物III、化合物IV的互变异构 体及立体异构体，以及任一上述形式的混合物。所述药学上可接受的盐是药学上可接受的酸的加成盐，药学上可接受酸的加成盐 的酸形成非毒性酸加成盐的酸，即含有药学上可接受的阴离子的盐，例如盐酸盐，硝酸盐， 硫酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，乙酸盐，乳酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，琥珀酸盐，马来酸盐，葡糖 酸盐，苯甲酸盐，甲基磺酸盐，苯基磺酸盐，对甲苯磺酸盐和二羟基萘酸盐。所述药学上可接受的盐是药学上可接受的碱加成盐，药学上可接受碱的加成盐的 碱形成非毒性碱加成盐的碱，非毒性碱的盐包括但是不限于药学上可接受的阳离子，例如 碱金属阳离子(如钾和钠)，碱土金属阳离子(如钙和镁)，铵或水溶性胺的加成盐，以及低 级烷基铵和药学上可接受的有机胺的其它碱性盐。本发明还涉及在治疗或预防哺乳动物患者疾病的药物组合物中的应用，其中通过向下调节T-细胞介导的免疫应答达到治疗效果，所述组合物包括有效量的(I，II，III，IV) 化合物及药物载体。本发明涉及在治疗或预防哺乳动物炎症疾病的药物组合物中的应用，所述组合物 包括有效量的(I，II，III，IV)化合物及药物载体。本发明涉及在治疗或预防哺乳动物过敏反应疾病的药物组合物中的应用，所述组 合物包括有效量的(I，II，III，IV)化合物及药物载体。本发明涉及在治疗或预防哺乳动物T-细胞，白血病和T-细胞淋巴瘤的药物组合 物中的应用，所述组合物包括有效量的(I，II，III，IV)化合物及药物载体。本发明还涉及在治疗或预防哺乳动物器官移植免疫排斥的药物组合物中的应用。采用上述方案后，本发明适用于治疗或预防哺乳动物移植排斥，治疗或预防哺乳 动物自体免疫疾病，治疗或预防哺乳动物过敏反应疾病，治疗或预防哺乳动物炎症疾病，抑 制哺乳动物患者T-细胞介导的免疫应答，其中通过维持所述免疫功能在正常范围内对哺 乳动物有利，抑制哺乳动物患者记忆性CD4+T细胞和记忆性CD8+T细胞介导的免疫应答，其 中通过维持所述免疫功能在正常范围内对哺乳动物有利。上述实践中使用含有(I，II，III，IV)化合物和药物载体的药物组合物给药。实验证明，本发明可以抑制患有自身免疫病、炎性疾病或移植物抗宿主疾病的动 物的免疫应答，并具有低毒性和可控的副作用。以下实施方案中，本发明公开了一种通过给予动物有效量的具有化合物(I)结构 的免疫抑制剂(化合物K)而抑制动物免疫应答，并且可以结合一种或几种有抗炎作用或本 身能够调节哺乳动物免疫系统的一个或多个成分或过程的制剂。在本发明的实施中，可以给予这些化合物以抑制患有自身免疫病、炎性疾病或移 植物抗宿主疾病的动物的免疫应答，还可以给予曾经过同种异体移植或异种移植的动物。 本发明进一步包括给予本发明的化合物以抑制淋巴细胞的增殖，通过在移植(包括同种异 体和异种移植)过程之前、同时或之后给药以提高移植后的移植物的存活，减轻淋巴细胞 分泌IL-12，和/或诱导活化T细胞的无反应性或细胞凋亡。此外本发明还涉及移植物的二 次移植，给予这些化合物可以有效的抑制移植物的排斥反应，同时这些化合物还对记忆性 ⑶4+T和记忆性⑶8+T细胞具有明显的抑制作用。


图1为描述在用ConA (刀豆蛋白A)和化合物K刺激脾脏淋巴细胞试验中，随着代 表性化合物K作用浓度的变化，48小时后检测其对淋巴细胞增殖的抑制能力变化的条形图 (BrdU 法)；图2-A、图2-B和图2_C为描述在用在用ConA (刀豆蛋白A)，化合物K和Π(_506 刺激脾脏淋巴细胞(化合物K(40ug/ml)，H(-506(lug/ml)，半剂量化合物K(20ug/ml)，半剂 量 Π(-506 (0. 5ug/ml)及化合物 K (40ug/ml)与半剂量 Π(-506 (0. 5ug/ml)联合用药)，48 小 时后检测脾脏淋巴细胞IL-2，IFN-Y和IL-10基因表达的条形图(qRT-PCR)；图3为描述在化合物K和FK-506刺激(化合物K (40ug/ml)，FK-506 (lug/ml)， 半剂量化合物K (20ug/ml)，半剂量FK-506 (0. 5ug/ml)及化合物K (40ug/ml)与半剂量 FK-506 (0. 5ug/ml)联合用药)的混合淋巴细胞反应(MLR)试验中，72小时后检测T细胞增
7殖抑制情况的条形图(BrdU法)； 图4-A、图4-B和图4-C为描述在化合物K和Π(_506刺激(化合物K (40ug/ml)， FK-506 (lug/ml)，半剂量化合物 K (20ug/ml)，半剂量 Π(-506 (0. 5ug/ml)及化合物 K (40ug/ ml)与半剂量Π(-506 (0. 5ug/ml)联合用药)的混合淋巴细胞反应(MLR)试验中，72小时后 检测T细胞中IL-2，IFN- γ和IL-10蛋白表达的条形图(ELISA法)；图5-A和图5-B为描述在化合物K和Π(_506刺激(化合物K (40ug/ml)， FK-506 (lug/ml)，半剂量化合物 K (20ug/ml)，半剂量 Π(-506 (0. 5ug/ml)及化合物 K (40ug/ ml)与半剂量Π(-506 (0. 