诱导褐色脂肪形成的方法和组合物的制作方法

专利名称：诱导褐色脂肪形成的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本公开文本涉及治疗肥胖症以及体重相关疾病和病患的方法和组合物。更 具体地说，本公开提供了调节(例如提高)细胞或细胞群中褐色脂肪组织的脂肪形成 (adipogenesis)的方法和组合物、以及鉴定能够分化为褐色脂肪组织细胞系或者向该细胞 系分化的细胞的方法。背景肥胖症由于其直接或间接在诸如糖尿病、心脏病和癌症等其他疾病的发展和发病 机理中的作用而成为了主要的全球性健康问题。肥胖症的发生是当能量的摄入超过能量的 消耗，通常与脂肪细胞或脂肪组织的异常积累相关。脂肪组织，与肌肉和骨骼一样，来源于中胚层，含有有丝分裂小室(mitotic compartment)，允许白色脂肪细胞(又称为白色脂肪组织(white adipose tissue, WAT)细 胞)和/或褐色脂肪细胞(又称为褐色脂肪组织(brown adipose tissue, BAT)细胞)的 生长和分化。BAT和WAT细胞均由间充质干细胞产生，这些间充质干细胞在受到适当的发育 指示引发时定型为脂肪细胞系，并被命名为前脂肪细胞。前脂肪细胞含有WAT和BAT前体 细胞或者能够分化为BAT或WAT细胞的祖细胞。最近，在褐色脂肪前体细胞，而未在白色脂肪前体细胞中鉴定到肌原基因表达特 征(Timmons et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. , 104 :4401-4406, 2007),这表明 BAT 前 体细胞与WAT前体细胞不同并且能够区分开。此外，发现褐色脂肪细胞储存散布在小鼠，特 别是肥胖症抗性株小鼠的后肢肌肉束之间(Almind et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.， 104 :2366-2371,2007)，表明骨骼肌可能含有能够分化为BAT细胞或者向BAT细胞分化的祖 细胞。WAT组织是主要的储存甘油三酯和释放脂肪酸的部位。WAT可见于皮下，它提供绝 热、缓冲撞击和震动以及能量储备。一般体态的人具有大概200到400亿WAT细胞。肥胖 人含有的WAT可能比一般体态的人多10倍。BAT 细胞含有丰富的大线粒体(Nedergaard et al.，in Brown Adipose Tissue, Trayhurn and Nicholls，Eds. (Edward Arnold，Baltimore，1986))，这些线粒体作为氧化磷 酸化、中间代谢、适应性产热、产生活性氧以及细胞凋亡的中心部位。在BAT中，长久以来已 知道线粒体生物合成伴随着褐色脂肪细胞分化。过去10年，越来越多的证据表明线粒体完 整性的改变是造成许多人类疾病(包括肥胖症、糖尿病、癌症、神经退行性变)以及衰老的 原因(Duchen, Diabetes 53 (Supp 1 1) :S96_102 (2004) ；Taylor and Turnbul 1, Nat. Rev. Genet. 6 :389-402(2005) ；Lowell and Shulman, Science 307:384-387(2005))。BAT经由解偶联蛋白-ι (UCP-I)的表达参与产热能量消耗。BAT-依赖性能量消耗用于在寒冷时保持体温和/或waste food energy。因此，有缺陷的或者不足的BAT经常 与肥胖症关联。