专利名称：脂肪生成抑制因子的衍生物、其制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及脂肪生成抑制因子(AGIF)的新衍生物，其制备方法及其用途，它还涉及某些已知AGIF衍生物的用途。
AGIF是一种已显示出能够抑制原-脂细胞分化成脂细胞的蛋白质。该蛋白质有时亦称为白细胞介素11(IL-11)，它已被人们从基质细胞系KM-102中分离出来，该细胞系是由人体骨髓中获得的[序列识别号为NO.4，Kawashima等人，FEBSLet-ters，283(1991)199-202和Ohsumi等人，FEBSLetters，288(1991)13-16]。所分离出的蛋白质已经显示出能够抑制原脂细胞系H-1/A分化成脂细胞，所述细胞系H-1/A是由鼠骨髓获得的。
在本发明的最早优选权日以后公开的PCTWO92/13955中描述在硫氧还蛋白和IL-11中缺失N-末端脯氨酸残基的IL-11衍生物之间的一种融合蛋白，该文献既没有讨论AGIF衍生物本身，也没有讨论该化合物的活性。
众所周知所有造血细胞(即与血液形成有关的细胞)，如红细胞、中性白细胞、单核细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、血小板以及淋巴细胞均是通过分化(也叫造血)而由骨髓中的母细胞形成的。这些母细胞通常作为多能性干细胞为人们所知。人们已经知道多能性干细胞的造血及增殖受多种造血因子以及与骨髓基质细胞的细胞间相互作用的调节。这类造血因子的例子有菌落刺激因子，如粒细胞一巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞菌落刺激因子(M-CSF)和粒细胞菌落刺激因子(G-CSF)。正如Dexter和Spooncer在Ann.Rev.CellBiol.，3(1987)423-441中所述，造血通常发生在“造血微观环境”中。
已经知道原脂细胞在造血微观环境中具有支持作用，但当这些细胞分化成脂细胞时，该支持作用就会丧失[HiroakiKo-dama“SOSHIKIBAIYO(TissueCulture)”，12(1986)191-195]。这一点已通过鼠原脂细胞系PA6而获得了证明。该细胞系能支持造血，但该支持作用随着PA6细胞分化成脂细胞而下降(Kodama等人，J.Cell.Physiol.，118(1984)233-240]。
人们还知道将PA6细胞和鼠骨髓细胞，即多能性干细胞一起培养会导致形成胚细胞菌落、巨核细胞菌落和巨噬细胞菌落[HiroakiKodama，“JIKKENIGAKU(ExperimentalMedicine)”，5(1987)826-830]。由于人们已从人体骨髓细胞中分离出了AG-IF，故人们相信该蛋白质直接作用在骨髓原脂细胞上，从而抑制它们的分化，由此可以使该原脂细胞支持该多能性骨髓干细胞的造血。
实验已进一步表明由骨髓中得到的这种原脂细胞系H-1/A产生了一种菌落刺激因子(CSF)，这是一种已知的造血因子。由该原脂细胞产生的CSF的数量随这些细胞分化成脂细胞而下降[Nakamura等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，179(1985)283-287]。
因此，人们提出通过抑制原脂细胞分化成脂细胞，AGIF可以由该原脂细胞大量产生CSF，从而促进多能性干细胞的造血[Ohsumi等人，FEBSLetters，288(1991)13-16]。
干细胞造血的增加有效地导致了血液中细胞成分的产量的增加。因此，人们都希望脂细胞生成抑制因子在治疗血细胞数量减少症中将具有实用价值，而不管其出自何种理由。这种病症的例子包括血细胞减少症(即血液或其它组织中由任何疾病引起的细胞成分的降低)和贫血。此外，抑制细胞生成将导致脂细胞或脂肪细胞数量的下降，由此人们提出脂细胞生成抑制因子在治疗象肥胖症那样的病症方面将具有价值。
考虑到通过抑制原脂细胞分化成脂细胞而获得的好处，人们需要进一步的这类脂细胞生成抑制因子。
因此，本发明的一个目的是提供一种脂细胞分化抑制因子。
尤其是，本发明的一个目的是提供具有成熟AGIF活性的多肽。
本发明提供了作为新化合物的人体多肽，它选自由缺失2-9个N-末端氨基酸的人体脂细胞生成抑制因子衍生物，其在功能上等价的衍生物及其前体组成的组。
本发明还提供了一种药物组合物，它可用于治疗或预防血细胞减少症，或用于治疗或预防病态肥胖症，该组合物包括有效量的抗血细胞减少症或抗病态肥胖症的化合物，同时混合以药物可接受的载体或稀释液，其中所述的抗血细胞减少症或抗病态肥胖症的化合物是一种人体多肽，它选自由缺失1-9个N-末端氨基酸的人体脂细胞生成抑制因子衍生物，其在功能上等价的衍生物及其前体组成的组。
本发明还提供了在哺乳动物(可以是人)中治疗或预防血细胞减少症，或用于治疗或预防病态肥胖症的方法，该方法包括向所述的哺乳动物施用有效量的抗血细胞减少症或抗病态肥胖症的化合物，其中所述的抗血细胞减少症可抗病态肥胖症的化合物是一种人体多肽，它选自由缺失1-9个N末端氨基酸的人体脂细胞生成抑制因子衍生物，其在功能上等价的衍生物及其前体组成的组。
本发明还提供了编码这些多肽的核苷酸序列，含有这些核苷酸序列的载体和用这些核苷酸序列或载体转化的宿主细胞，以及提供了制备这些多肽的方法，这些方案将在下文中作进一步描述。
必要时可参照附图对本发明作进一步描述，其中
图1表示对成熟AGIF用胰蛋白酶进行有限消化而获得的Wertern印迹分析结果。
图2表示用胰蛋白酶处理的COS-1细胞的培养物上清液的生物活性。
图3代表含有编码成熟AGIF的cDNA的质粒M13mp19(20-2)μ的制备过程图(序别识别号为No.9，No.10，No13)。
图4代表在M13mp19(20-2)μ的StuI限制性位点附近的碱基序列[序别识别号为NO.12，No13]。
图5是含有AGIF△Pro的序列的表达质粒PMAL-C-20-2△Pro的图[序列识别号NO.14，No.15]。
图6表示包含在M13mp19(20-2)和M13mp19(20-2)△Pro中的DNA序列的比较[序列识别为NO.18，No.19]。
在图1中，线1代表未处理的COS-1细胞的培养上清液，线2代表用胰蛋白酶处理的COS-1细胞的培养上清液，线3代表反应用胰蛋白酶抑制因子终止而后用胰蛋白酶进行处理的COS-1细胞的培养上清液。分子量大小标志表示在右侧。
在图2中，实心条
代表用阴性对照质粒(pCDL-SRα296)转染的COS-1细胞的培养上清液，带点条
代表将胰蛋白酶抑制因子加入到用pCDL-SRα转染的COS-1细胞的培养上清液中的，阴影条
代表用pSR-α-20-2转染的COS-1细胞的培养上清液，对角线条
代表将胰蛋白酶抑制因子加入用pSR-α-20-2转染的COS-1细胞的培养上清液中的培养上清液。空白条
代表在用胰蛋白酶处理用pSRα-20-2转染的COS-1细胞的培养上清液之后再加入胰蛋白酶抑制因子的培养上清液。
用百分比表示脂蛋白脂酶(LPL)活性，将通过加Dulbecco改性Eagle培养基(无试样)得到的值作为100%活性。
本发明的多肽优选地选自由含有下列序列中的氨基酸3-178到氨基酸10-178的多肽[序列识别号为No.2]Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu-21-20-15-10Trp Pro Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro-515Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr101520Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu253035Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His4045Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala505560
Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg657075Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg808590Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu95100105Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu110115Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro120125130Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp135140145Gly Gly Ile Arg Ala ALa His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His150155160Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys165170175Thr Arg Leu178
其等价物、突变体及变异体、其前体及其衍生物组成的组。
如上所述，本发明提供了AGIF衍生物，每一种衍生物均缺失成熟AGIF的N末端中的特定氨基酸。由上述序列可以看出本发明提供了含有由上述序列中氨基酸3-178、4-178、5-178、6-178、7-178、8-178、9-178和10-178组成的序列的AGIF衍生物，以及其等价物，突变体、衍生物、变异体及其前体。
因此，本发明的多肽(以其活性形式)由169-176个氨基酸残基组成。当采用在还原条件下的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行测试时，本发明的多肽具有约22，000到23，000道尔顿的分子量。
如上所述，本发明提供了AGIF衍生物，其在功能上等价的衍生物及其前体。
功能上等价的衍生物和等价物用在本文是指本发明的任何一种AGIF衍生物，其中有一个或多个序列氨基酸已被修饰(或人为的或天然的)，这些修饰过的多肽至少仍保留了未修饰过的衍生物的生物活性的基本部分。下文将详细描述本发明的多肽的生物活性。简而言之，该生物活性包括下列中的一种或多种抑制脂细胞的脂蛋白脂酶活性的能力，用原脂细胞诱发产生菌落刺激因子的能力，用B细胞促进抗体形成的能力，促进巨核细胞菌落及血小板形成的能力以及降低造血干细胞的GO相的能力。
总而言之，可以理解的是任何一种给定蛋白质的活性将取决于该分子的某些保存区域，而其它区域与它们的特定序列几乎没有关系，并且实质上或完全多余。因此，本发明还包括在仍具有基本AGIF型活性的AGIF衍生物的序列上的任何一种变异体或突变体。这些变异体或突变体例如包括缺失、附加、插入、倒位、重复和类型取代(如通常将一种亲水残基取代成另一种，除了当该残基是强亲水的或疏水的)。通常，小变化对活性几乎没有影响，除非它们是该分子的本质部分，这些小变化可能是遗传操作的付产物。这些小变化的例子包括如果需要产生额外的限制性位点。
应该明白可以以任何合适的形式对本发明的多肽的编码序列进行修饰，只要对所产生的多肽的活性无付作用即可。可以进行点突变的其它变化，例如通过加入或缺失限制性位点而协助遗传操作，或采用别的手段来改善或修饰该分子。
举例来说，人们已经知道，在许多多肽中，半胱氨酸残基可以被转变成丝氨酸残基，这不会使活性明显丧失。这一点已经在白细胞介素2(IL-2)上得到证实，参见，Wang等人的Sci-ence224(1984)1431-1433。
本发明的AGIF衍生物的变异体包括天然发生的AGIF衍生物，它们具有缺失了2-9个N末端氨基酸的残基原成熟AG-IF的序列，但它们在较大量的范围内以需要的方式变化。等位变化和来自其它菌种但具有类似活性类型及具有相似序列的那些肽亦属于该定义内。
本发明的AGIF衍生物的前体包括，如具有N-末端取代基的那些，以及融合蛋白。这些N-末端取代为优选地应选择成在到达体内靶位点上之前或到达时可以裂解，降解或用其它方法除去。在施用前或施用后，这些取代基可以自发地在一切环境中分解或裂解，例如由于PH或离子浓度等条件的变化，它们也可以通过如酶的作用而被主动裂解。
适合的N-末端取代基包括前导序列和组，如酯，以及甲酰甲硫氨酸残基的甲硫氨酸。
取代基如前异序列，以及融合蛋白通常是用来获得AGIF衍生物的任何表达系统的付产物。这类前导序列或融合蛋白一般将在表达系统中裂解，但也可在体内，如在靶位点处裂解。这类序列在AGIF衍生物的活性方面没有什么特殊的作用，但可以有利地参与该多肽的表达。
在本发明中，当采用前导序列时，适宜的做法是采用天然产生的前导序列，如上述序列中氨基酸-21-0所描述的(序列识别号为NO.2)但也可以采用任何适合的序列，特别是那些为给定的表达系统而特别制成的序列。
本发明的AGIF衍生物可以按需要以融合蛋白的形式制成，而且通常是将其作为该多肽表达的一种助剂。这种融合蛋白一般是在表达系统中裂解(或自发地或在加入如一种合适的酶之后)，从而导致产生了AGIF衍生物，融合伙伴的选择不是本发明必需的，但却依赖于表达系统的选择。因此，为了在某种原核生物细胞，如下面将要举例说明的大肠杆菌(E.Coli)中进行表达，合适的做法是采用麦芽糖结合蛋白，或其衍生物作为本发明的AGIF衍生物的融合伙伴。
优选的本发明的多肽如下列序列所示(序列识别号为No.7)
Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu1510Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala152025Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu303540Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly455055Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp606570Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala7580Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr859095Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu100105110Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro115120125Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly130135140Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr145150Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg155160165Leu169
以及其等价物、突变体、变异体及其衍生物，以及其前体(定义如前)。
本发明还提供了编码全部或部分本发明的AGIF衍生物的核苷酸序列。这种序列可以是DNA也可以是RNA，它们利用本领域的标准技术制成，例如通过下文给出的多肽序列的逆向操作;通过用磷酸三酯法进行化学合成(Hunkapiller等人，Nature310(1984)105-111);或通过利用酶逆转酶，从由表达成熟AGIF的细胞制得的RNA模板合成cDNA，而后利用有义和无义链(用该cDNA序列制得)通过聚合酶链反应(PCR)进行cDNA选择及放大。成熟AGFI的cDNA序列已指述于文献[Kawashima等人，FEBSLetters283(1991)199-202]中。熟悉本领域的人均能将该公开的cDNA序列用于制备在聚合酶链反应中要用的寡核苷酸引物，从而获得适用于本发明的序列。
应该明白由于遗传密码的退化，任何一种给定的逆相处理过的序列均不一定会与任何给定的由相同肽逆相处理得到的互补序列良好地杂交。这是一个在熟悉本领域的人的思考中很普遍的因素。任何一种给定的序列的退化其范围经常大到使它很难合成那怕是很短的互补寡核苷酸序列，从而将其作为天然存在的寡核苷酸序列的探针。
密码的退化情况是这样的，举例来说，通常氨基酸中可能有四个或四个以上可能的密码子。因此，可以看出，对任何一种给定的肽来说，可能的编码序列的数量会以该肽中残基的数量指数形式增长。因此，应该明白，对于本发明的AGIF衍生物来说，可能的编码序列的数量是极大的，而且几乎不可能在这些序列之间进行选择。但是，需要考虑的影响编码序列选择，如表达系统及该系统密码子使用频率的选择的一些因素。再一个就是需要根据所用的表达系统使该序列的G+C含量平衡。
在构建核苷酸序列时密码子的选择可以有一定程度的随意性，合适的密码子可以通过标准方法来选择，如Grantham等人在NucleieAcidsRes.9(1981)γ43-γ47中所述。例如需要考虑特定宿主中密码子的使用频率。
优选的编码序列选自由下列序列中的核苷酸87-614到核苷酸108-614及其突变体、变异体和互补序列组成的组(序列识别号为NO.1)CCTGGCCCTG TGGGGAC ATG AAC TGT GTT TGC CGC CTG GTC CTGMet Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu-21-20-15GTC GTG CTG AGC CTG TGG CCA GAT ACA GCT GTC GCC CCT GGG50Val Val Leu Ser Leu Trp Pro Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly-10-51CCA CCA CCT GGC CCC CCT CGA GTT TCC CCA GAC CCT CGG GCC98Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala51015GAG CTG GAC AGC ACC GTG CTC CTG ACC CGC TCT CTC CTG GCG146Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala202530GAC ACG CGG CAG CTG GCT GCA CAG CTG AGG GAC AAA TTC CCA194Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro3540GCT GAC GGG GAC CAC AAC CTG GAT TCC CTG CCC ACC CTG GCC242Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala455055
ATG AGT GCG GGG GCA CTG GGA GCT CTA CAG CTC CCA GGT GTG290Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val606570CTG ACA AGG CTG CGA GCG GAC CTA CTG TCC TAC CTG CGG CAC338Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His758085GTG CAG TGG CTG CGC CGG GCA GGT GGC TCT TCC CTG AAG ACCVal Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr9095100CTG GAG CCC GAG CTG GGC ACC CTG CAG GCC CGA CTG GAC CGG386Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg105110CTG CTG CGC CGG CTG CAG CTC CTG ATG TCC CGC CTG GCC CTG434Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu115120125CCC CAG CCA CCC CCG GAC CCG CCG GCG CCC CCG CTG GCG CCC482Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro130135140CCC TCC TCA GCC TGG GGG GGC ATC AGG GCC GCC CAC GCC ATC530Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile145150155CTG GGG GGG CTG CAC CTG ACA CTT GAC TGG GCC GTG AGG GGA578Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly160165170CTG CTG CTG CTG AAG ACT CGG CTG TGACCCGGGG CCCAAAGCCA624Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu175
CCACCGTCCT TCCAAAGCCA GATCTTATTT ATTTATTTAT TTCAGTACTG684GGGGCGAAAC AGCCAGGTGA TCCCCCCGCC ATTATCTCCC CCTAGTTAGAGACAGTCCTT CCGTGAGGCC TGGGGGACAT CTGTGCCTTA TTTATACTTA744TTTATTTCAG GAGCAGGGGT GGGAGGCAGG TGGACTCCTG GGTCCCCGAG804GAGGAGGGGA CTGGGGTCCC GGATTCTTGG GTCTCCAAGA AGTCTGTCCA864CAGACTTCTG CCCTGGCTCT TCCCCATCTA GGCCTGGGCA GGAACATATA924TTATTTATTT AAGCAATTAC TTTTCATGTT GGGGTGGGGA CGGAGGGGAA984AGGGAAGCCT GGGTTTTTGT ACAAAAATGT GAGAAACCTT TGTGAGACAGAGAACAGGGA ATTAAATGTG TCATACATAT C10441065及其突变体、变异体及互补序列组成的组。
因此，本发明包括下列核苷酸序列，它包括上述序列中的核苷酸87-614，90-614，93-614，96-614，99-614，102-614，105-614和108-614。
上面所用的术语“突变体”和“变异体”其涵义与在肽序列mutatismutandis中所用的相同。利用标准技术，例如位点特异性突变可以改变所选择的编码序列中的核苷酸。由Mark等人在P.N.A.S.81(1984)5662-5666中所述的这项技术涉及采用由编码所述改变的合成寡核苷酸组成的引物。
应当明白，尽管肽序列的突变体或变异体始终会在编码核苷酸序列反映出来，但反之则不一定为真。因此，有可能的是该核苷酸序列受到相当大的改变(例如如前所述在遗传密码的退化方面)，但决不影响肽序列。已经知道，真核生物的基因通常显示了例如如干扰素基因所述的多型[Nishi等人J.Biochem.97(1985)153-159]。根据产生RNA的细胞类型，也可以存在多型。这类突变体及变异体属于本发明的范围。
本发明还提供了与前面所示序列(序列识别号为No.1)进行杂交的核苷酸序列，并且优选地这类序列应显示出与上述序列具有50%以上，优选70%，最好80%同源。
优选地，本发明的核苷酸序列是DNA序列，这种序列可以单独使用，如用作探针，但通常优选的是它们形成表达系统的一部分。因此，优选地，该DNA序列形成适用于表达系统的载体的一部分。
本发明所用的载体的一般性能并不是本发明所必需的，通常对于本领域的专业人员来说适合的载体、表达载体及构建载体是显而易见的。
合适的表达载体可以以噬菌体或质粒为基础，这两种载体通常对宿主具有特异性，尽管经常可以将这些载体处理而用于其它宿主。其它合适的载体包括Cosmid和反转录病毒，以及任何其它的载体，它们可以也可以不对给定的系统具有特异性。控制序列，例如识别物、启动子、操纵子、诱发物、终止子以及其它在调节或表达中必需的和/或有用的序列对于本领域的专业人员来说是显而易见的，而且与天然的AGIF序列或所用的载体有关，或者由任何别的合适的源获得。可以将该载体以任何合适的方式修饰或处理。
编码本发明AGIF衍生物的特别优选的核苷酸序列如下所示(序列识别号为No.7)GTT TCC CCA GAC CCT CGG GCC GAG CTG GAC AGC ACC GTG CTCVal Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu1510CTG ACC CGC TCT CTC CTG GCG GAC ACG CGG CAG CTG GCT GCA48Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala152025CAG CTG AGG GAC AAA TTC CCA GCT GAC GGG GAC CAC AAC CTG96Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu303540GAT TCC CTG CCC ACC CTG GCC ATG AGT GCG GGG GCA CTG GGA144Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly455055GCT CTA CAG CTC CCA GGT GTG CTG ACA AGG CTG CGA GCG GAC192Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp606570
CTA CTG TCC TAC CTG CGG CAC GTG CAG TGG CTG CGC CGG GCA240Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala7580GGT GGC TCT TCC CTG AAG ACC CTG GAG CCC GAG CTG GGC ACC288Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr859095CTG CAG GCC CGA CTG GAC CGG CTG CTG CGC CGG CTG CAG CTC336Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu100105110CTG ATG TCC CGC CTG GCC CTG CCC CAG CCA CCC CCG GAC CCGLeu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro115120125CCG GCG CCC CCG CTG GCG CCC CCC TCC TCA GCC TGG GGG GGC384Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly130135140ATC AGG GCC GCC CAC GCC ATC CTG GGG GGG CTG CAC CTG ACA432Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr145150CTT GAC TGG GCC GTG AGG GGA CTG CTG CTG CTG AAG ACT CGG480Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg155160165CTG507Leu169