5ug/ml)联合用药)的混合淋巴细胞反应(MLR)试验中，72小时后 检测记忆性⑶4+T细胞和记忆性⑶8+T细胞增殖抑制情况的条形图(BrdU法)；图6为描述小鼠同种异体皮肤移植后移植物排斥情况，在皮肤移植第0-10天 给予免疫抑制剂治疗，包括Π(-506 (2mg/kg/d)、半剂量(Sub) FK-506 (lmg/kg/d)、化合物 K(10mg/kg/d)、Sub Π(-506+化合物K，对照组腹腔及灌胃给生理盐水，各组移植物的排斥情 况的线形图；图7为描述小鼠同种异体心脏移植后移植物排斥情况，在心脏移植第0-10天 给予免疫抑制剂治疗，包括Π(-506 (2mg/kg/d)、半剂量(Sub) FK-506 (lmg/kg/d)、化合物 K(10mg/kg/d)、Sub Π(-506+化合物K，对照组腹腔及灌胃给生理盐水，各组移植物的排斥情 况的线形图；图8为描述小鼠同种异体胰岛移植后移植物排斥情况，在胰岛移植第0-10天 给予免疫抑制剂治疗，包括H(-506(2mg/kg/d)、半剂量(Sub) Π(-506 (lmg/kg/d)、化合物 K(10mg/kg/d)、Sub Π(-506+化合物K，对照组腹腔及灌胃给生理盐水，各组移植物的排斥情 况的线形图。
具体实施例方式按照本发明的实践，通常使用以下定义。使用的术语“治疗”是指逆转，减轻和抑制过程，或者预防该术语所指的疾病或上 述疾病的一个或多个症状。使用术语“治疗作用，，和上述“治疗”含义相同。术语“移植”是指移植细胞，组织，器官或器官的部分以代替所有或部分组织功能， 如心脏、肾脏、肝脏、骨髓、皮肤、角膜、血管、肺、胰腺、肠、四肢、肌肉、神经组织、小肠、胰岛 细胞，术语“移植”还指通常和移植的细胞，组织及器官有关的大分子，无论是和细胞内或 细胞膜有关的或本质上是和细胞外有关。在这方面，特别有兴趣的大分子类型是指与移植 组织细胞外基质有关的大分子，T-细胞介导的对所述大分子的免疫应答可导致移植整体失 败。“移植”包括同种移植和异种移植。术语“免疫应答”指机体对外来或自身抗原的反应，以将它们中和和/或消灭。细 胞介导的免疫应答涉及胸腺对抗原接触作出反应产生淋巴细胞(Τ细胞)。这种反应在迟发 型过敏反应，组织移植的排斥和某些传染病中是重要的。在体液免疫应答中，对抗原接触的 反应时产生浆细胞(B细胞)，并随后形成抗体。这种应答可以产生免疫或过敏。非特异性 免疫应答或炎症是机体组织和细胞对任何来源的损伤(如外伤、生物、化学、局部缺血等) 的应答。免疫系统对任何攻击的最初应答涉及血管、化学和血细胞活性。当炎症不足以对 付损伤或生物或药剂的侵入时，需要进行特异性免疫应答。它是由T和B细胞指导和控制的。“肠道外给药”是指包括皮下、静脉内、肌肉、关节内注射或输注、胸腔内或腹腔内给药。本发明的实施本发明涉及结构含有(I，II，III，IV)化合物和药物载体的本发明药物组合物用 于治疗和/或预防动物受试者(优选哺乳动物，更优选人)免疫应答或免疫介导的应答和 疾病的用途，如预防或治疗移植后的排斥；用于治疗或预防移植物抗宿主疾病、自身免疫 病，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、多发性硬化、重症肌 无力、I型糖尿病眼色素层炎、青少年起病型或近期起病型糖尿病、眼色素层炎、格雷夫斯 病、牛皮癣、特应性皮炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、脉管炎、自身抗体介导的疾病、埃文 斯综合症等等；还用于治疗导致异常免疫应答和/或活化的传染病，如创伤性或病原体诱 导的免疫失调，包括例如，有乙型和丙型肝炎感染、金黄色葡萄球菌感染、病毒性脑炎等导 致的免疫失调，其中损害时有炎症反应诱导的(如麻风)；和用于预防或治疗循环疾病，如 动脉硬化、动脉粥样硬化、多动脉炎和心肌炎。此外，本发明还可以用于预防或抑制与基因 治疗(如将外源基因引入自体细胞并表达编码产物)有关的免疫应答。进一步的应用是指在药物组合物中的应用，可以包括治疗和/或预防免疫介导 疾病的炎性和过度增殖性皮肤病以及皮肤病症状，如血管性水肿、红斑、痤疮和脂溢性皮 炎；各种眼病(自身免疫性和其它)；变态反应，如花粉变态反应，可逆性阻塞性气道疾病， 包括如下病症如哮喘、支气管炎、变应性鼻炎等等；粘膜和血管炎症。在一个实施方案中，提供了一种用于治疗动物病症的方法，其通过抑制淋巴细胞 增殖和/或活化而记性或帮助治疗，包括服用有效量的含有(I，II，III，IV)化合物和药物 载体的本发明药物组合物。其中，所述病症可以使自身免疫、炎症、移植物/组织排斥，或者 包括许多如本文所述的由免疫诱导的或加剧的适应症中的任一种。因此本发明的一个实施方案是一种在治疗自身免疫病的药物组合物中的应用。而 本发明的的另一个实施方案是用于预防或治疗外来器官移植物的排斥，所述应用包括给予 需要这种治疗的患者有效量的本发明化合物。如上述，目前环孢菌素是用于防止移植器官排斥的主要药物。此药物通过抑制淋 巴细胞中钙调磷酸酶的功能起作用的，从而防止机体免疫系统调动其大量的天然保护剂来 排斥移植物的外源蛋白。虽然环孢菌素可以有效地对抗移植物排斥，但它具有肾毒性，并已 知会导致一些不良的副作用，包括肾衰、肝功能异常、胃肠不适和诱发癌症(Hojo等，自然 (Nature)397 :530_534，1999)。在本领域中一直在寻找具有较少毒副作用的更新、更安全的药物。本发明提供了 这样的免疫抑制剂，在不拘泥于具体的作用机制下，它似乎可以诱导持久的免疫耐受性。化 合物K可以抑制淋巴细胞的增殖，可以抑制T-细胞的增殖，还可以抑制记忆性CD4+T细胞 和记忆性⑶8+T细胞的增殖(如减少IL-2和IFN- γ的产生，增加了 IL-10的表达)。为了确定一种具体的化合物是否为有效地免疫抑制剂，可以运用本领域已知的多 种方法。