小鼠中切除BAT导致了严重肥胖症，通常还伴有胰岛素抗性、高血糖症、高 脂血症和高胆固醇血症，这一观察强调出BAT对整体能量稳态的重要性(Lowell at al., Nature 366(6457) :740-2(1993) ；Hamann et al. , Diabetes.44(11) :1266-73(1995)； Hamann et al. , Endocrinology 137(1) :21_9(1996)。发明概述本文至少部分基于这样的发现，即用一或多种骨形态发生蛋白(BMP)处理过的干 细胞抗原-1阳性(Sca-Ι+)祖细胞分化为真正的BAT细胞或者向该细胞分化。这些BAT细 胞是真正的BAT细胞，它们具有通过打开BAT细胞产热程序而对儿荼酚胺刺激产生应答的 能力。“BMP-处理的”用在本文意味着细胞具有人工增强的BMP信号传导(例如 BMP-2、-4、-5、-6和/或-7信号传导)水平。“人工”增强意味着通过人类直接干预提高 了 BMP信号传导水平。可以通过本文描述的任何方法增强BMP信号传导，例如通过用文中 描述的能够增强BMP信号传导的化合物，例如BMP多肽、编码BMP的核酸、小分子和/或抗 体来处理细胞。通过本文描述的方法激活的ka-Ι+细胞群也包含在本发明中。这些细胞 可以是自体的、同种异体的或异种的。一些实施方案中，本文描述的方法可以包括用足够提高BMP信号传导的量的化合 物处理ka-Ι+祖细胞群(例如与之进行接触)，从而产生BMP处理的细胞群。具体实施方案中，本文描述的方法包括将这些BMP处理的ka-Ι+细胞移植给受 试对象。可以将BMP-处理的ka-Ι+细胞直接移植或者在细胞可附着其上的支架、基质或 其他可移植装置(实例包括由胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、醋酸纤维素、硝酸纤维素、多 糖、纤维蛋白、明胶以及它们的组合制成的载体)上给予。一般来说，方法包括移植BMP处 理的^^-1+细胞群，所述细胞群包含足够提高受试对象中褐色脂肪组织发生的细胞数量， 例如将受试对象的BAT量提高至少1%，例如2%、5%、7%、10%、15%、20%、25%或以上。一些实施方案中，方法包括提供纯化的ka-Ι+祖细胞群(例如，其中至少60%、 例如70 % ,80^^90%是&￡1-1+祖细胞的细胞群)；如本文所述将这些细胞与能够提高 BMP-2、-4、-5、-6和/或-7中的一种或多种的表达水平或活性的化合物进行接触，从而产 生BMP处理的细胞。能够提高BMP-2、-4、-5、_6和/或_7信号传导的化合物可以是例如以下的一种 或多种(a)BMP_2、_4、_5、_6和/或_7多肽或者其功能性片段或变体，优选活性(例如， BMPR-I和/或BMPR-II活化)BMP-2、-4、-5、_6和/或-7多肽或其功能性片段或类似物 (例如，成熟BMP-2、-4、-5、-6和/或-7多肽，例如文中描述的成熟BMP-2、-4、-5、-6和/ 或-7多肽)；(b)能够(通过例如提高或稳定BMP-2、-4、-5、_6和/或_7与其受体的结合) 提高BMP-2、-4、-5、-6和/或-7的活性(例如BMPR-I和/或BMPR-II活化活性)的 BMP-2、-4、-5、-6和/或-7的肽或蛋白质激动剂；(c)模拟BMP-2、-4、_5、_6和/或_7信号传导活性，例如BMPR-I和/或BMPR-II 结合活性，或SMAD磷酸化活性的小分子或蛋白模拟物；