及其突变体、变异体及互补序列，例如如上文所定义的。
本发明还提供了制备前述多肽的方法，该方法包括制备一种表达载体，该载体含有编码前面所述AGIF衍生物的DNA序列，用所述的载体转染一种合适的宿主细胞，在能使所棕AGIF衍生物发生表达的条件下培养所述宿主细胞，任选地用一种能够在特定位点裂解所表达的AGIF衍生物的酶处理该培养物，并由该培养物中分离出所表达的AGIF衍生物。该方法可以以工业规模制备所述的AGIF衍生物。达到高产量及高纯度。
一般说来，有许多种方法可用来制备本发明的肽及核苷酸序列。
在一种方案中，可以以常规方式制备天然存在的肽，并将其消化从而从N-末端中除去希望数量的氨基酸。通过改变该核苷酸序列可以使这类消化过程更易进行，从而在所编码的肽中提供一种位点，如热-或冷-易变位点，例如，或一种可识别的残基或序列，在那里化学裂解，或酶裂解可以进行。对于熟悉本领域的人来说适合的肽酶是已知的，而胰蛋白酶的使用是适宜的。
制备本发明的多肽的一种合适的方法是利用在文献[Kawashima等人，FEBSLetters283(1991)199-202]中所述的方法制备编码成熟AGIF的DNA。然后对该DNA进行技术处理，如体外诱变，从而获得编码所需多肽的DNA序列，所述的多肽与成熟AGIF等价但缺失2-9个N末端氨基酸残基。然后，将所产生的序列直接表达，或可替换地与第二种DNA序列融合，由此在表达后即可获得一种融合蛋白。然后以标准方式，如利用一种合适的酶，将该融合蛋白消化，从而获得所需的多肽。用来与本发明的AGIF衍生物形成融合蛋白的配偶体包括，如任何一种在C末端处含有特异性酶的识别序列的多肽。一种合适的配偶体包括麦芽糖结合蛋白或其衍生物。在麦芽糖结合蛋白和本发明的AGIF衍生物形成融合蛋白后并且加入血液凝固因子Xa之后，该融合蛋白发生裂解，结果产生了所需的AG-IF衍生物。
可以将编码本发明的AGIF衍生物的DNA导入一种合适的载体中，然后可以用这类载体转化原核生物或真核生物的宿主细胞。利用构建载体及在宿主细胞中表达蛋白质领域内的标准技术，可将编码AGIF衍生物的DNA表达在宿主细胞中。
适用于制备本发明的AGIF衍生物的培养物可以是任何活细胞培养物，它可以由原核生物表达系统变化到真核生物表达系统。
优选的原核生物宿主包括，如大肠杆菌及枯草杆菌。为了将所需的基因表达在这些宿主细胞中，应该用含有要表达的DNA序列的载体，如一种质粒载体来转化宿主细胞。该载体通常含有一种复制子及调节序列，所述的复制子是一种复制源，它由与该宿主匹配的菌种产生。更为合适的是该载体含有对所转化的细胞的表达特性或表型具有选择性的序列。
载体和/或宿主细胞的选择并不是本发明所必需的，如前所述，这种选择取决于多种因素。通常我们发现当采用大肠杆菌作宿主细胞时，公众可得到的K12菌株是适用的，而公众可得到的质粒PBR322和PUC是适用的载体。
如前所述，当表达一种蛋白质，如本发明的AGIF衍生物时，常常必须或至少需要包括各种控制序列。当采用大肠杆菌作宿主细胞时，合适的启动子包括色氨酸(trp)启动子，乳糖(lac)启动子，色氨酸-乳糖(tac)启动子，脂蛋白(lpp)启动子，来自噬菌体λP1启动子，以及多肽链延伸因子Tu(tufB)启动子。任何一种这类启动子均可用来制备本发明的AGIF衍生物。
当采用枯草杆菌作宿主细胞时，通常我们优选采用公众可得到的菌株207-25。适用于这类宿主细胞的载体是PTUB228，参见Ohmura等人，J.Biochem.95(1984)87-93。常常将枯草杆菌的λ-淀粉酶基因中的调节序列用作为该载体中的启动子。如果需要在该细胞外进行表达，即如果将多肽分泌在该细胞之外，则可以采用标准技术将编码α-淀粉酶的信号序列的DNA序列连接到该AGIF衍生物的编码序列中。
可以用来表达本发明的多肽的真核生物细胞包括脊椎动物、昆虫、酵母等的细胞。如前面所述，细胞的选择不是本发明所必需的。但是，通常，由猴子产生的COS细胞[Gluzman，Cell23(1981)175-182]以及中国仓鼠卵细胞(CHO)的二氢叶酸还原酶缺失菌株[Urlaub和Chasin，P.N.A.S.USA，77(1980)4216-4220]最常用来在脊椎细胞中表达蛋白质。我们已经发现这些细胞特别适用于本发明的情况。
为了在脊椎动物细胞中进行表达，通常需要在该表达载体中包括标准的调节序列，例如位于要表达的基因的上游的启动子序列，RNA裂解位点、聚腺苷化位点，转录终止序列等。如果有必要，该载体还可以具有复制源。这类表达载体的一个典型例子是pSV2dhfr，它具有SV40的早期启动子(Subramani等人，Mol.Cell.Biol.1(1981)854-864)。
酵母细胞也被典型地用作为真核微生物宿主。酵母属，如酿酒酵母是特别有用的表达宿主。人们已经知道了多种适用于在酶母细胞中表达蛋白质的载体。优选地，这类载体是包括调节序列。对于本发明，优选地选用醇脱氢酶基因的启动子[Benntzen和Hall.J.BiolChem.257(1982)3018-3025]或酸性磷酸酶基因的启动子[Miyanohara等人，P.N.A.S.USA，80(9183)1-5]。
在本发明的方法中，特别优选的是在COS细胞中表达多肽。含有要表达的DNA序列的载体典型地含有SV40复制源(它使该载体自动复制在COS细胞中)以及一种转录启动子、一种转录终止信号和一个RNA裂解位点。这类序列在本领域内是标准的，对于熟悉本领域的人来说合适的序列应是明显的。
通过本领域内的标准技术可以将该表达载体引入该宿主细胞中。因此，举例来说，采用Luthman和Magnusson在NucleicAcidsRes.11(1983)1295-1308中所述的二乙基氨乙基-葡聚糖(DEAE-葡聚糖)法，Graham和VanderEd在Virology，52(1973)456-457中所述的磷酸钙-DNA共沉析法，或Neumann等人在DMBO.J.，1(1982)841-845中所述的电穿刺或电穿孔法可以将表达载体引入COS细胞中。为了将表达载体引入CHO细胞中，从而使所转化的细胞能稳定地产生AGIF衍生物，合适的技术包括与该表达载体一起共转染一种载体，后者能表达用作G418抗性标志物的新基因，如pRSVneO[Sambrook等人，“MolecularCloning-Alaboratorymanual”，ColdSpringHarborLaboratory，NY(1989)]或pSV2-neo(Southern和Berg，J.Mol.Appl.Genet.，1(1982)327-341]，而后选择G418抗性菌落。
根据所选择的宿主细胞，可以将所表达的AGIF衍生物保留在该细胞内，或分泌在该细胞之外而进入培养基中。培养基的选择和培养条件不是本发明所必需的。但它们取决于所选用的宿主细胞。合适的培养基是本领域所熟知的，且对熟悉本领域的人来说是显而易见的。在本发明中，通过我们发现当培养基是已按需要加入了血清成分，如胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基或Dulbecco改性Eagle培养基(DMEM)时，所需的多肽可以充分表达在COS细胞中。
采用多种已知的分离方法中的一种或其结合利用如该蛋白质的物理及化学特性，可以将本发明的多肽从该细胞或培养基中分离并提纯出来。这些方法的特别例子包括通过普通蛋白质沉析剂进行进行处理、超滤、各种色谱，如分子筛色谱(凝胶过滤)，吸附色谱，离子交换色谱，亲和色谱，以及高效液相色谱(HPLC)，渗析或这些方法中任意一种的结合，或其它方法。
生物活性本发明进一步提供了前面所述的AGIF衍生物作为药物的用途。此外，本发明还提供了已知AGIF衍生物的药物用途，该衍生物是缺失N-末端氨基酸的成熟AGIF。
因此，本发明还为人体多肽提供了药物用途，该多肽选自由缺失1-9个N末端氨基酸的人体脂肪生成抑制因子衍生物，其在功能上等价的衍生物及其前体组成的组。
更进一步地说，本发明为人体多肽提供了药物用途，该多肽选自由含有下列序列(序列识别号为No.2)中氨基酸2-178到氨基酸10-178的多肽。
Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu-21-20-15-10Trp Pro Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro-515
Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr101520Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu253035Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His4045Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala505560Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg657075Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg808590Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu95100105Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu110115Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro120125130Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp135140145Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His150155160Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys165170175Thr Arg Leu178
及其等价物，突变体及变异体，其前体及其衍生物(定义如前)组成的组。
优选的用途前面所述用途的多肽具有下列序列之一序列识别号为NO.8Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu1510Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala152025Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu303540Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly455055Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp606570Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala7580Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr859095Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu100105110Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro115120125Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly130135140Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr145150Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg155160165Leu169
或序列识别号为NO.6Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg1510Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu152025Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe303540Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu455055Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly606570Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg7580His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys859095Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp100105110Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala115120125Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala130135140Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala145150Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg155160165Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu170175