在这方面，可以在与刺激同事或在刺激之后使淋巴细胞与所感兴趣的化合物接触 以后，测定其增殖和/或活化。例如，T细胞活化和随后的增殖诱导(以及作为炎症的起始 物)的关键标记是产生IL-2、IFN-γ、⑶25、⑶69或⑶154，它们可以由各种方法测得，包括ELISA，流式细胞仪和qRT-PCR。还可以使用其它常用于测定细胞增殖和细胞因子分泌的试 验方法，包括使用碘化丙锭染色的比色试验，MTT (3- [4，5- 二甲基噻唑-2-基])2-5- 二苯 基溴化四唑鐺，活体染色法，细胞计数，BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)或H3参入试验(参见 如Avian Dis. 43(2) :172_181，1999 ；Anticancer Res.(抗癌研究)17(1B) :725_728，1997 ； Levine 等，Int. j. Immun.(国际免疫学杂志)7 (6) :891_904，1995 ；Hara 等，J. Exp. Med. (实验医学杂志)161 1513-1524,1985 ；Harding 等，Nature (自然)356 :607_609，1992 ； Linsley 等，Science (科学)257 :792_795，1992)。活化淋巴细胞和因此刺激淋巴细胞增殖的方法在本领域中时已知的，所述方法包 括在IL-2存在或不存在下采用植物凝集素(PHA)、伴刀豆蛋白A(ConA)、抗CD3抗体(在抗 CD28抗体存在或不存在下)、同种异体细胞、超抗原或离子霉素/PMA进行刺激(Paul，基础 免疫学(Fundamental Immunology),第 4 版，Lippincott-Raven, 1998)。有多种体外和动物模型用于测试和验证本发明免疫抑制化合物及其对特定的与 免疫系统相关的疾病或适应症的适用性。因此，本领域普通技术人员可以容易地从本领 域现有的模型中选择适宜的模型。这些模型包括代表性地用于自身免疫病和炎性疾病 的模型，如多发性硬化(EAE模型)、类风湿性关节炎、移植物抗宿主疾病(用于研究移植 物排斥的用皮肤移植模型、心脏移植、胰岛移植、肾脏移植、大肠和小肠移植等等的移植 模型)、哮喘模型等等。(参见例如，Takakura等· Exp. Hematol.(实验血液学)27 (12) 1815-821,1999 ；Hu 等，Immunology(免疫学)98(3) :379_385· 1999 ；Theofilopoulos 和 Dixon, Adv. Immunol.(免疫学进展)37 :269_389，1985 ；Bonnevilie 等，Nature (自然)344 163-165，1990 ；Dent 等，Nature (自然)343 :714_719，1990 ；Todd 等，Nature (自然)351 542-547，1991 ；Morris 等，Clin. Immunol. Immunopatho 1.(临床免疫学免疫病理学)57 263-273,1990 ;Takahashi 等，Cell(细胞)76 :969_976，1994 ;Current Protocols in Immunology (最新免疫学方法)，Richard Coico (Ed.)，John Wiley & Sons，Inc.，第 15 章， 1998)。需要治疗以抑制免疫系统的受试者包括患有自身免疫病的受试者；接受移植的受 试者；和患有心血管疾病的受试者；患有变态反应的受试者；和患有外伤或病原诱导的免 疫失调的受试者。“受试者”优选为哺乳动物如人，但是本发明也可以广泛地用于治疗其它 哺乳动物，例如宠物(如猫、狗等等)，农场大型哺乳动物(如牛、羊等等)和实验室动物(如 大鼠、小鼠、豚鼠等等)。“有效量”是实现预期治疗和/或预防效果所需的化合物的剂量；例如引起个体或 动物的原初或记忆免疫应答，或抑制受试者器官移植排斥的化合物的剂量。“预期治疗和/ 或预防效果”包括例如对患有或可能患有自身免疫病的个体或动物延长寿命或改善症状， 所述自身免疫疾病如哮喘、牛皮癣、类风湿性关节炎、多发性硬化等等。可以改善的症状的 实施包括糖尿病中的高血糖；关节痛；类风湿性关节炎中的僵直和不动症；多发性硬化中 的麻痹。在胰岛素依赖型糖尿病方面，“预期治疗和/或预防效果”包括减轻或预防由疾病 导致的继发性并发症，如血管疾病。适宜的剂量取决于受试者的年龄、健康和体重、疾病的 程度、同事进行的治疗的种类(如果有的话)，治疗频率和预期效果的性质。例如，剂量可以 从约0. 01到1000毫克/天。通常，一次或分多次应用0. 1-100毫克/天可以有效获得预 期结果。在某些实施方案中，可以调整剂量以维持未活化的淋巴细胞和/或T细胞，而使活化的淋巴细胞和/或T细胞无反应性和/或暂时的功能性无应答。在其它实施方案中，高 级脂肪酸衍生物治疗实现了免疫抑制效果；而在其它实施方案中，所用的剂量没有明显的 毒副作用。但是，在临床试验中可以用本领域可获得的常规试验方法，容易地确定有效剂量 范围。这些剂量是用于预防或治疗自身免疫病，预防或治疗外来移植物排斥和/或相关的 痛苦、疾病和病症的有效量。所述化合物可以单独给药或与其它药学活性剂联合给药，如与其它免疫抑制剂或 与抗生素和/或抗病毒剂一起给药。可以同时给药的化合物包括固醇(如甲基泼尼松龙) NSAIDs和其它已知的免疫抑制剂，例如硫唑嘌呤、15-脱氧精胍菌素、环孢菌素、咪唑立宾、 布喹那钠、来氟米特、Π(-506、雷帕霉素和相关化合物。