(d)通过例如结合BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因的启动子区域而提高 BMP-2、-4、-5、-6和/或-7的表达的小分子；(e)抗体，例如能够结合BMP-2、-4、_5、_6和/或_7并稳定或协助BMP-2、-4、_5、_6 和/或-7与BMP-2、-4、-5、-6和/或-7结合伙伴(例如本文描述的BMP-2、-4、-5、-6和 /或-7受体)的结合的抗体。在一些实施方案中，结合BMP-2、-4、-5、-6和/或_7的抗体 是单克隆抗体，例如人源化的嵌合单克隆抗体或人的单克隆抗体；或者(f)编码BMP-2、-4、-5、_6和/或_7或其功能性片段或类似物的核酸。所述核酸 可以是基因组序列或cDNA序列。在一些实施方案中，所述化合物是BMP-2、-4、-5、_6和/或_7多肽或核酸。 “BMP-2、-4、-5、-6和/或-7多肽或核酸”用于本文是如本文描述的BMP-2、-4、-5、-6和/ 或-7多肽或核酸，例如成熟人BMP-2、-4、-5、-6和/或-7多肽或其活性片段，或者编码成 熟人BMP-2、-4、-5、-6和/或-7多肽或其活性片段的核酸。在一些实施方案中，所述化合物是BMP-2多肽，例如人BMP-2，例如成熟BMP-2多 肽，例如包含SEQ ID NO 1中氨基酸观3-396的BMP-2多肽。所述多肽可以是重组多肽。在一些实施方案中，所述化合物是BMP-4多肽，例如人BMP-4，例如成熟BMP-4多 肽，例如包含SEQ ID NO :2中氨基酸四3-408的BMP-4多肽。所述多肽可以是重组多肽。在一些实施方案中，所述化合物是BMP-5多肽，例如人BMP-5，例如成熟BMP-5多 肽，例如包含SEQ ID NO 3中氨基酸323-454的BMP-5多肽。所述多肽可以是重组多肽。在一些实施方案中，所述化合物是BMP-6多肽，例如人BMP-6，例如成熟BMP-6多 肽，例如包含 SEQ ID NO :4 中氨基酸 374-513、SEQ ID NO :4 中氨基酸 382_513、SEQ ID NO: 4中氨基酸388-513或者SEQ ID NO 4中氨基酸412-513的BMP-6多肽。所述多肽可以是 重组多肽。在一些实施方案中，所述化合物是BMP-7多肽，例如人BMP-7，例如成熟BMP-7多 肽，例如包含SEQ ID NO 5中氨基酸四3-431的BMP-7多肽。所述多肽可以是重组多肽。在一些实施方案中，所述化合物是编码BMP-2、-4、-5、_6和/或_7多肽或者其 生物活性片段或类似物的核酸。BMP核酸可以包括BMP-2、-4、-5、_6和/或-7编码区； 启动子序列，例如来自BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因或另一个基因的启动子序列；增强 子序列；非翻译调控序列，例如5 ‘非翻译区(UTR)，例如来自BMP-2、-4、-5、_6和/或-7 基因或另一个基因的5' UTR，例如3' UTR，例如来自BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因或 另一个基因的3' UTR;多腺苷酸化位点；隔离子序列。在另一个实施方案中，通过提高内 源BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因的表达水平来提高BMP-2、-4、-5、_6和/或-7蛋白 的水平，例如通过提高BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因的转录或者提高BMP-2、-4、-5、-6 和/或_7mRNA的稳定性。在一些实施方案中，提高BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因的转 录是通过改变内源BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因的调控序列，例如通过加入阳性调控 元件(比如增强子或转录激活因子的DNA结合位点)；删除阴性调控元件(比如转录抑制 因子的DNA结合位点)和/或将内源调控序列或其中的元件用其他基因的替换，从而允许 BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因的编码区被更有效地转录。