及其等价物，突变体和变异体，其前体及其衍生物(如前面所述)。
本发明的AGIF衍生物，特别是前面所举例说明的那些衍生物具有多种活性。这些活性总结如下1、抑制脂细胞的脂蛋白脂酶活性。
2、利用原脂细胞诱发产生菌落刺激因子(CSF)。
3、利用B细胞促进抗体形成。
4、促进巨核细胞菌落的形成。
5、促进血小球的生成。
6、降低造血干细胞GO相的能力。
考虑到上述活性，本发明的AGIF衍生物作为治疗试剂可能具有巨大价值。特别是，它们在治疗血细胞减少症，如血小板减少症及白血球减少症方面“在提高免疫系统的功能方面，在防止或减轻病态肥胖方面，在治疗和诊断各种贫血症，如再生障碍性贫血，及其它血液疾病方面以及在治疗及诊断由病毒、细胞和寄生虫引起的感染方面均可能具有价值。还可以推测使用本发明的AGIF衍生物可以允许在血液成分传输中保留。
用于本文时，“血细胞减少症”应包括由任何疾病引起的血液或其它组织中细胞成分的减少，所述疾病如上毒素或辐射引起的血小板减少症，顽固的各类血细胞减少症，白血球减少症，骨髓移植后的细胞减少症或化疗后由制癌试剂等引起的细胞减少症，以及由偶尔发生在这些条件下的免疫疾病引起的细胞成分的减少。
本文中所用的“AGIF活性”包括在前面列出的1-6条中的一种或多种活性。
在后面的实例中将描述本发明的AGIF衍生物的活性，该衍生物是与成熟AGIF等价的多肽但其中缺失1-9个N末端氨基酸。
本发明的多肽是由体内天然存在的化合物产生的，因此它们具有较低的毒性。当对雄性成年鼠(鼠的体重约为20g)施用菌株DDY时以及在观察5天后，本发明的多肽在剂量为500mg/kg体重，或更低时没有表现出明显的毒性。
在该活性方面，本发明的AGIF衍生物适合用作治疗血细胞减少症及病态肥胖症的治疗试剂，该AGIF衍生物是与成熟AGIF等价的但其中缺失1-9个N-末端氨基酸的多肽。
本发明的AGIF衍生物可以单独使用也可以与其他治疗药物结合使用，该AGIF衍生物是与成熟AGIF等价但其中缺失1-9个N末端氨基酸的多肽。
当将本发明的AGIF衍生物用于治疗病态肥胖症时，可以单独使用该组合物，也可以将其与其它合适的防肥胖药物一起结合使用，该防肥胖药物例如包括食欲抑制剂、肠胃外吸收抑制剂、消化酶抑制剂、新陈代谢加速荷尔蒙，脂合成抑制剂和胰岛素分泌抑制剂。此外，还可以将该组合物与节食和/或锻炼治疗结合起来使用。在这种情况下，该组合物能提高用其它防肥胖药物进行治疗的活性或效果，以及提高用非药物类防肥胖治疗的效果。
当将本发明的AGIF衍生物用于治疗血细胞减少症时，则可以将该化合物制备成含有其它合适的造血因子或与该造血因子结合在一起使用，所述的造血因子的例子包括IL-1到IL-10，白血病抑制因子(LIF)，干细胞因子，GM-CSF，G-CSF，M-CSF，巨核细胞菌落刺激因子(Meg-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)干扰素(IFN)以及促红细胞生成素(EPO)。结合施用(以单独组合物的形式或以结合组合物的形式)将会由于本发明的多肽而提高造血因子的活性。
本发明的多肽可以通过任何一种具有这类活性的化合物常用的途径而给药，并且可以与用于此目的的常规的添加剂或辅助剂一起配制成混合物。例如，口服给药时，可以将它们制成片剂，胶囊、颗粒、粉末或糖浆;而非肠胃给药时，则可以将它们制成注射液，静脉滴注输液或栓剂。
利用任何一种常用的手段，采用添加剂，如载体，粘结剂，崩解剂，润滑剂，稳定剂和矫味剂可以制得这些药物制剂。
当用于通过注射或静脉内滴注输入而给药时，该药物制剂应是肠胃外可接受的水溶液，即不含任何热源的溶液的形式。利用任何一种常规手段同时考虑一些因素，如PH，等渗性及稳定性就可以制成这类溶液，而且这些属于熟悉本领域的人员的知识范围。
尽管所用剂量将随患者的年龄、性别、体重、饮食、症状及感染程度，以及给药周期及其它临床作用因素而变化，但对于成年患者，合适的剂量是0.01-1000mg/kg体重·每天，可以一次给药也可以分几次给药。对于肠胃外给药，合适的日剂量在0.01-100mg/kg体重之间，可以通过皮下注射，肌肉内注射或静脉内注射。
参照下列非限制性实施例，本发明将获得进一步的描述，在这些例子中，实例A到D描述了多种确定本发明多肽的活性的方法，实例1到4描述了制备本发明多肽的方法。
在下列实例中，由美国细胞典型培养物保藏中心(ATCC)购买3T3-L1细胞，该细胞由鼠胚胎成纤维细胞形成并由Green和Kehinde描述于Cell，1(1974)113-116中。在下列实例中形成33T3-L1细胞培养物的参照物，在潮湿的含有10%(v/v)CO2和90%(v/v)空气的气体混合物中将这些细胞在37℃下培养。在培养基A中将这些细胞进行传代培养。
培养基ADulbecco改性Eagle培养基(DMEM)，含有4.5g/l葡萄糖，(由Gibco制造);
10%(v/v)固定的胎牛血清(FBS)(由Hyclone制造);以及10mMN-2-羟乙基哌嗪-N′-乙烷磺酸(HEPES)(PH7.2，由Sigma制造)。
根据Rubin等人在J.Biol.Chem.，253(1978)7570-7578中所述的方法，将3T3-L1细胞诱导分化成脂细胞。
例A抑制3T3-L1细胞转化成脂细胞通过将细胞悬浮于上述培养基A中培养3T3-L1细胞，其密度为1.0×104细胞/ml。将0.5ml这种培养基用移液管移入48孔多丛盘(由Costar制造)上的每只孔中，培养细胞直到它们达到融合状态，即大约3天。然后用新鲜的培养基A替代该培养基，并将细胞再培养2天。结束时，将该培养基用等量的培养基B替代，培养基B是一种诱发脂肪生成分化的培养基。
培养基BDMEM，含有4.5g/l葡萄糖;
10mMHEMES(PH7.2);
3%(v/v)固定的FBS;
5μg/ml牛胰岛素(由Sigma制造);
8μg/mld-生物素(由Sigma制造);
4μg/ml泛酸(由Sigma制造);
1.0μM地塞米松(由Sigma制造);
0.5mM异丁基甲基磺嘌呤(由Aldrich制造)。
在加入培养基B的同时将要测试的样品物质加入孔中。每只孔中加入少量试样，该量低于所用培养基B量的十分之一。
加入培养基B和试样之后，将细胞进一步培养，每两天用新鲜培养基B取代培养基B。在每次取代培养基时也加入新鲜的试样。在第一次加入培养基B和试样后4到7天，同等量的培养基C取代培养基，培养基C用于维持脂细胞。
培养基CDMEM，含有4.5g/l葡萄糖;
5%(v/v)固定的FBS;
10mMHEPES(PH7.2)以及100ng/ml牛胰岛素。
将细胞在培养基C中培养2天，而后用5%(v/v)甲醛将其固定。根据Mitomo和Takayama在[“RINSHOKENSAKOZA(ClinicalTestingSeminar)”，Vol.12，“Pathology”(1982)，IshiyakuPublishing]中所述的方法，分别用红色O油和苏木精将富集在细胞中的脂质小滴及细胞核染色。特别是，在进行红色O油染色时，首先将固定的细胞用蒸馏水冲洗，再用异丙醇在水中的60%溶液进行冲洗，而后，用0.3%红色O油在60%异丙醇的溶液中将该细胞染色10分钟。结束时，用该异丙醇溶液再次冲洗该细胞，并用蒸馏水冲洗。
对染色的细胞进行并显微照相，并对染色细胞计数。对含有红色脂肪粒的细胞以及含有染色核的细胞均进行计数。然后用下列式计算脂肪生成分化比率。
脂肪生成分化比率(%)＝100× (含有脂肪小滴的细胞数)/(具核的细胞数)例B抑制脂蛋白脂酶活性利用已知的方法可以测得试样抑制脂蛋白脂酶(LPL)活性的能力。在下文中，制备该细胞并按照Beutler等人在J.Im-munol.，135(1985)3972-3977中所述的方法进行测试。简而言之，按下列所述进行。
利用在前面例A中所述的方法，制备分化的3T3-L1脂细胞。但只采用培养基B，即在该阶段不向分化细胞中加入试样，在培养基B中生长后，用新鲜的培养基C取代该培养基，培养基C的组成如前面例A中所示。在该阶段还加入要测试的试样，其加入量约为培养基体积的八十分之一，将该细胞培养18小时(见图2)。结束时，除去培养基并用PBS(-)缓冲液(没有Mg2+和Ca2+的磷酸盐缓冲液，由Nissui Seiyaku制造)冲洗该细胞两次。然后向每只孔中加入300μl培养基D。
培养基DDMEM，含有4.5g/l葡萄糖;
5%(v/v)固定的FBS;
10mMHEMES(PH7.2);
100ng/ml牛胰岛素;以及10U/ml肝素钠(由NovoIndustries制造)。
将细胞培养1小时，而后收集100μl培养物上清液，并用来测量活性。每份试样测定三次，通过将三次测量值平均得到最后的结果。
利用Nilsson-Ehle和Schoty在J.LipidRes.，17(1976)536-541中所述的方法测定脂蛋白酸酶活性。该方法概述如下。将100μl按前面所述制得的培养物上清液与等体积的具有下列成分的基质溶液混合。
13mM甘油-三[9，10(n)-3H]油酸(51.8KBeq/微摩尔，由Amersham制造);
1.3mg/mlL-α-二硬脂酰卵磷酯(由Sigma制造);
20mg/ml牛血清白蛋白(由Sigma制造);
135mMTris-盐酸(Tris-HCl，PH8.1，由Sigma制造);
16.5%(v/v)甘油;以及16.5%(v/v)固定的FBS。
通过用三油酸甘油脂(由Sigma制造)稀释甘油-三[9，10(n)-3H]油酸(370GBeq/mmol)(由Amersham制造)、而后用硅胶柱色谱法进行纯化制得13mM甘油-三[9，10(n)-3H]油酸(51.8KBeq/μmol)。
将该混合物在37℃下反应120分钟。结束时，通过加入1.05ml0.1M碳酸钾-硼酸缓冲液(PH10.5)和3.25ml甲醇、氯仿与庚烷体积比为141∶125∶100的混合物使反应终止。剧烈搅拌后，将反应混合物以3000×g的速度离心15分钟。而后用液体闪烁计数器测量水-甲醇层中的3H数。将1个单位脂蛋白脂酶活性定义为在1分钟内产生1μmol脂肪的活性量。
例C血小板数量的增加在3.75ml含有0.1%(w/v)牛血清白蛋白的PBS(一)缓冲液中溶解按例3和例4所述制得的750μgAGIF△Pro。
购买7周龄的雄Sprague-Dawley鼠(NipponSLCCo.Ltd)，在用于本实验前将其维持一周，并随机分为两组，每组5只鼠。其中一组用AGIF△Pro进行处理，另一组则作为对照组。在处理组中的鼠每公斤体重皮下接受100μgAGIF△Pro。根据各个鼠的体重调节AGIF△Pro溶液的浓度，从而使所施用的溶液的体积保持在1ml。对照组中的鼠仅施用1ml载体缓冲液。两个组中的鼠每天处理一次，周期为5天，每次处理前对它们各自称重。
在处理周期结束时，对血液取样，并测定血小板数。在最后一次施用后24小时，用乙醚将鼠麻醉，并采用含有0.5ml3.8%柠檬酸三钠·2H2O溶液的注射器通过心脏穿刺收集4.5ml血液。利用Coulter计数器(型号T5/40，由Coulter Electric Inc.制造)直接测定各种试样中的血小板数，白细胞数及红细胞数。其结果表示如下处理组血小板数＝1，123，000±66，500对照组血小板数＝893，000±23，700该数以每立方毫米试样平均值±标准误差给出。
利用Dunnett等人在Biometrics，September(1964)482-489中所述的多重比较方法，将由处理组及对照组获得的数进行比较。由比较的结果可以确定处理组、即接受AGIF△Pro的组中的血小板数明显大于对照组中的(可能低于5%)。
两个组中鼠的红细胞和白细胞数无明显差别。此外，在试验期间每个组中鼠的体重增加速度相似。
在正常鼠中，AGIF△Pro也显示出能增加血小板数。
进一步地，在10天时间内向经过制癌剂Carboplatin处理的鼠施用200μg/kgAGIF△Pro将加快因用Carboplatin处理而引起的血小板减少症的恢复。
例D采用在前面例C中所述的方法，对按照例2所述制得的AGIF衍生物、即缺失成熟蛋白质中的9个N-末端氨基酸的衍生物进行测试。该衍生物同样显示出增加血小板数的能力。
例1AGIF的表达(a)AGIF表达载体的构建按照Kawashima等人在FEBS Letters，283(1991)，199-202中所述的方法制备质粒pcD-20-2。根据该方法，由聚(A)+RNA(由基质细胞系KM-102分离得到)在表达载体pcD中制备cDNA库。该基质细胞系KM-102是由人骨髓得到的。用对AGIF具有选择性的寡核苷酸对该库进行筛选，并选出合适的克隆。在对这些克隆作进一步试验之后(如利用前面例A中所述的测试方法)，从能够引导具有AGIF-型活性的蛋白在COS-1细胞(一种公共可得到的细胞系，来自猴细胞)中的表达的克隆中选择出质粒，并记为pcD-20-2。利用本领域的标准技术由pcD-20-2克隆中提取出编码AGIF的cDNA。采用Ohusmi等人在FEBS Letters，288(1991)13-16中所述的技术，将该cDNA引入高表达载体pcDL-SRα296(由Takebe等人描述于Mol.Cell.Biol.，8(1988)466-472中)中。将所产生的载体表示为pSR α-20-2，它引导该AGIF多肽在细胞(如COS-1细胞)中的高水平表达。