这些药物的剂量也取决于治疗的条 件和个体变化。可以通过适宜的途径，以单剂或多剂对有效量的所述化合物进行给药。药物制剂药学上可以接受的盐包括金属(无机)盐和有机盐，在Remington’ s Pharmaceutical Science，第17版，第1418页(1985)中给出了这些物质的清单。本领域 技术人员熟知可以根据物理和化学稳定性、流动性、吸水性和溶解度来选择适宜的盐形式。 本领域技术人员可以理解药学上可接受的盐包括但不限于无机酸盐，如盐酸盐，硫酸盐，磷 酸盐，二磷酸盐，氢溴酸盐和硝酸盐；或者有机酸盐，如苹果酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、酒 石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐或棕榈酸盐、水杨酸 盐和硬脂酸盐。类似地，药学上可以接受的阳离子包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂、和铵。由 于上述原因而优选的本发明的盐包括钾盐、钠盐、钙盐、和铵盐。本发明的保护范围还包括 本发明化合物的立体异构体、晶形、水合物和溶剂化物。作为免疫抑制剂，这些化合物用于预防或治疗自身免疫病，预防或治疗外来移植 物排斥和/或相关的痛苦、疾病和病症。根据本发明，可以通过任何使活性成分化合物与恒温动物身体上的作用部位进行 接触的方法给予本发明化合物，用于治疗自身免疫病，预防外来器官移植排斥和/或相关 的痛苦、疾病和病症。例如，可以通过口服、局部给药，包括透皮、眼、口腔、鼻内、吸入、阴道 内、直肠、脑室内和肠道外给药。可以通过任何常规的与药剂结合使用的方法，将所述化合物作为单独的治疗剂或 与治疗剂组合进行给药。它们可以单独给药，但一般与药学载体一起给药，这些载体根据所 选择的给药途径和常规药学实践进行选择。活性成分可以以下列形式口服给药固体剂型，如胶囊、片齐IJ、锭齐IJ、糖衣丸、颗粒 剂和粉剂；或液体剂型，如糖浆、乳剂、分散体和悬浮液。活性成分还可以以下列形式肠道 外给药无菌液体剂型，如分散体、悬浮液或溶液。还可以使用其它剂型进行这种成分的给 药，如作为用于局部给药的软膏、乳膏、滴剂、透皮贴片或粉剂，作为用于眼睛给药的沿用溶 液或悬浮液构成物，即眼用溶液滴剂，作为用于吸入或鼻内给药的气雾剂或粉剂组合物，或 作为用于直肠或阴道给药的乳膏、软膏、喷雾剂或栓剂。明胶胶囊含有活性成分和粉末载体，如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂 酸等等。可以用类似地稀释剂制成压片。片剂和胶囊都可以制成缓释产物在数小时内持续 释放药物。可以将压片进行糖包衣或薄膜包衣以掩盖任何不适的味道和保护片剂免受空气影响，或者进行肠包衣使片剂选择性在胃肠道中崩解。用于口服给药的液体剂型可以含有着色剂和调味剂使患者更能接受。—般来说，水、适宜的油、盐水、右旋糖水溶液和相关的糖溶液与二醇如(丙二醇 或聚乙二醇)是适宜用于肠道外溶液的载体。用于肠道外给药的溶液优选包含活性成分 的水溶性盐，适宜的稳定剂，如需要还包含缓冲物。单独或组合使用的抗氧化剂如酸式亚 硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸式适宜的稳定剂。还使用柠檬酸及其盐和乙二胺四乙酸钠 (EDTA)。在某些实施方案中，可以通过使用5ml 95%乙醇来溶解稀释30mg的高级脂肪酸衍 生物，然后再用磷酸盐缓冲液(PBS)将所得溶液进一步稀释至最终药物浓度在0.01-6mg/ ml范围内。为进行吸入给药，可以以加压包装或喷雾器喷出的气雾剂形式方便给予本发明的 化合物。还可以以配制成的粉剂给予此化合物，这种粉剂组合物可以在吹入式粉剂吸入器 装置的帮助下被治疗者吸入。为进行眼睛给药，可以在适宜眼用赋形剂中的本发明化合物的适宜重量百分比的 溶液或悬浮液配制眼用制剂，以使此化合物保持与眼表面接触充足的时间以治疗粘膜表面 或透过角膜或眼睛的内部区域。本发明化合物分步给药或与其它治疗剂联合给药的时候一般可使用相同的剂型。当以物理联合给药时，应根据联合药物的相容性选择剂型和给药途径。因此，术语 共同给药应理解为包括同时或依次给予两种药剂，或者可作为两种活性成分的固定剂量的 联合。由此可见，虽然举例说明，本文描述了本发明的具体实施方案，但可以在不背离本 发明的构思和保护范围的情况下进行各种改动。因此，除了由所附的权利要求限定之外，本 发明未被限定。而且，本文涉及的所有的期刊论文和参考文献整体引入作为参考。实施例1脾脏淋巴细胞刺激和测定试验的原始记录如下药物的处理1.取适量化合物于安培瓶中，用少量95%乙醇溶解，0.22um滤膜过 滤，用之前用1640 (Gibco, USA)培养液稀释成一定浓度的溶液。2.将2mg Con A (Sigma, USA)用PBS平衡盐溶液配成400ug/ml，于-20°C保存。断颈处死C57bl/6小鼠，置75%酒精浸泡Imin后用无菌眼科剪、眼科镊取下脾 脏。机械法捣碎脾脏，加3ml小鼠淋巴细胞分离液(好易得，北京达科为)，充分混勻后滤 网过滤，转移到IOml离心管中，在分离液上方覆盖500uL的1640培养液。2000r/min，离 心30min，取中间淋巴细胞层，PBS洗涤三遍得到淋巴细胞，计数，加淋巴细胞到96孔板中， 3 X IO5/孔，平行做3复孔。用1640培养液连续2倍稀释化合物，设定化合物K的梯度浓度 2. 