一些实施方案中，所述核酸编码或提高BMP-7的转录。一些实施方案中，本发明描述了 BMP处理的ka-Ι+祖细胞群。在一些实施方案中，所述细胞被基因工程化从而稳定或者瞬时表达水平提高的文中所述BMP-2、-4、-5、-6和/ 或-7多肽。所述细胞可以是例如培养的哺乳动物细胞，例如人细胞。在一些实施方案中， 所述细胞被基因工程化从而还表达至少一种其他蛋白，例如非BMP-2、-4、-5、-6和/或-7 多肽，和/或第二(或更多)BMP蛋白。表达的BMP-2、-4、-5、_6和/或-7多肽通常与干 细胞是相同物种，例如在人细胞中表达的人BMP。在一些实施方案中，所述细胞被永生化，例 如能够在培养基中无限地自我更新。本发明的一个方面提供了提高体外细胞群中具有褐色脂肪组织(BAT)细胞特征 之细胞的数量的方法。这些方法包括获得本文公开的包含干细胞抗原-1阳性(ka-1+)、 CD45阴性、Mac-I阴性的祖细胞的细胞群；以及将所述体外祖细胞群与足够量能够促进骨 形态发生蛋白BMP-2、-4、-6或-7中一或多种的表达的化合物接触，接触时间足以使所述细 胞群中具有褐色脂肪组织(BAT)细胞特征的细胞的数量增加；或者将所述细胞群进行基因 工程化从而使BMP-2、-4、-6或-7中一或多种表达水平足以将所述细胞群中具有BAT细胞 特征的细胞数量提高。本发明的另一方面提供了促进受试对象褐色脂肪组织形成的方法。这些方法包括 挑选需要处理的受试对象；获得本文公开的包含干细胞抗原-1阳性(Sca-1+)、CD45阴性、 Mac-I阴性的祖细胞的细胞群；和将所述体外祖细胞群与足够量能够促进骨形态发生蛋白 BMP-2、-4、-6或-7中一或多种的表达的化合物接触，接触时间足以使所述细胞群中具有褐 色脂肪组织(BAT)细胞特征的细胞的数量增加；或者将所述细胞群进行基因工程化从而使 BMP-2、-4、-6或-7中一或多种表达水平足以将所述细胞群中具有BAT细胞特征的细胞数 量提高；以及将所述细胞群给予受试对象，所述方法在受试对象中有效地提高所述受试对 象具有BAT细胞特征的细胞的数量。本发明又一方面提供了通过本文描述的方法制备的细胞群，以及包含这些细胞群 和可药用载体的药物组合物。本发明再一方面提供了细胞递送系统。这些细胞递送系统包括储存容器，所述储 存容器含有通过本文描述的方法制备的一或多种细胞、可药用载体，以及与储存容器有液 相接触的递送装置，例如针头或插管(套管)。本发明还有一个方面提供了包含产热BMP处理的干细胞抗原-1阳性(Sca-Ι+)细 胞群的组合物。一些情况中，这些细胞能够非颤抖地产热。“治疗”用于本文意味着使疾病或病症被缓解或发生其它有益性改变的任何方式。 用于本文，特定病症的症状缓解是指因为通过发明所述组合物和方法的治疗或者与这种治 疗有关而发生的症状的任何减轻，无论是永久性还是暂时的，长效的还是瞬间的。名词“有效量”和“有效治疗”用于本文是指本文描述的一或多种组合物的量或者 浓度使用一段时间(包括急性或慢性给药以及周期性或连续性给药)就造成预期效果或生 理结果的给药目的而言是有效的。名词“受试对象”贯穿在说明书中用于描述被给予了根据发明所述方法进行的治 疗的动物(人或非人动物、啮齿类或非啮齿类动物)。兽医和非兽医应用均被考虑到。该名 词包括但不限于哺乳动物，例如人、其他灵长类动物、猪、诸如小鼠和大鼠的啮齿类、兔、豚 鼠、仓鼠、牛、马、猫、犬、绵羊和山羊。典型的受试对象包括人、农场动物和诸如猫和犬的宠 物。在一些实施方案中，所述受试对象是哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试对象是人受试对象，例如肥胖的人受试对象。