(b)AGIF在COS-1细胞中的表达将在上面步骤(a)中制得的质粒pSRα-20-2转染到COS-1细胞中。利用由ShimadzuSeisakushoLtd.得到的基因导入单元GTE-1，通过电穿孔进行转染。制备COS-1细胞，用于通过将该细胞生长于烧瓶中(细胞生长于含有10%胎牛血清的Dulbecco改性Eagle培养基中，3天，37℃下)，直到该培养物达到半融合状态而进行转染。通过用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(胰蛋白酶-EDTA)进行处理由烧瓶中收集细胞，此后用磷酸盐缓冲的盐水(一)[PBS(一)](由Nissui Seiyaku制造)将收集起来的细胞冲洗两次。而后将冲洗过的细胞悬浮于PBS(一)缓冲液中，浓度为1×108细胞/ml。制备质粒DNA(即按前面步骤(a)中所述制得的pSRα-20-2质粒)，用于通过按照氯化铈法进行处理而转染，此后通过加入PBS(一)缓冲液将含有处理过的质粒的溶液调到200μg/ml。
为了转染，将20μl按前面所述制成的COS-1细胞悬浮液与20μl按前面所述制成的质粒溶液混合，然后将该混合物放在FCT-13电穿孔装置(由Shimadzu Seisakusho Ltd.制造)的室中，该装置中的电极距离为2mm。向该装置施加两批600V/50微秒脉冲，两批脉冲间的间隔为1秒。然后将该电穿孔装置的室中的混合物加至含有10%v/v胎牛血清的20ml Dulbecco改性Eagle培养基溶液中，而后将所产生的混合物转移到Petri盘(直径150mm)中。将它在含有5%CO2(体积)的空气中培养过夜，同时保持温度在37℃。结束时，通过抽吸除去培养物上清液，用无血清Dulbecco改性Eagle培养基冲洗细胞及Petri盘，然后向冲洗过的细胞中加入20ml Dulbecco改性Eagle培养基，在相同条件下将该细胞再培养3天。
在此过程结束时，从该培养物中除去培养物上清液，并用Western印迹分析法进行测试以证实AGIF(序列识别号为No.4)的存在。在该Western印迹分析中采用了抗体AGIFp15，其制备方法如Ohsumi等人在FEBSLetters288(1991)13-16中所述。
例2制备具有AGIF活性的多肽将0.5μg胰蛋白酶(由Sigma制备)加入到500μlCOS-1细胞培养物上清液中，该上清液含有按例1中(b)步骤制得的AGIF，并将所得到的混合物在37℃下培养20分钟。在此过程结束时，将0.5μg利马豆胰蛋白酶抑制因子(由Sigma制备)加入到该混合物中以使该胰蛋白酶失活，然后用Western印迹法分析该溶液，该Western印迹分析的结果示于图1中。如图1所示，成熟形式的AGIF经过在还原条件下进行十二烷基硫酸钠聚丙烷酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其表现分子量为23，000道尔顿。在用胰蛋白酶处理该成熟AGIF之后，经过在还原条件下的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析确认形成了分子量约为22，000道尔顿的多肽。利用密度计(CS-930，由ShimadzuSeisakushoLtd.制造)对由胰蛋白酶引起的成熟AGIF的消化过程进行分析，结果表明大约有60%的成熟形式的AGIF被胰蛋白酶消化成一种多肽，经过在还原条件下的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳确定该多肽的分子量大约为22，000道尔顿。
已经知道胰蛋白酶典型地具有基质特异性，即它能“识别”某些氨基酸。尤其是，胰蛋白酶仅切断多肽中位于精氨酸或赖氨酸氨基酸的羧基侧的肽键，因此，可以推测较低分子量的成熟AGIF衍生物是由于胰蛋白酶使位于精氨酸残基(位于成熟AGIF的N-末端的位置9)和在该N-末端的位置10处的氨基酸残基之间的键发生水解而产生的。
为了证实该理论，制备成熟AGIF的变异体，其中位于N-末端的位置9处的精氨酸残基被取代成另一种氨基酸(但不是赖氨酸)，例如取代成天冬氨酸。利用一种体外诱变系统(由Amersham制造)制备该突变体。制成后，在与上述相同的条件下用胰蛋白酶处理该突变体，在用该酶进行处理之后，该多肽的分子量没有减少，也就是说没有消化，这证明该AGIF衍生物，即经过在还原条件下的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳确认具有大约22，000道尔顿分子量的多肽(由于用胰蛋白酶处理成熟的AGIF而形成)确实是由缬氨酸作为其N-末端氨基酸，即距离成熟形式的AGIF的N末端的第10个氨基酸。
在如上所述用胰蛋白酶处理通过用pSRα-20-2转染COS-1细胞而获得的培养物上清液之后，通过加入利马豆胰蛋白酶抑制因子(由Sigma制备)至最终浓度为1μg/ml而使胰蛋白酶失活(如图1中所示)，该溶液中含有约60%分子量约为22，000道尔顿的多肽(经过在还原条件下的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳测定)。
利用前面例B中所述的技术测定该溶液抑制脂蛋白脂酶(LPL)的活性的能力。该测试结果示于图2中。由这些测试结果，可以证实用胰蛋白酶处理过的蛋白质溶液其抑制LPL活性的能力与成熟AGIF的等同。除了该活性以外，还证实(用前面所述的技术)用胰蛋白酶处理过的蛋白质溶液能抑制鼠胚胎成纤维3T3-L细胞转化成脂细胞，并且抑制鼠骨髓原脂细胞系H-1/A分化成脂细胞，这一点可以采用Nakamura等人在Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，179(1985)283-287中所述的方法证明。
采用分级分子量大约为10，000道尔顿的超滤膜(CentriconC-10，由Amicon制造)将如上所述制得的用胰蛋白酶处理过的蛋白质溶液分成两部分，即一部分含有分子量低于10，000道尔顿的多肽(能渗透过膜的部分)以及另一部分含有分子量大于10，000道尔顿的多肽(不能渗透过膜的那部分)。对所获得的两部分进行测试，以确定它们抑制3T3-L1脂细胞中LPL活性的能力，这些测试的结果表明AGIF型活性仅存在于不渗透过膜的部分，即所含蛋白质的分子量大于10，000道尔顿的那部分。这说明AGIF型活性存在于分子量大约为22，000道尔顿的多肽中，该多肽是通过用胰蛋白酶处理成熟的AGIF而形成的，它还说明该活性不存在于含有通过胰蛋白酶处理从成熟AGIF的N-末端除去的9个氨基酸的肽中。
例3在大肠杆菌中表达具有AGIF活性的多肽下列实施例说明了与成熟AGIF相应但无N末端氨基酸的AGIF衍生物的制备及表达。
用限制性酶BamHI消化载体M13mp19RFlDNA(由Toy-obo制备)，该DNA是一种双链DNA，而后用碱性磷酸酶处理消化过的DNA，从而除去末端磷酸根基团。
用限制性酶BamHⅠ和BglⅡ消化在前面例1中制得的质粒pSRα-20-2。该消化过程产生三个片段，从中分离出含有AGIF cDNA、大约750碱基对的片段并进行提纯。然后用T4DNA接合酶将含有AGIF cDNA的片段与消化过的M13 mp19质粒连接起来。将所产生的DNA用来转化大肠杆菌的DH5αF1菌株(由GIBCO/BRL Life Technologies Inc.购买)，从而制得重组噬菌体菌斑。从所产生的菌斑中随意选出12个克隆，而后对每一个克隆，采用常规技术分离出单链DNA和双链RF(复制形式)DNA，并将其提纯，用限制性酶SmaⅠ消化由12个克隆中每一个得到的RFDNA，从中选出其SmaⅠ消化液中含有大约750碱基对，即含有AGIFcDNA的片段的克隆，将其记为M13mp19(20-2)。
采用体外诱变系统(由Amersham制造)，并按照制造商推荐的方式合成一种寡核苷酸，其DNA序列如下5′-CCAGATACAGCTGTCAGGCCTGGGCCACCACCT-3′(序列识号为No.13)。将该寡核苷酸退火成克隆M13mp19(20-2)(制备如前)的单链DNA，从而制得突变噬菌体克隆，记为M13mp19(20-2)μ(图3)。这种方法可以将限制性酶StuⅠ的限制性位点(位点AGGCCT)引入到该DNA中，而且可以由该突变克隆的RFDNA制得编码成熟AGIF的DNA。(序列识别号为NO.3)。该StuⅠ位点在成熟AGIF多肽的编码序列的起始处导入。
利用T4DNA接合酶，将通过用限制性酶StuⅠ和HindⅢ消化大肠杆菌表达载体pMAL-C(由NewEngland Biolabs制备)而形成直链的DNA与含有通过用StuⅠ和HindⅢ消化M13mp19(20-2)μ(制备如前)的双链RFDNA而制得的AGIFcDNA的片段连接在一起。选择载体pMAL-C是因为它含有编码麦芽糖结合蛋白(MBP)的结构基因(malE)(在该启动子的下游)。用该DNA将大肠杆菌菌株TB1转化以获得氨苄青霉素抗性菌落，该菌落能够在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的L-琼脂培养基中生长。
L琼脂在蒸馏水中1%细菌用胰化胨;
0.5%酵母提取物;
1%NaCl;以及1.5%细菌用琼脂。
从所产生的菌落中随机选出12种菌落，并从中选出经限制性酶排序证明含有AGIFcDNA的质粒克隆，将其记为pMAL-C-20-2μ(图5)(序列识别号为No.14，No.15)。
而后，合成两种互补的寡核苷酸。这些寡核苷酸由编码成熟AGIF的核苷酸序列(其中不包括编码成熟AGIF的N-末端脯氨酸残基的三个碱基)以及编码由血液凝集因子Xa识别的一种氨基酸序列的核苷酸序列组成。然后将这些寡核苷酸退火，从而制得一种接头DNA，该DNA的一端具有BamHI限制性位点而另一端则具有XhoI限制性位点(图5)。将该合成DNA接头与载体DNA连接，该载体DNA通过用BamHI和XhoI消化质粒pMAL-C-20-2μ(制备如前所述)而获得。将所得到的载体用来转化大肠杆菌的TB1菌株。从所产生的氨苄青霉素抗性菌落中选出含有靶接头的克隆，并将包含在该选出的克隆中的质粒命名为pMAL-C-20-2△Pro(图5)。
将含有pMAL-C-20-2△Pro的TB1菌株接种到50ml培养基E中。
培养基E在蒸馏水中1%细菌用胰化胨;
0.5%酵母提取物;
0.5%NaCl，以及0.2%葡萄糖。
将接种了的培养基在30℃下培养过夜，同时搅拌。结束时，将10ml培养液接种到1升新鲜的培养基E中，并在30℃下再边搅拌边培养。当该培养液在600nm的吸收度达到0.5时，加入异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷至终浓度为0.3mM，而后在30℃将该接种后的培养基培养过夜。
在该培养结束时，通过离心收集细菌并将其悬浮于50ml缓冲液A中。
缓冲液A在蒸馏水中10mMTris(羟甲基)氨甲烷-HCl;(Tris-HCl)0.2MNaCl;
1mM叠氮化钠;
10mM2-疏基乙醇;
1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，PH7.4。
对所得到的是浮液进行2分钟超声处理，使细菌破碎，而后以9000×g、在4℃下离心30钟而将破碎细菌分离，收集上清液并用4倍体积的缓冲液A将其稀释，而后用孔径为0.22μm的MilexGV过滤器(由millipore制造)将稀释的上清液过滤，收集过滤后的溶并将其加到柱床体积为10ml的直链淀粉树脂柱中，用大约80ml的缓冲液A冲洗该柱。用含有10mM麦芽糖的缓冲液A从该柱将融合蛋白洗脱，该蛋白由麦芽糖结合蛋白和缺失N-末端脯氨酸的AGIF(AGIF△Pro)组成，大约回收到2μl峰值馏分。
向20μl原始馏分的MBP-AGIF△Pro融合蛋白(含有约90μg蛋白质)(制备如前述)中加入1个单位(1μg)的血液凝位因子Xa，将该混合物放置使之在室温下消化2-24小时，反应之后，直还原条件下用含有12.5%(w/v)丙烯酰胺的凝胶进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。开始时，可以看到一条对应于分子量约为62，000道尔顿的多肽的带以及另一条对应于分子量约为23，000道尔顿的多肽的带，前者推论为是MBP-AGIF△Pro融合蛋白，后者则推论为是AGIF△Pro。在整个消化反应过程，62，000道尔顿带的强度在下降，而23，000道尔顿带的强度在上升，对23，000道尔顿带的多肽进行West-ern印迹分析法结果表明该带与AGIFp15抗体起反应。
将40单位(40μg)的血液凝集因子Xa加入到800μl原始馏分的MBP-AGIF△Pro融合蛋白(含有约3.6mg蛋白)(制备如前所述)中，将混合物在室温下放置过夜。结束时，利用三氯乙酸(TCA)沉析处理，将反应混合物浓缩，此后在还原条件下，利用含有12.5%(w/v)丙烯酰胺的凝胶进行十二烷基硫酸钠聚丙酰胺凝胶电泳。电泳之后，将该蛋白质带由聚丙烯酰胺凝胶上转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(商标名1mmobilon，由Millipore制备)上，此时采用一种在转移缓冲液
中的凝胶膜转移装置[KS-8441，由Marisol制造)，在4℃下以0.8mA/cm2进行15小时。转移之后，一边搅拌，一边在含有25mM NaCl的10mM硼酸钠缓冲液中将该膜冲洗5分钟，然后在纯化水中冲洗5分钟。而后将其干燥。将已转移了大约23，000道尔顿分子量带的膜部分切割下来，利用气相蛋白质序列分析仪(型号475A，由Applied Biosystems制造，测定由N-末端到第9个氨基酸残基的序列。将由每个反应循环获得的乙内酰苯硫脲(PTH)-氨基酸分离，并用逆相高效液相色谱(HPLC)进行识别(所用的色谱装置是型号120A，由Applied Biosystems制造)。以该方式测定的氨基酸序列如下所示。
Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Xaa-Val-(其中Xaa代表末识别的氨基酸残基，序列识别号为No.11)。
根据该结果，可以证实所分离的蛋白质是AGIF△Pro，其中缺失成熟AGIF的N-末端处的脯氨酸残基。