5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml、160ug/ml，用 5ug/ml 的 Con A 处理 细胞作阳性对照，没有Con A处理细胞作阴性对照。每孔补加适量10% 1640培养液，使终 体积为200ul/孔。在37°C培养箱(Thermo, USA)中培养48h，加入BrdU培养12小时后用 BrdU增殖试剂盒(Milipore，USA)进行检测。结果如图1，发现随着化合物K的工作浓度的升高，其对淋巴细胞增殖的抑制作用 效果增强，但是浓度达到40ug/ml之后，后面浓度的抑制作用差别不大，可能后面随着浓度的升高，其副作用也在增强或者是因为作用靶点已经饱和。在40ug/ml的浓度下，对淋巴细 胞增殖的抑制效果最佳，说明化合物K对淋巴细胞有一定的免疫抑制效果。实施例2脾脏淋巴细胞IL-2，IL-10和IFN-γ基因表达测定，和临床免疫抑制剂Π(-506比 较试验的原始记录如下药物的处理1.取适量化合物于安培瓶中，用少量95%乙醇溶解，0.22um滤膜过 滤，用之前用1640 (Gibco，USA)培养液稀释成一定浓度的溶液。2.将2mg Con A用PBS平衡 盐溶液配成 400ug/ml，于-20°C保存。3.将 25mg FK-506 (ALEXIS, Switzerland)用 5mlPBS 溶解，分装成200ul/管，于-20°C避光保存。分离得到脾脏淋巴细胞(同实施例1)计数，加淋巴细胞到96孔板中，3X IO5/孔， 平行做6复孔。用1640培养液分别稀释化合物和Π(-506，设定如下实验组化合物K(40ug/ ml)(实施例1证明其为有效抑制浓度)，Π(-506 (lug/ml)，半剂量化合物K (20ug/ml)，半剂 量Π(-506(0. 5ug/ml)及化合物 K (40ug/ml)与半剂量Π(_506 (0. 5ug/ml)联合用药。用 5ug/ ml的Con A处理细胞作阳性对照，没有Con A处理细胞作阴性对照。每孔补加适量10% 1640培养液，使终体积为200ul/孔。在37°C培养箱中培养48h后，离心收集各组淋巴细胞。 提取RNA，经过逆转录PCR得到cDNA样本。之后取2uL逆转录产物(每个样本3复孔，每孔 2uL)，用实时定量PCR对其进行分析(ABI st印one系统，Biosystems)。以Syber Green I 和β-actin为参照，检测各组移植物中IL-2、IFN-y和IL-IO基因的表达量。引物序列如 下β-actin forward 5' -CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3‘，and reverse 5' -ATGGAGCCACCGATCCACA-3‘；IL-2 forward 5' -GGAGCAGCTGTTGATGGACCTAC-3‘，and reverse 5' -AATCCAGAACATGCCGCAGAG-3‘；IFN-y forward5' -CGGCACAGTCATTGAAAGCCTA-3‘，and reverse 5' -GTTGCTGATGGCCTGATTGTC-3‘；IL-10 forward 5' -GACCAGCTGGACAACATACTGCTAA-3‘，and reverse 5' GATAAGGCTTGGCAACCCAAGTAA-3.结果如图2-A、2-B、2_C，发现化合物K抑制淋巴细胞中IL-2和IFN-γ基因表达， 并且可明显增强IL-10基因的表达。说明化合物可能通过抑制IL-2基因的表达来抑制淋 巴细胞增殖，也可能通过上调IL-10的表达来诱导调节型T细胞的生成，从而达到抑制细胞 增殖的目的。此外，化合物K与半剂量的Π(-506联合作用的抑制效果最好，说明两者具有 协同作用。实施例3T淋巴细胞增殖的测定，和临床免疫抑制剂Π(-506比较试验的原始记录如下药物的处理1.取适量化合物于安培瓶中，用少量95%乙醇溶解，0.22um滤 膜过滤，用之前用1640培养液稀释成一定浓度的溶液。2.将25mg FK-506 (ALEXIS, Switzerland)用5mlPBS溶解，分装成200ul/管，于_20°C避光保存。
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刺激细胞的制备断颈处死BALB/c(H-2d)小鼠，置75%酒精浸泡Imin后用无菌 眼科剪、眼科镊取下脾脏。机械法捣碎脾脏，加3ml小鼠淋巴细胞分离液，充分混勻后滤网 过滤，转移到IOml离心管中，在分离液上方覆盖500uL的1640培养液。2000r/min，离心 30min，取中间淋巴细胞层，PBS洗涤三遍。制成脾淋巴细胞悬液后用20 μ g/ml的丝裂霉素 (AMERESCO, USA)处理30min，作为刺激细胞。反应细胞的制备断颈处死C57bl/6小鼠，制备脾脏淋巴细胞后准备适量尼龙毛 (Wako，Japan)，先将尼龙毛浸泡在适量PBS中5min，后用IOml含5%胎牛血清的1640培养 液洗涤柱子，洗完柱子后加适量体积的淋巴细胞，再在其上方覆盖一层Iml培养液于37°C 细胞培养箱孵育lh，用IOml含5%胎牛血清的1640培养液将未结合的T淋巴细胞洗脱下 来。收集洗脱液到IOml离心管中离心，2000r/min, 5min,分离得到T细胞作为反应细胞。加板分别对刺激细胞和反应细胞计数，调刺激细胞浓度为2X IO6个/ml，反应细 胞浓度为5X IO6个/ml，分别加5X IO4个刺激细胞和5X IO5个反应细胞到96孔板中使刺 激细胞与反应细胞的比例为1 10，平行做3复孔。