在一些实施方案中，所述受试对象是非人哺乳动物，例 如实验单位、伴侣动物或食用动物，例如养来作为食品的牛、猪或绵羊。用于本文中“分离的”或“纯化的”多肽、肽或蛋白基本不含有来自所述蛋白所来 源的细胞或组织来源的细胞物质或其它杂蛋白，或者在化学合成的情况下基本不含化学前 体或其他化学物质。“基本不含有”意味着选定蛋白的制品含有低于干重大约30% (例如 低于20%、10%或5%)的非选定蛋白或化学物质前体。这种非选定蛋白在文中也称为“污 染蛋白”。当分离的治疗蛋白、肽或多肽是重组产生的时，它们可以基本不含有培养基，即培 养基代表蛋白制品中低于大约20% (例如低于大约10%或5%)的体积。“肥胖症(obesity) ”用在本文是指受试对象的一种病症，其中受试对象的体重超 过根据标准表格中他们的理想体重的20%或以上，例如25%、30%、40%、50%或更多。肥 胖还可以表示体质量指数(BMI) 30或以上(例如30-35、35-40或更高)的受试对象。例 如，被诊断为I度肥胖的受试对象BMI范围为30-34. 9。II度肥胖受试对象BMI范围为 35.0-39.9。III度肥胖受试对象BMI大于40。“超重”用于本文是指BMI范围在25. 0-29. 9的受试对象。用于本文，“干细胞”既能够自我更新也能分化为许多不同细胞系(是多能的)。 “祖细胞”是指具有与干细胞表现型类似表现型的干细胞亚类。祖细胞能够自我更新，通常 是多能的。除非另有定义，本文使用的所有科技名词均与本发明所属技术领域的普通技术人 员通常所理解的意义相同。文中描述了用于本发明的方法和材料，也可以使用本领域已知 的其他合适的方法和材料。这些材料、方法和实例仅用于阐述，并非用于限制。文中提及的 所有出版物、专利申请、专利、数据库输入以及其他参考文献均通过引用全文并入本文。有 冲突的情况下，根据本说明书包括其中的定义。由以下详细描述和附图以及权利要求可以容易地看出本发明的其他特性和优点。


图IA是含有褐色前脂肪细胞的培养皿图像集。图IB是白色前脂肪细胞的图像集。所述细胞用指明的骨形态发生蛋白(BMP)处 理，并用油红(Oil Red) 0染色来评价脂质累积。对照细胞未暴露于BMP。染色深(显示为 红色)的细胞显示脂质累积。图2A的条形图显示利用定量RT-PCR评估的接触了指定BMP的褐色前脂肪细胞中 解偶联蛋白(uncoupling protein,UCP)和诱导细胞死亡的DFF45样效应因子A(CIDEA)的 表达。对照细胞未暴露于 BMP。< 0. 001, **P < 0. 01, *P < 0. 05o图2B是用UCP-I和β-微管蛋白的特异抗体探测的免疫印迹图像。β-微管蛋白 显示为上样对照。图3Α和;3Β显示油红0染色的对照细胞㈧和暴露于ΒΜΡ-7的细胞⑶的照片。 染色深(显示为红色)的细胞显示脂质累积。两幅图像中还可以清楚看到脂肪滴。图4Α的条形图显示了利用定量RT-PCR评价的对照细胞和暴露于ΒΜΡ-7的细胞中 过氧化物酶体增殖物激活受体、(PPARY)、脂肪酸结合蛋白4(aP》、脂肪酸合成酶(FAS)、 CIDEA和UCP-I的表达。结果表示为相对于对照细胞的百分比增长。
图4B的条形图显示了对照细胞和暴露于BMP-7的细胞中cAMP诱导的UCP-I表达。 显示单独UCP-I处理的条形作为cAMP的对照条形。图5A-5C是从骨骼肌分离的经BMP7处理的细胞的图像，其中所述细胞用 油红-O(ORO)染色来评价脂累积。对照细胞未暴露于BMP。染色深(显示为红色)的细胞 显示脂质累积。图6A的散点图显示了利用FACS获得的Sca-I+/⑶45-/Mac-l-细胞群体。图6B-6C的线形图显示利用流式细胞术评价的ka-l+/CD45-/Mac-l-细胞表面上 各种标记物的有无。