在进行生物试验之前，用血流凝集因子Xa在原始部分的MBP-AGIF△Pro融合蛋白(按前面所述方法制备)上进行消化反应。通过将原始试样提纯将由该消化过程形成的AGIF△Pro分离，所用的技术包括凝胶过滤柱色谱和CMToyopearlPack650M(由Tosoh制造)柱色谱的结合。当在还原条件下、利用含有12.5%(w/v)丙烯酰胺的凝胶进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳时，试样中的蛋白质迁移到大约23，000道尔顿分子量相当的位置。然后测定以这种方式制得的AGIF△Pro的生物活性，用Western印迹分析证实该蛋白质与抗体AGIFp15起反应，还证实以这种方式提纯的蛋白质还具有抑制原脂细胞分化成鼠3T3-L1细胞中的脂细胞的能力。另外，出乎意外地该蛋白质还抑制已经分化成脂细胞的3T3-L1细胞的脂蛋白脂酶(LPL)活性。此外，这种脂蛋白脂酶(LPL)抑制的特异活性基本上等同于在PCT公开，WO92/08735中所述的已知成熟AGIF的活性。
例4在COS-1细胞中表达具有AGIF活性的多肽下列例子描述了与成熟AGIF相应但无N-末端氨基酸的AGIF衍生物的制备及表达。
按照与例3中所述的相似的方法，但采用具有下列序列的记号为Pro-DEL1的合成寡核苷酸序列(序列识别号为No.16)。
5′-GATACAGCTGTCGCCGGGCCCCCACCTGGC-3′和单链载体M13mp19(20-2-DNA(如例3中所述地制备)制备突变噬菌体克隆，记为M13mp19(20-2)△Pro。该方法可以将限制性酶ApaI的限制位点(位点GGGCCC)导入该DNA中，而且可以由该突变克隆的RFDNA制得编码AGIF△Pro的DNA。ApaⅠ位点在该AGIF△Pro多肽的编码序列的起始处引入。利用限制性排序从该突变克隆中选出存在于PRO-DEL1序列中的ApaⅠ位点，核苷酸序列分析结果表明该M13mp19(20-2)△Pro含有编码AGIF△Pro，即无N-末端脯氨酸残基的成熟AGIF的DNA(图6)。
通过用限制性酶BalⅠ使质粒pSRα-20-2，成熟AGIF的一种COS-1细胞表达质粒(其制备如例1中所述)发生裂解，由此制得长度大约为4.5Kb但缺失190碱基对片段(包括成熟AGIF的N-末端区域)的线性载体DNA。类似地，用BalⅠ消化M13mp19(20-2)△Pro的双链RFDNA(制备如前所述)。通过对该克隆载体进行BalⅠ消化而除去187碱基对片段，包括AGIF△Pro的N-末端区域，并将该片段连接到如前所述制成的线性载体中。将所得到的DNA导入大肠杆菌DH5α中，从中选出能够生长在含有氨苄青霉素(浓率为100μg/ml)的L…琼级板上的氨苄青霉素抗性菌落。随机选择20个克隆，从这20个克隆中提取出各自的质粒并进行提纯。通过分析每种质粒DNA的ApaⅠ位点，选出含有该187碱基对BalⅠ片段(该片段以与AGIFcDNA相同的取向连接于质粒pSRα-20-2中)的克隆。结果获得一种克隆，将包含在该克隆中的质粒记为pSRα-(20-2)△Pro。
按前面所述制得的pSRα-(20-2)△Pro是AGIF△Pro的一种表达质粒，利用与例1中所述的相似的技术将该质粒转染到COS-1细胞中，制备AGIF△Pro并将它释放到培养基中。用这种方式制备一升用pSRα-(20-2)△Pro转染的COS-1细胞的无血清的培养上清液。在用20倍体积的渗析缓冲液(10mM硼酸-NaOH(PH9.0)以及13mMKC1)在4℃下将该培养上清液渗析15小时之后，用FastProteinLiquidChromatography(FPLC)系统(由Pharmacia制造)进行弱阳离子交换色谱。这谱条件如下柱CM-ToyopearlPack650M(2.2×20cm，由Tosoh制造)洗脱缓冲液溶液A10mM硼酸-NaOH(PH9.0)，13mMKCl溶液B含有300mMNaCl的溶液A流速3ml/分钟馏分体积3ml/管浓度梯度线性浓度梯度，由100%溶液A到100%溶液B(50分钟)。
利用已知的抗体AGIFp15通过Western印迹法识别由该色谱法获得并含有AGIF△Pro的馏分。将由该方法证明含有绝大多数AGIF△Pro的二份连续馏分合并在一起，用三氯乙酸沉析法将其浓缩，并通过在还原条件下采用含有12.5%(w/v)丙烯酰胺的凝胶进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳对其进行分析。在电泳完成之后，将由该聚丙烯酰胺凝胶得到的蛋白带吸引到聚偏二氟乙烯膜(ProBlott，由AppliedBiosystems制造)上，在4℃下以18v/cm进行2.5小时，利用在转移缓冲液
中的凝胶膜吸引器(KS-8441，由Marisol制造)进行吸引。在搅拌的同时，先用含有25mMNaCl的10mM硼酸钠缓冲液(PH8.0)将吸引过的膜冲洗5分钟，再用蒸馏水冲洗5分钟，而后将膜用空气干燥，然后从该膜中切出已转移了AGIF△Pro的膜部分(即与大约23，000道尔顿的分子量相当的部分)，采用气相蛋白质序列分析仪(型号475A，由AppliedBiosytams制造)测定该蛋白质的6个N-末端氨基酸的序列。
将在该蛋白质序列分析仪的反应循环中获得的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH氨基酸)分离，并通过采用型号120A系统(由AppliedBiosysytems制造)进行逆相高效液相色谱(HPLC)将其识别。由该方法确定的氨基酸序列如下所示Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-(序列识别号为No.17)该序列与成熟AGIF中氨基酸2-7的序列相同。由此可以证实所分离出的蛋白质是缺失N-末端脯氨酸残基的成熟AGIF。
采用类似于Ohsumi等人在FEBSLetters288(1991)13-16中所述的成熟AGIF提纯方法，从用pSRα-(20-2)△Pro转染的COS-1细胞的无血清条件培养基中纯化AGIF△Pro。对以该方式制得的产物进行测试，结果证实该蛋白质能够抑制在已分化成脂细胞的3T3-细胞中的脂蛋白脂酶的活性。在该测试中蛋白质的特异活性基本上与在PCT公开WO92/08735中所述的相同测试中的成熟AGIF的相同。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人(A)名称SANKYOCOMPANY，LIMITED(B)街道2-58，HIROMACHI1-CHOME
(C)城市SHINAGAWA-KU，东京(E)国别日本(F)邮编140(G)电话03(3492)3131(H)电传03(3492)3754(ⅱ)发明名称脂肪生成抑制因子衍生物，其制备方法及其用途(ⅲ)序列号19(ⅳ)计算机阅读形式(A)介质类型软磁盘(B)计算机IBMPC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentInRelease＃1.0，Version＃1.25(EPO)(ⅵ)优先申请日(A)申请号JP04/097567(B)申请日17-APR-1992(ⅵ)优先申请日(A)申请号JP05/014056(B)申请日29-JAN-1993(2)有关序列识别号为No.1(SEQIDNo.1)的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1065碱基对(B)类型核酸(C)链双(D)拓扑型线型
(ⅱ)分子类型cDNA到mRNA(ⅲ)前提无(ⅲ)反义无(ⅸ)性能(A)名称/链CDS(B)位置18..614(ⅸ)性能(A)名称/键mat肽(B)位置18..614(ⅸ)性能(A)名称/键Sig肽(B)位置18..80(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶1
(2)有关SEQIDNO∶2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度199氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑型线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶2
(2)有关SEQIDNO∶3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度534碱基对(B)类型核酸(C)链双(D)拓扑型线型(ⅱ)分子类型cDNA到mRNA(ⅲ)前提无(ⅳ)反义无(ⅸ)性能(A)名称/键CDS(B)位置1..534(D)其它信息(x)序列描述SEQIDNO∶3
(2)有关SEQIDNO∶4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度178氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑型线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶4
(2)有关SEQIDNO∶5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度531碱基对(B)类型核酸(C)链双(D)拓扑型线型(ⅱ)分子类型cDNA到mRNA(ⅲ)前提无(ⅳ)反义无(ⅸ)性能(A)名称/键CDS(B)位置1..531(D)其它信息(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶5
(2)有关SEQIDNO∶6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度177氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑型线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶6
(2)有关SEQIDNO∶7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度507碱基对(B)类型核酸(C)链双(D)拓扑型线型(ⅱ)分子类型cDNA到mRNA(ⅲ)前提无(ⅳ)反义无(ⅸ)性能(A)名称/键CDS(B)位置1..507(D)其它信息(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶7
(2)有关SEQIDNO∶8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度169氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑型线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶8
(2)有关SEQIDNO∶9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度33碱基对(B)类型核酸(C)链单(D)拓扑型线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)前提无(ⅳ)反义无(ⅸ)性能(A)名称/键CDS(B)位置1..33(D)其它信息(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶9CCA GAT ACA GCT GTC AGG CCT GGG CCA CCA CCTPro Asp Thr Ala Val Arg Pro Gly Pro Pro Pro1510
(2)有关SEQIDNO∶10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑型线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶10Pro Asp Thr Ala Val Arg Pro Gly Pro Pro Pro1510(2)有关SEQIDNO∶11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单(D)拓扑型线型(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)前提无(ⅳ)反义无(ⅴ)片段类型N-末端(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶11Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Xaa Val15(2)有关SEQIDNO∶12的信息(ⅰ)序列特征(A)长度33碱基对(B)类型核酸
(C)链双(D)拓扑型线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)前提无(ⅳ)反义无(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶12CCAGATACAGCTGTCGCCCCTGGGCCACCACCT(2)有关SEQIDNO∶13的信息(ⅰ)序列特征(A)长度33碱基对(B)类型核酸(C)链双(D)拓扑型线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)前提无(ⅳ)反义无(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶13CCAGATACAGCTGTCAGGCCTGGGCCACCACCT(2)有关SEQIDNO∶14的信息(ⅰ)序列特征(A)长度37碱基对(B)类型核酸(C)链单(D)拓扑型线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)前提无