设置如下几个检测组化合物K (40ug/ ml)，FK-506 (lug/ml)，半剂量化合物 K (20ug/ml)，半剂量 FK-506 (0. 5ug/ml)及化合物 K(40ug/ml)与半剂量H(-506(0.5Ug/ml)。每孔补加适量10% 1640培养液，使终体积为 200ul/孔。在培养箱中培养72h，加入BrdU培养12小时后用BrdU增殖试剂盒(Milipore， USA)进行检测。结果如图3，化合物K对T细胞增殖有一定的抑制作用，但发现联合用药组 对T细胞增殖的抑制效果最佳，说明化合物与Π(-506有协同抑制作用，这说明两种药物作 用机制可能不同。实施例4T淋巴细胞IL-2，IL_10和IFN-γ表达蛋白的测定，和临床免疫抑制剂Π(-506比 较试验的原始记录如下主要过程同实施例3在培养箱中培养72h后，收集各空细胞上清培养液。用ELISA试剂盒(BendenUSA) 检测IL-2、IFN- γ和IL-10的表达水平，每组做3复孔。结果如图4-A、4-B、4-C，化合物K对T细胞IL-2、IFN-Y表达具有一定的抑制 作用，可能说明化合物K作用机制类似于Π(-506。此外，发现联合用药组对T细胞IL-2、 IFN-Y表达的抑制效果最佳，说明化合物与Π(-506有协同抑制作用，这也说明两种药物作 用机制可能不同；化合物K还可以增强IL-10的表达，可能通过诱导调节型T细胞的产生起 到一定的免疫抑制作用。实施例5记忆性⑶4+Τ细胞和记忆性⑶8+Τ细胞增殖的测定，和临床免疫抑制剂Π(-506比 较试验的原始记录如下药物的处理1.取适量化合物于安培瓶中，用少量95%乙醇溶解，0.22um滤 膜过滤，用之前用1640培养液稀释成一定浓度的溶液。2.将25mg FK-506 (ALEXIS, Switzerland)用5mlPBS溶解，分装成200ul/管，于_20°C避光保存。刺激细胞的制备同实施例3。
反应细胞的制备断颈处死一只一个月前移植BALB/c(H-2d)皮肤的C57bl/6小 鼠，置75%酒精浸泡Imin后用无菌眼科剪、眼科镊取下脾脏。机械法捣碎脾脏，加3ml小鼠 淋巴细胞分离液(好易得，北京达科为)，充分混勻后滤网过滤，转移到IOml离心管中，在 分离液上方覆盖500uL的1640培养液。2000r/min，离心30min，取中间淋巴细胞层，PBS洗 涤三遍得到淋巴细胞，计数，分别用记忆性CD4+T细胞和记忆性CD8+T细胞磁珠分离试剂盒 (R&D Systems, Inc. USA)，按照制造商的说明书分离得到⑶4+T细胞和记忆性⑶8+T细胞。加板分别对刺激细胞和反应细胞计数，调刺激细胞浓度为2X IO6个/ml，反应 细胞浓度为5X IO6个/ml，分别加5X IO4个刺激细胞和5X IO5个反应细胞到96孔板中 使刺激细胞与反应细胞的比例为1 10，平行做3复孔。设置如下几个检测组化合物 K(40ug/ml)，FK-506 (lug/ml)，半剂量化合物 K (20ug/ml)，半剂量 Π(-506 (0. 5ug/ml)及化 合物K(40ug/ml)与半剂量Π(-506 (0. 5ug/ml)。每孔补加适量10% 1640培养液，使终体积 为200ul/孔。在培养箱中培养48h，加入BrdU培养12小时后用BrdU试剂盒(Milipore, USA)进行检测。结果如图5-A和5-B，化合物K分别对⑶4+T细胞和记忆性⑶8+T细胞细 胞增殖有一定的抑制作用，但发现联合用药组对T细胞增殖的抑制效果最佳，说明化合物 与Π(-506对CD4+T细胞和记忆性CD8+T细胞细胞增殖有协同抑制作用，这也说明两种药物 作用机制可能不同。实施例6预防和/或延迟小鼠皮肤移植排斥的发生本实施例举例说明了代表性的化合物K预防和/或延迟小鼠皮肤移植排斥的发生 的能力。皮肤移植模型的制备用戊巴比妥钠皮下注射麻醉供者鼠(BALB/c(H-2d)小鼠)， 用胶布背部向上固定于另一个操作台上，背部皮肤备皮、酒精消毒。在小鼠颈部胸骨上切迹 水平及肋脊角水平分别做横切口，沿两侧腋后线做纵行切口，完整取下背部皮肤。将背部皮 肤置于4°C生理盐水中修剪成直径略大于1. 2cm的圆形皮片。用Iml注射器吸取进口麻醉 (Hypnorm Midazolam NaCl = I 1 2)按 0. lml/10g 皮下注射给受体鼠(C57bl/6 小 鼠)。约5min后，小鼠麻醉状态良好，遂将受体鼠背部向上用胶布将四肢固定于操作台上， 背部皮肤备皮、酒精消毒。用眼科弯剪剪除直径约1. 5cm的圆形背部皮肤，将修剪好的供体 皮片平整置于皮肤缺损处。用5-0丝线连续缝合皮肤。将移植模型放在加热垫上，IOmin左 右苏醒后放回笼中饲养。给药在移植第0-10天给予免疫抑制剂治疗，包括Π(-506 (2mg/ kg/d)、半剂量(Sub) FK-506 (lmg/kg/d)、化合物 K (10mg/kg/d)、Sub FK-506+ 化合物 K，对照 组腹腔及灌胃给生理盐水。术后皮肤生长情况判断移植物是否存活，皮肤脱落即判断为完 全排斥，每天观察一次，直至移植物完全排斥。结果如图6所示，正常的皮肤排斥时间为11-15天，而使用Π(-506后，移植的皮 肤平均存活时间为52. 5天，使用半剂量Π(-506的平均存活天数为32天，使用化合物K的 平均存活天数为33天，化合物K和半剂量Π(-506联合用药的存活天数为56. 5天。说明化 合物K具有抑制移植皮肤排斥的能力，与半剂量Π(-506联合用药可以达到甚至超过全剂量 FK-506的效果，这在临床应用上具有重要的意义。实施例7预防和/或延迟小鼠心脏移植排斥的发生