箭头显示被染色的细胞。图7A-7N的线形图显示了利用定量RT-PCR在暴露于BMP-7的细胞中随时间检测 到的标记物水平。箭头显示在暴露于BMP7的细胞中观察到的结果。图8的条形图显示对照细胞和暴露于BMP-7的细胞中cAMP诱导的UCP-I表达。单 独UCP-I处理得到的条形图作为cAMP的对照条形。图9A-F是一组6张显微照片。9A、9C和9E显示了未经BMP7处理(对照)的分离 自肩胛间BAT(BAT) (9A)、皮下白色脂肪组织(SQ-WAT) (9C)和内脏白色脂肪组织(EPI-WAT) (9E)的^^-1+细胞。9B的细胞分离自肩胛间BAT(BAT)、9D的细胞分离自皮下白色脂肪组 织(SQ-WAT)、9F的细胞分离自内脏白色脂肪组织(EPI-WAT)，它们均经BMP7处理(BMP7)。图10A-10B的条形图显示了分离自肩胛间BAT(BAT)、皮下白色脂肪组织(SQ-WAT) 和内脏白色脂肪组织(EPI-WAT)的细胞中脂肪酸合成酶(FAS ；Α)和解偶联蛋白-1 (UCP-1 ； B)的表达水平。图11是显示从肥胖抗性小鼠(129)和肥胖倾向小鼠(B6)中分离的总细 胞的条形图。图12A-12B的条形图显示了从肥胖抗性小鼠(129)和肥胖倾向小鼠(B6)中分离 的经BMP处理的ka-Ι+细胞中UCP-I和PPAR γ的表达水平。图13A-13D是荧光显微图像。13Α和显示了移植的经ΒΜΡ7处理的绿 色荧光蛋白细胞在移植10天后的图像。不含有移植细胞的对照图像见13A和13C。移植的 GFP细胞在右侧(图1 和13D)显示，细胞表现出颜色更深。图14A-14F的图像显示移植了经BMP7处理的绿色荧光蛋白细胞的脂肪块 的显微切片。切片来自非绿色荧光蛋白阳性的受体小鼠。注射后第10天在受体小鼠中通 过落射荧光(印ifIuorescence)检测到绿色荧光蛋白阳性的细胞。原始放大倍数=200X。图15A-15F的条形图显示用BMP-7、BMP-3、BMP-4或载体对照(C)处理过的来源于 肌肉的ka-Ι+细胞中UCP-I、Cidea、PPARg、FAS、肌细胞生成素(Myogenin)和MyoD的表达 水平。发明详述本公开提供了尤其是可用于提高受试对象BAT水平和/或功能的组合物以及方 法，从而给受试对象治疗肥胖症和体重相关的疾病和病症，比如下文提到的状况。这些方 法包括促进祖细胞的特定亚组(例如能够分化为BAT细胞的祖细胞)分化为BAT细胞系 或者向该细胞系分化。更具体地说，本公开至少部分基于这样的发现，即用骨形态发生蛋白 (BMP)处理过的干细胞抗原-1阳性(Sca-Ι+)祖细胞能够分化为BAT细胞系或者向该细胞 系分化。正如本文描述的，这些组合物和方法可以用于增加BAT细胞数量和/或功能和/或提高BAT WAT细胞的比率，从而治疗受试对象的肥胖症和肥胖相关的疾病和病症。本文描述的一些方法包括移植BMP处理的ka-Ι+祖细胞，所述祖细胞已用能够提 高BMP信号传导的试剂处理过。一般来说，所述方法包括用足够提高BMP信号传导的量的化 合物处理(例如与之进行接触)祖细胞，例如ka-Ι+祖细胞群，然后将BMP活化的ka-1+ 细胞(例如至少一个细胞或一群这类细胞)移植给受试对象。合适的试剂可以包括BMPs 本身(例如重组蛋白或编码BMP的核酸)和/或能够提高BMP信号传导的试剂，例如小分 子、抗体和抗体片段、药剂和其他生物试剂。在一些实施方案中，处理细胞包括将细胞体外 基因工程化从而表达BMP 2、-4、-5、-6和/或-7多肽。然后将细胞给予受试对象。这类 基因工程化的ka-Ι+祖细胞群也包含在本发明范围内。其他化合物在文中有描述。细胞类型适合用在本文描述的方法中的细胞包括干细胞抗原-1阳性(Sca-Ι+)祖细胞，例 如哺乳动物ka-Ι+祖细胞。