(ⅳ)反义无(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶14GATCCATCGAGGGTAGGGGGCCCCCACCTGGCCCCCC(2)有关SEQIDNO∶15的信息(ⅰ)序列特征(A)长度37碱基对(B)类型核酸(C)链单(D)拓扑型线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)前提无(ⅳ)反义有(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶15TCGAGGGGGGCCAGGTGGGGGCCCCCTACCCTCGATG(2)有关SEQIDNO∶16的信息(ⅰ)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链单(D)拓扑型线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)前提无(ⅳ)反义无(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶16GATACAGCTGTCGCCGGGCCCCCACCTGGC(2)有关SEQIDNO∶17的信息
(ⅰ)序列特征(A)长度6氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单(D)拓扑型线性(ⅱ)分子类型肽(ⅲ)前提无(ⅳ)反义无(ⅴ)片段类型N-末端(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶17Gly Pro Pro Pro Gly Pro15(2)有关SEQIDNO∶18的信息(ⅰ)序列特征(A)长度33碱基对(B)类型核酸(C)链双(D)拓扑型线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)前提无(ⅳ)反义无(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶18GATACAGCTGTCGCCCCTGGGCCACCACCTGGC(2)有关SEQIDNO∶19的信息(ⅰ)序列特征(A)长度30碱基对
(B)类型核酸(C)链双(D)拓扑型线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)前提无(ⅳ)反义无(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶19GATACAGCTGTCGCCGGGCCCCCACCTGGC
权利要求
1.一种多肽，它选自由缺失2-9个N末端氨基酸的人体脂肪生成抑制因子衍生物，其在功能上等价的衍生物及其前体组成的组。
2.权利要求1所述的多肽，它选自由含有下列序列(序列识别号为No.2)中的氨基酸3-178到氨基酸10-178的多肽Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu-21 -20 -15 -10Trp Pro Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro-5 1 5Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr10 15 20Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu25 30 35Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His40 45Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala50 55 60Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg65 70 75Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg80 85 90Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu95 100 105Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu110 115Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro120 125 130Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp135 140 145Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His150 155 160Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys165 170 175Thr Arg Leu178其等价物，突变体和变异体，其前体及其衍生物组成的组。
3.权利要求1所述的多肽，它具有下列序列(序列识别号为No.8)Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu1 5 10Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala15 20 25Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu30 35 40Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly45 50 55Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp60 65 70Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala75 80Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr85 90 95Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu100 105 110Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro115 120 125Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly130 135 140Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr145 150Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg155 160 165Leu169其等价物、突变体和变异体，其前体及其衍生物。
4.权利要求1所述的多肽，其中该N末端氨基酸是甲硫氨酸，或N-甲酰甲硫氨酸。
5.权利要求1所述的多肽，其中该突变体是具有突变的肽，该突变由选自由缺失，添加、倒位、插入、序列中氨基酸的取代组成的组的任何一种突变或所述突变的任何一种组合，只要所述的突变不会对该多肽的生理活性产生不利影响即可。
6.权利要求1所述的多肽，其中该变异体包括等位变异体。
7.权利要求1所述的多肽，它是融合蛋白形式。
8.一种编码一种多肽的核苷酸序列，该多肽选自由缺失2-9个N-末端氨基酸的人体脂肪形成抑制因子衍生物，其在功能上等价的衍生物及其前体组成的组。
9.权利要求8所述的核苷酸序列，它编码一种选自由含有下列序列(序列识别号为No.2)中氨基酸3-178到氨基酸10-178的多肽Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu-21 -20 -15 -10Trp Pro Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro-5 1 5Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr10 15 20Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu25 30 35Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His40 45Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala50 55 60Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg65 70 75Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg80 85 90Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu95 100 105Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu110 115Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro120 125 130Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp135 140 145Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His150 155 160Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys165 170 175Thr Arg Leu178其等价物、突变体及变异体，其前体及其衍生物组成的组中的多肽。
10.权利要求8所述的核苷酸序列，它包括选自由下列序列(序列识别号为No.1)中核苷酸87-614到核苷酸108-614组成的组中的核苷酸，其突变体、变异体及其互补序列CCTGGCCCTG TGGGGAC ATG AAC TGT GTT TGC CGC CTG GTC CTGMet Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu-21 -20 -15GTC GTG CTG AGC CTG TGG CCA GAT ACA GCT GTC GCC CCT GGG50Val Val Leu Ser Leu Trp Pro Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly-10 -5 1CCA CCA CCT GGC CCC CCT CGA GTT TCC CCA GAC CCT CGG GCC98Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala5 10 15GAG CTG GAC AGC ACC GTG CTC CTG ACC CGC TCT CTC CTG GCG146Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala20 25 30GAC ACG CGG CAG CTG GCT GCA CAG CTG AGG GAC AAA TTC CCA194Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro35 40GCT GAC GGG GAC CAC AAC CTG GAT TCC CTG CCC ACC CTG GCC242Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala45 50 55ATG AGT GCG GGG GCA CTG GGA GCT CTA CAG CTC CCA GGT GTG290Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val60 65 70CTG ACA AGG CTG CGA GCG GAC CTA CTG TCC TAC CTG CGG CAC338Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His75 80 85GTG CAG TGG CTG CGC CGG GCA GGT GGC TCT TCC CTG AAG ACCVal Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr90 95 100CTG GAG CCC GAG CTG GGC ACC CTG CAG GCC CGA CTG GAC CGG386Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg105 110CTG CTG CGC CGG CTG CAG CTC CTG ATG TCC CGC CTG GCC CTG434Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu115 120 125CCC CAG CCA CCC CCG GAC CCG CCG GCG CCC CCG CTG GCG CCC482Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro130 135 140CCC TCC TCA GCC TGG GGG GGC ATC AGG GCC GCC CAC GCC ATC530Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile145 150 155CTG GGG GGG CTG CAC CTG ACA CTT GAC TGG GCC GTG AGG GGA578Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly160 165 170CTG CTG CTG CTG AAG ACT CGG CTG TGACCCGGGG CCCAAAGCCA624Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu175CCACCGTCCT TCCAAAGCCA GATCTTATTT ATTTATTTAT TTCAGTACTG684GGGGCGAAAC AGCCAGGTGA TCCCCCCGCC ATTATCTCCC CCTAGTTAGAGACAGTCCTT CCGTGAGGCC TGGGGGACAT CTGTGCCTTA TTTATACTTA744TTTATTTCAG GAGCAGGGGT GGGAGGCAGG TGGACTCCTG GGTCCCCGAG804GAGGAGGGGA CTGGGGTCCC GGATTCTTGG GTCTCCAAGA AGTCTGTCCA864CAGACTTCTG CCCTGGCTCT TCCCCATCTA GGCCTGGGCA GGAACATATA924TTATTTATTT AAGCAATTAC TTTTCATGTT GGGGTGGGGA CGGAGGGGAA984AGGGAAGCCT GGGTTTTTGT ACAAAAATGT GAGAAACCTT TGTGAGACAGAGAACAGGGA ATTAAATGTG TCATACATAT C1044 1065