本实施例举例说明了代表性的化合物K预防和/或延迟小鼠心脏移植排斥的发生 的能力。心脏移植模型的制备用Iml注射器吸取进口麻醉剂 (Hypnorm Midazolam NaCl = I 1 2)按 0. lml/10g 皮下注射给 C57bl/6 小鼠。约 5min后，小鼠麻醉状态良好，遂将受体鼠腹部向上用胶布将四肢固定于操作台上。在小鼠颈 部于正中线、下颂到胸骨上切迹2/3处做横切口。找到颈外静脉，游离3 5mm，将侧支电 凝。然后近心端用血管夹夹闭，于远心端结扎、切断。将一段外层套管套在近心端颈静脉外 侧，用小弯钩(1号注射器针头制备)钩出颈外静脉，插入内层套管。用镊子将断端静脉向 外侧翻转套住外管，露出内膜。在外翻处用6-0丝线节结扎，拔出内管。向深部分离组织， 暴露颈动脉，方法同上制作颈动脉套管。用戊巴比妥钠皮下注射麻醉BALB/c(H-2d)小鼠， 用胶布腹部向上固定于另一个操作台上，做腹正中切口开腹，拨开肠道暴露下腔静脉，顺血 流方向注射含10%肝素的生理盐水0. 5ml冲洗心脏，然后将腔静脉和肺静脉结扎，离断；将 主动脉和肺动脉离断；将胸主动脉套到颈动脉套管上，其内膜与颈动脉外翻的内膜相接，在 外侧用6-0丝线节扎；将上腔静脉套到颈静脉套管上，其内膜与颈静脉外翻的内膜相接，在 外侧用6-0丝线节扎；打开颈动脉和颈静脉的血管夹，移植心脏复苏。用6-0丝线连续缝合 皮肤。将移植模型放在加热垫上，IOmin左右苏醒后放回笼中饲养。给药在移植第0-10天给予免疫抑制剂治疗，包括Π(-506 (2mg/kg/d)、半剂量 (Sub)FK-506(lmg/kg/d)、化合物 K(10mg/kg/d)、Sub FK-506+ 化合物 K，对照组腹腔及灌胃 给生理盐水。术后由颈部搏动情况判断移植物是否存活，搏动停止即判断为完全排斥，每天 观察两次，直至移植物完全排斥。结果如图7所示，正常的同种异体小鼠心脏移植排斥时间为6-8天，而使用 FK-506后，移植的皮肤平均存活时间为19天，使用半剂量Π(-506的平均存活天数为13. 5 天，使用化合物K的平均存活天数为13. 5天，化合物K和半剂量Π(-506联合用药的存活天 数为22天。说明化合物K具有抑制移植心脏排斥的能力，与半剂量Π(-506联合用药可以 达到甚至超过全剂量Π(-506的效果，这在临床应用上具有重要的意义。实施例8预防和/或延迟小鼠胰岛移植排斥的发生本实施例举例说明了代表性的化合物K预防和/或延迟小鼠胰岛移植排斥的发生 的能力。糖尿病模型的诱导胰岛移植前一周，通过对受体小鼠注射STZ注射(180mg/ kg. bw, BBI, USA)诱导糖尿病模型。自第3天开始每天使用血糖仪(FreeStyle，Abbott, USA)检测血糖，连续两次血糖> 16. 7mmol/L定义为建模成功。胰岛的分离、纯化与移植按需用D-HBSS配制lg/L的胶原酶P溶液，融化后按每 个胰腺3ml准备到IOml注射器中并接好头皮针；另准备50ml离心管，每管每只鼠加入Iml CLSV，一并置于冰中。将BALB/c (H-2d)小鼠用4ml/kg的10%水合氯醛加2ml/kg的芬太尼 麻醉。75%乙醇消毒腹部皮肤，打开腹腔，将内脏拨至右侧，肝脏外展暴露胰腺及胆总管，在 胆总管进入十二指肠处用将其夹毕。剪心放血处死小鼠。体视显微镜下用4. 5号头皮针穿 刺胆总管，缓慢注入胶原酶V溶液3ml，使胰腺逆行进入胰腺总管，充分均勻膨胀胰腺。用无 损伤镊子沿十二指肠边缘自十二指肠向小肠方向剥离胰腺组织，分离脾脏和脂肪组织后，
16将胰腺转移至备好的50ml离心管中，冰上保存。38°C水浴静止准确消化20min，剧烈震荡5 次使其成细砂状，加入冰浴的含10%新生牛血清的洗涤液I至终体积50ml终止消化，在冰 上用20目不锈钢滤网过滤，无制动离心机点转离心，转速达1360rpm后停止离心并弃去上 清，洗涤液II洗涤一次，IOml洗涤液II重悬沉淀。将悬液转移至IOml离心管中，无制动离 心机点转离心，转速达1360rpm后停止离心，充分弃去上清。加入4ml淋巴细胞分离液，轻 柔吹吸混勻沉淀，向上层缓慢加入HBSS溶液2ml，无制动离心机离心1600rpm，20min。离心 完毕，5ml枪头吸取界面层，置于另一加入含40ml HBSS的50ml离心管中，充分混勻，无制动 离心机点转离心，转速达1360rpm后停止离心，弃去上清后将重悬的沉淀经IOOum尼龙滤网 过滤，转移未滤过物至一次性培养皿中，体式显微镜下手挑胰岛至用含抗生素和10%小牛 血清的RPMI1640培养基中。胰岛挑取完毕，置于37°C、5% CO2培养箱中培养，备实验，培养 时间< 24h。用供体鼠同样的麻醉方法麻醉C57bl/6小鼠，左侧身体向上侧卧固定四肢，左 肾周围备皮，酒精消毒整理毛发。在左肾上方皮肤剪开小口，使左肾可以恰好挤出体外。用 针头在左肾下极侧开小口，用4号平口工程针扇形分离肾被膜。将注射装置插入肾被膜深 处，旋转移液枪注射胰岛，防止胰岛外流。注射完成后，电凝器封住肾被膜上切口并缝合小 鼠皮肤。整个操作须在电热毯上进行，完成后注意小鼠护理。给药在移植第0-10天给予免疫抑制剂治疗，包括Π(-506 (2mg/kg/d)、半剂量 (Sub)FK-506(lmg/kg/d)、化合物 K(10mg/kg/d)、Sub FK-506+ 化合物 K，对照组腹腔及灌胃 给生理盐水。