用于增加产热脂肪细胞的方法
【专利说明】用于增加产热脂肪细胞的方法
[0001] 本申请为分案申请，原申请的申请日为2010年6月8日，申请号为 201080036063. 2 (PCT/US2010/037779)，发明名称为"用于增加产热脂肪细胞的方法"。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求以下美国临时申请序列号的权益：2009年6月8号申请的 61/268, 128、2009 年 9 月 10 日申请的 61/276, 422 和 2009 年 11 月 3 日申请的 61/280, 545。 所有上述引用的申请的教导通过引用结合到本文中。
[0004] 发明背景
[0005] 哺乳动物脂肪细胞传统上分类为储存能量的白色脂肪细胞或消耗能量的棕色脂 肪细胞。棕色脂肪细胞表达解偶联蛋白-I (UCPl)，其通过使ATP产生与线粒体质子梯度解 偶联而将生物化学能量转换为热量（Cannon等，2004, Physiol Rev 84:277-359)。这样的 产热用来在冷的环境条件下维持体温，或者在面对过量热量摄入时促进能量平衡。为了强 调棕色脂肪的代谢重要性，在小鼠中使其遗传缺损导致胰岛素抵抗、高血糖、高脂血症和高 胆固醇血症伴随的重度肥胖症。（Lowell等，1993,Nature 366 :740-742 ;Hamann等，1995， Diabetes44 :1266-1273 ;Hamann 等，1996，Endocrinology 137 :21-29)。鉴于 UCP-I 作为重 要解偶联蛋白的作用，表达UCP-I的脂肪细胞将具有产热活性。
[0006] 在人类中，棕色脂肪组织在婴儿中起着重要的产热作用，但在出生后发育期间收 缩，并且历史上认为在成人中稀少和在临床上不重要。然而，最近的发现已颠覆该想法，并 对成年期间棕色脂肪组织的作用产生了相当大的兴趣。具体地，将正电子成像术和计算层 析X射线照相术（PET-CT)联合用于监测肿瘤转移导致偶然检测到在显著百分比的成人 中高度活性、推定的棕色脂肪库（Nedergaard 等，2007，Am J Physiol Endocrinol Metab 293 :E444-E452)。随后的研宄已在健康成人中证实，这些库确实为表达UCPl的功能棕色 脂肪（Virtanen 等，2009, N Engl J Med 360:1518-1525)，在超过 90% 的研宄的年轻男 性中，冷暴露期间观察到棕色脂肪组织活性，但热中性条件期间则未观察到（van Marken Lichtenbelt等，2009，N Engl J Med 360:1500-1508)。此外，由于不同诊断原因而进行的 近两千PET-CT扫描的回顾性分析表明活性棕色脂肪的量与体重指数（一种广泛使用的整 体肥胖的度量）逆相关，引起棕色脂肪在成人代谢中重要有益作用的可能性（Cypess等， 2009，N Engl J Med 360:1509-1517)。不太清楚的是散布在白色脂肪组织中的产热脂肪细 胞（例如，棕色脂肪细胞或其他表达UCP-I的脂肪细胞）的作用。
[0007] 鉴于产热脂肪细胞的重要代谢活性，存在体内增加（例如通过形成和/或增加的 活性）产热脂肪细胞的物质的需要。
[0008] 发明概述
[0009] 在一些方面，本说明书提供用于通过使用ActRIIB信号转导途径的拮抗剂增加患 者中产热脂肪细胞的方法。这样的拮抗剂可为，例如可溶性ActRIIB蛋白（例如ActRIIB-Fc 融合蛋白）、与ActRIIB结合或抑制ActRIIB表达的拮抗剂，和与通过ActRIIB进行信号转 导的配体结合或抑制其表达并参与产热脂肪细胞的调节的拮抗剂。这样的配体包括肌肉抑 制素（myostatin，即⑶F8)、⑶F3、激活蛋白（例如激活蛋白A、B、C或E)、⑶Fll和Nodal。
[0010] 在一些方面，本说明书提供用于通过给予有需要的患者有效量的ActRIIB相关多 肽来增加产热脂肪细胞的方法。ActRIIB相关多肽可为与ActRIIB配体例如⑶F3、⑶F8、 ⑶F11、激活蛋白或Nodal结合的ActRIIB多肽（例如ActRIIB胞外结构域或其部分）。任 选地，ActRIIB多肽与ActRIIB配体结合的Kd小于10微摩尔浓度，或小于1微摩尔浓度， 100、10或1纳摩尔浓度。多种合适的ActRIIB多肽已在下述公开PCT专利申请中描述，所 有公开PCT专利申请通过引用结合到本文中：WO 00/43781、W0 04/039948、W0 06/012627、 TO 07/053775、W0 08/097541 和 WO 08/109167。任选地，ActRIIB 多肽抑制 ActRIIB 信号转 导，例如由ActRIIB配体引发的细胞内信号转导事件。