11.权利要求8所述的核苷酸序列，它具有下列序列(序列识别号为No.7)GTT TCC CCA GAC CCT CGG GCC GAG CTG GAC AGC ACC GTG CTCVal Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu1 5 10CTG ACC CGC TCT CTC CTG GCG GAC ACG CGG CAG CTG GCT GCA48Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala15 20 25CAG CTG AGG GAC AAA TTC CCA GCT GAC GGG GAC CAC AAC CTG96Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu30 35 40GAT TCC CTG CCC ACC CTG GCC ATG AGT GCG GGG GCA CTG GGA144Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly45 50 55GCT CTA CAG CTC CCA GGT GTG CTG ACA AGG CTG CGA GCG GAC192Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp60 65 70CTA CTG TCC TAC CTG CGG CAC GTG CAG TGG CTG CGC CGG GCA240Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala75 80GGT GGC TCT TCC CTG AAG ACC CTG GAG CCC GAG CTG GGC ACC288Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr85 90 95CTG CAG GCC CGA CTG GAC CGG CTG CTG CGC CGG CTG CAG CTC336Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu100 105 110CTG ATG TCC CGC CTG GCC CTG CCC CAG CCA CCC CCG GAC CCGLeu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro115 120 125CCG GCG CCC CCG CTG GCG CCC CCC TCC TCA GCC TGG GGG GGC384Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly130 135 140ATC AGG GCC GCC CAC GCC ATC CTG GGG GGG CTG CAC CTG ACA432Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr145 150CTT GAC TGG GCC GTG AGG GGA CTG CTG CTG CTG AAG ACT CGG480Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg155 160 165CTG507Leu169其突变体、变异体及其互补序列。
12.与权利要求8所述的序列互补的一种核苷酸序列。
13.权利要求8所述的核苷酸序列，其中其在功能上等价的衍生物由等位变异体组成。
14.权利要求8所述的核苷酸序列，其中该在功能上等价的衍生物包括具有选自下列组中的突变体的多肽，该组由缺失，附加，插入，倒位，序列中残基的取代或其任何结合组成，只要这些突变不会对该人体脂肪生成抑制因子衍生物的功能活性产生不利影响即可。
15.权利要求8所述的核苷酸序列，它至少与其一种控制序列在功能相关。
16.权利要求8所述的核苷酸序列，它至少与一种选自下列组的序列在功能相关，该组由启动子序列、操作子序列、终止序列、诱导序列，或其组合组成。
17.一种载体，它含有权利要求8到16的任何一个定义的核苷酸序列。
18.权利要求17所述的载体，它是pSRα-(20-2)△Pro。
19.权利要求17所述的载体，它是pSRα-20-2。
20.一种宿主细胞，它采用权利要求8-16中任一权利要求定义的核苷酸序列，或用权利要求17-19中任一权利要求定义的载体来进行转化。
21.一种用于治疗可预防血细胞减少症，或病态肥胖症的药物组合物，该组合物包括有效量的防血细胞减少症化合物，或防病态肥胖症化合物，并混合了药物可接受的稀释剂或载体，其中所述的防血细胞减少症化合物，或所述的防病态肥胖症化合物选自缺失1-9个N-末端氨基酸的人体脂肪生成抑制因子衍生物，其在功能上等价的衍生物及其前体。
22.权利要求21所述的组合物，其中所述的防血细胞减少症化合物，或所述的防病态肥胖症化合物是一种多肽，该多肽选自由含有下列序列(序列识别号为No.2中氨基酸2-178到氨基酸10-178的多肽Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu-21 -20 -15 -10Trp Pro Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro-5 1 5Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr10 15 20Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu25 30 35Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His40 45Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala50 55 60Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg65 70 75Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg80 85 90Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu95 100 105Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu110 115Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro120 125 130Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp135 140 145Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His150 155 160Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys165 170 175Thr Arg Leu178其等价物、突变体及变异体，其前体及其衍生物组成的组。
23.权利要求22所述的组合物，其中所述的防血细胞减少症化合物，或所述的防病态肥胖症化合物是一种具有下列序列(序列识别号为No.8)的多肽Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu1 5 10Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala15 20 25Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu30 35 40Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly45 50 55Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp60 65 70Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala75 80Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr85 90 95Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu100 105 110Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro115 120 125Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly130 135 14060;Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr145 150Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg155 160 165Leu169其等价物、突变体及变异体，其前体及其衍生物。
24.权利要求22所述的组合物，其中所述的防血细胞减少症化合物，或所述的防病态肥胖症化合物是具有下列序列(序列识别号为No.6)的多肽Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg1 5 10Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu15 20 25Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe30 35 40Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu45 50 55Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly60 65 70Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg75 80His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys85 90 95Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp100 105 110Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala115 120 125Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala130 135 140Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala145 150Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg155 160 165Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu170 175其等价物、突变体及变异体，其前体及其衍生物。
全文摘要
本发明涉及脂肪生成抑制因子(AGIF)的衍生物，它等价于缺失2—9个N-末端氨基酸的成熟AGIF，还涉及编码这类衍生物的核酸、含有这类核酸的载体及宿主细胞以及制备这种衍生物的方法。还要求了与缺失1—9个N-末端氨基酸的成熟AGIF等价的AGIF衍生物作为抗血细胞减少症及病态肥胖症治疗药物的用途。
文档编号A61K38/00GK1082112SQ93105918
公开日1994年2月16日 申请日期1993年4月17日 优先权日1992年4月17日
发明者宫台健司, 川岛一郎, 大隅润, 滝口洋, 伊藤泰博 申请人:三共株式会社