术后每天使用血糖仪(FreeStyle，Abbott，USA)检测血糖，连续两次血糖浓度 大于11. lmmol/L判断为胰岛已经排斥。结果如图8所示，正常的同种异体小鼠胰岛移植平均排斥时间为14天，而使用 Π(-506后，移植的皮肤平均存活时间为47.5天，使用半剂量冊-506的平均存活天数为 24. 5天，使用化合物K的平均存活天数为27. 5天，化合物K和半剂量Π(_506联合用药的存 活天数为68天。说明化合物K具有抑制移植胰岛排斥的能力，与半剂量Π(-506联合用药 超过使用全剂量Π(-506的效果，这在临床应用上具有重要的意义。综上所述，本发明给出了含有化合物(I)结构的化合物K在预防或治疗多种疾病 药物组合物的应用，当然，含有化合物(II，III，IV)或化合物(I，II，III，IV)中的几种组 合的免疫抑制剂对预防或治疗多种疾病也有同样的功效，本文对其实验不做赘述。
1权利要求
高级脂肪酸衍生物的免疫抑制剂，其特征在于包括如下式所述的化合物及其药学上可接受的盐，溶剂化物或水合物中的一种或多种组合(1)化合物ICH3(CH2)m1CH＝CH(CH2)n1COR其中10≤m1+n1≤22，m1＝1～13，n1＝1～21；R为 CH3、 CH2CH3、 CH(CH3)2、 (CH2)3CH3、 (CH2)2CH2CH3、 C(CH3)3、环己烷基、苯甲基、乙醇胺基、二甲氨基乙胺基， N(CH2CH2Cl)2， N(R1)CONHR2；R1、R2可以相同，也可以不同，为如下结构A、B、C、D、E独立地选自 H、 OH、 NH2、 NO2、 CH3、 OCH3、 OCH2CH3、 CH2NH2；(2)化合物IICH3(CH2)m2CH＝CH(CH2)n2CH＝CH(CH2)X1COR其中m2+n2≤11；8≤m2+n2+x1≤20；m2＝1、4、7、10；n2＝1、4、7、10；x1≥1；R同化合物I式中的R；(3)化合物IIICH3(CH2)m3CH＝CH(CH2)n3CH＝CH(CH2)x2CH＝CH(CH2)yCOR其中m3+n3+x2≤9；6≤m3+n3+x2+y≤18；m2＝1、4、7；n2＝1、4、7；x2＝＝1、4、7；y≥1；R同化合物I式中的R；(4)化合物IVCH3(CH2)zCOR其中z＝12～24；R同化合物I式中的R。FSA00000066336900011.tif
2.根据权利要求1所述的高级脂肪酸衍生物的免疫抑制剂，其特征在于所述药学上 可接受的盐是指与酸所形成的盐，以及与强碱所形成的盐。
3.根据权利要求1所述的高级脂肪酸衍生物的免疫抑制剂，其特征在于所述化合物 包括化合物I、化合物II、化合物III、化合物IV的所有构象异构体；化合物还包括化合物 I、化合物II、化合物III、化合物IV的所有旋光异构体以及外消旋体，非对映异构体和上述 异构体的混合物；还包括化合物I、化合物II、化合物III、化合物IV的互变异构体及立体 异构体，以及任一上述形式的混合物。
4.根据权利要求1所述的高级脂肪酸衍生物的免疫抑制剂，其特征在于所述药学上 可接受的盐是药学上可接受的酸的加成盐，药学上可接受酸的加成盐的酸形成非毒性酸加 成盐的酸，即含有药学上可接受的阴离子的盐，例如盐酸盐，硝酸盐，硫酸盐，硫酸氢盐，磷 酸盐，乙酸盐，乳酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，琥珀酸盐，马来酸盐，葡糖酸盐，苯甲酸盐，甲基 磺酸盐，苯基磺酸盐，对甲苯磺酸盐和二羟基萘酸盐。
5.根据权利要求1所述的高级脂肪酸衍生物的免疫抑制剂，其特征在于所述药学上 可接受的盐是药学上可接受的碱加成盐，药学上可接受碱的加成盐的碱形成非毒性碱加成 盐的碱，非毒性碱的盐包括但是不限于药学上可接受的阳离子，例如碱金属阳离子，碱土金 属阳离子，铵或水溶性胺的加成盐，以及低级烷基铵和药学上可接受的有机胺的其它碱性
6.根据权利要求1所述的高级脂肪酸衍生物的免疫抑制剂在治疗或预防哺乳动物患者疾病的药物组合物中的应用。
7.根据权利要求1所述的高级脂肪酸衍生物的免疫抑制剂在治疗或预防哺乳动物炎 症疾病的药物组合物中的应用。
8.根据权利要求1所述的高级脂肪酸衍生物的免疫抑制剂在治疗或预防哺乳动物过 敏反应疾病的药物组合物中的应用。
9.根据权利要求1所述的高级脂肪酸衍生物的免疫抑制剂在治疗或预防哺乳动物 T-细胞，白血病和T-细胞淋巴瘤的药物组合物中的应用。
10.根据权利要求1所述的高级脂肪酸衍生物的免疫抑制剂在治疗或预防哺乳动物器 官移植免疫排斥的药物组合物中的应用。
全文摘要
本发明公开一种高级脂肪酸衍生物免疫抑制剂，包括化合物I，CH3(CH2)m1CH＝CH(CH2)n1COR，化合物II，CH3(CH2)m2CH＝CH(CH2)n2CH＝CH(CH2)X1COR，化合物III，CH3(CH2)m3CH＝CH(CH2)n3CH＝CH(CH2)x2CH＝CH(CH2)yCOR，化合物IV，CH3(CH2)zCOR及其药学上可接受的盐，溶剂化物或水合物中的一种或多种组合。此免疫抑制剂适用于治疗或预防哺乳动物患者疾病，治疗哺乳动物炎症疾病，治疗哺乳动物过敏反应疾病，治疗哺乳动物T-细胞，白血病和T-细胞淋巴瘤，治疗哺乳动物疾病，可以抑制患有自身免疫病、炎性疾病或移植物抗宿主疾病的动物的免疫应答，并具有低毒性和可控的副作用。
文档编号A61K31/121GK101919832SQ201010148460
公开日2010年12月22日 申请日期2010年4月9日 优先权日2010年4月9日
发明者王永志, 秦箐, 邝晓慧, 齐志权 申请人:厦门大学