在这种制剂中使用的可溶性ActRIIB 多肽可为本文公开的任何多肽，例如具有选自SEQ ID N0:l、2、5、6、12、14和17的氨基酸 序列的多肽，或具有与选自SEQ ID勵：1、2、5、6、12、14和17的氨基酸序列有至少80%、 85%、90%、95%、97%或99%同一性的氨基酸序列的多肽。可溶性ActRIIB多肽可包括天 然ActRIIB多肽的功能片段，例如包含选自SEQ ID勵：1、2、5、6、12、14和17的序列的至少 10、20或30个氨基酸的多肽，或包含SEQ ID N0:1的序列（缺失C末端1、2、3、4、5或10-15 个氨基酸和在N末端缺失1、2、3、4或5个氨基酸）的多肽。任选地，多肽将包含相对于SEQ ID NO :1在N末端2-5个氨基酸和在C末端不超过3个氨基酸的截短。另一多肽示为SEQ ID NO :12。可溶性ActRIIB多肽可在氨基酸序列中（例如在配体结合结构域中）包含相对 于天然存在的ActRIIB多肽的一、二、三、四、五或更多个改变。相对于天然存在的ActRIIB 多肽，氨基酸序列中的改变可例如在哺乳动物、昆虫或其他真核细胞中产生时改变多肽的 糖基化，或者改变多肽的蛋白酶剪切。可溶性ActRIIB多肽可为融合蛋白，其具有作为一个 结构域的ActRIIB多肽（例如ActRIIB或其变体的配体结合结构域）和提供所需性质（例 如改进的药代动力学、较容易的纯化、靶向特定组织等）的一个或多个额外的结构域。例 如，融合蛋白的结构域可增强一种或多种如下性质：体内稳定性、体内半寿期、摄入/给药、 组织定位或分布、蛋白复合体的形成、融合蛋白的多聚化和/或纯化。可溶性ActRIIB融合 蛋白可包含免疫球蛋白恒定结构域，例如Fc结构域（野生型或突变体）或血清白蛋白。在 特定实施方案中，ActRIIB-Fc融合蛋白包含位于Fc结构域和胞外ActRIIB结构域之间的 相对非结构化的接头。该非结构化接头可对应于ActRIIB的胞外结构域C末端的约15个 氨基酸的非结构化区域（"尾"），或者它可为相对不含二级结构的具有5-15、20、30、50或 更多个氨基酸的人工序列。接头可富含甘氨酸和脯氨酸残基，并可例如包含苏氨酸/丝氨 酸和甘氨酸的重复序列，例如TG 4重复（SEQ ID NO: 18)或SG4重复（SEQ ID NO: 19)。融合 蛋白可包括纯化子序列（subsequence)，例如表位标签、FLAG标签、多组氨酸序列和GST融 合体。任选地，可溶性ActRIIB多肽包含一个或多个选自以下的修饰氨基酸残基：糖基化氨 基酸、PEG化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的 氨基酸和与有机衍生剂（derivatizing agent)缀合的氨基酸。通常优选在以下哺乳动物 细胞系中表达ActRIIB蛋白：其适当介导ActRIIB蛋白的天然糖基化以便减少患者中不利 免疫反应的可能性。已成功应用人和CHO细胞系，并预期其他常见的哺乳动物表达载体是 有用的。
[0011] 在一些方面，本文公开的化合物可配制成药物制剂。药物制剂亦可包含一种或多 种另外的化合物，例如用于治疗ActRIIB相关疾病的化合物。优选地，药物制剂基本上不含 致热原。
[0012] 在一些方面，本说明书提供编码可溶性ActRIIB多肽的核酸，其不编码完整的 ActRIIB多肽。分离的多核苷酸可包含例如上文所述的可溶性ActRIIB多肽的编码序列。 例如，分离的核酸可包含编码ActRIIB的胞外结构域（例如配体结合结构域）的序列，和编 码ActRIIB的部分或全部的跨膜结构域和/或胞质结构域，但不编码位于跨膜结构域或胞 质结构域内或者位于胞外结构域和跨膜结构域或胞质结构域之间的终止密码子的序列。例 如，分离的多核苷酸可包含全长ActRIIB多核苷酸序列例如SEQ ID NO :4,或者部分截短形 式，所述分离的多核苷酸还包含3'端至少600个核苷酸前的转录终止密码子，或者位于其 它位置使得多核苷酸的翻译产生任选与全长ActRIIB的截短部分融合的胞外结构域的转 录终止密码子。本文公开的核酸可与用于表达的启动子有效连接，并且本说明书提供用这 样的重组多核苷酸转化的细胞。优选细胞为哺乳动物细胞，例如CHO细胞。
[0013] 在一些方面，本说明书提供用于制备可溶性ActRIIB多肽的方法。这样的方法可 包括在合适细胞例如中国仓鼠卵巢（CHO)细胞中表达本文公开的任何核酸（例如SEQ ID NO :3)。这样的方法可包括：a)在适合可溶性ActRIIB多肽表达的条件下培养细胞，其中所 述细胞用可溶性ActRIIB表达构建体转化；和b)回收如此表达的可溶性ActRIIB多肽。可 使用从细胞培养物获得蛋白的任何公知技术，将可溶性ActRIIB多肽回收为粗的、部分纯 化的或高度纯化的部分。
[0014] 在一些方面，使用本文所述的化合物增加产热脂肪细胞可用于控制其中控制代谢 活性是有益的多种疾病。实例包括控制肥胖、减少身体脂肪含量或降低身体脂肪含量增加 速率，和治疗疾病例如肥胖症、非胰岛素依赖性糖尿病（NIDDM)、2型糖尿病、心