Sca-I是18_kDa的糖基化磷脂酰肌醇锚定的表面蛋白，该蛋白 可作为造血干细胞和存在于组织中的祖细胞的干细胞标记物。可用于本公开的ka-Ι+祖 细胞可以从多种组织和器官中分离，包括但不限于例如骨骼肌、前列腺、真皮、心血管系统、 乳腺、肝、新生儿皮肤、颅盖(calvaria)、骨髓、小肠和脂肪组织(例如脂肪组织沉积)。在 一些实施方案中，Sca-I+细胞分离自骨骼肌，例如骨骼肌肌束。在一些实施方案中，Sca-I+ 细胞分离自脂肪组织，例如脂肪蓄积。ka-Ι+祖细胞可以是单能性的、多能性的和全能性的，并且可以来源于间充质。在 一些实施方案中，ka-Ι+祖细胞是非肌原性的祖细胞。在一些实施方案中，ka-Ι+祖细胞 可以是人工来源于(例如分化或部分分化)非多能细胞的多能干细胞。这类细胞在本领 域被称为诱导多能干细胞，通常缩写为iPS或iPSCs (综述可参见例如Nishikawa et al.， Mol. Cell. Biol.，9 :725-729, 2008)。ka-1+祖细胞通过确定一或多种细胞表面表达标记物的存在与否来鉴定。可 以用于鉴定ka-Ι+祖细胞的示范性细胞表面标记物包括，但不限于ka-1、CD45、Mac-U CM9 (整联蛋白 β 1)、CD105(内皮糖蛋白(Endoglin))、CD166 (ALCAM)、结蛋白(desmin)、 波形蛋白(vimentin)和 c_kit。在一些实施方案中，可以通过检测Sca-I来鉴定阳性细胞。替代地或者 此外，可以通过检测其他细胞表面标记物来鉴定ka-Ι+祖细胞。在一些实施方案中，可 以用于本文描述的方法的ka-Ι+祖细胞是细胞表面标记物CD45和/或Mac-I阴性的，例 如细胞可以是 ka-l+/CD45_、Sca-1+/Mac-1 或 ka-l+/Cd45-/Mac_l-。在一些实施方案 中，ka-Ι+祖细胞可以是ka_l+/CD29+细胞。在一些实施方案中，祖细胞可以是 ka-l+/Q^9+/Cd45-/Mac-l-细胞。在一些实施方案中，祖细胞可以是带有以下细 胞表面标记物⑶四+、CD;34+、Cd45-、Mac-I-和CD117-中的一或多种的细胞。在一些实施方案中，鉴定到ka-Ι+祖细胞之后，可以鉴定ka-Ι+祖细胞表面上 的其他细胞表面标记物，从而例如进一步表征和/或确认细胞系的身份。例如，可以评价 Sca-I+细胞来确定其他标记物的细胞表面表达，所述标记物包括但不限于例如CM9 (整联 蛋白β 1)、CD105(内皮糖蛋白)、⑶166 (ALCAM)、结蛋白、波形蛋白、⑶34，⑶133和c-kit。一旦鉴定出某细胞群具有指定的细胞表面标记物(例如，Sca-Ι)，用于这类细胞 群的鉴定、分离和富集的方法是本领域常规和已知的。这些方法包括例如，免疫磁性细胞分选、荧光激活细胞分选(FACS)、附着到组织培养板和瓶上，或者在利用所需干细胞生长的条 件下进行培养，以及这些方法的组合。利用这些方法，可以分离、纯化和/或富集ka-Ι+祖 细胞或ka-Ι+细胞群，例如这样的ka-Ι+祖细胞群，其中至少60%，例如70%、80%、90% 或更多的细胞是细胞。在一些实施方案中，可以不经过细胞的鉴定、分离和/或富集获得ka-Ι+细胞。例 如^^-1+细胞可以从细胞保藏机构获得，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。在一些实施方案中，可以利用标准细胞培养技术对分离的^^-1+细胞、克隆或细 胞群进行培养从而获得更大量的所述细胞。在一些实施方案中，Sca-I+细胞可以保存在液氮中。为细胞保存在液氮中做准备 的技术以及在液氮中保存这些细胞的方法在本领域是常规已知的。名词“原代细胞”包括从哺乳动物组织来源分离的细胞悬浮液中存在的细胞(在 它们被培养，即附着到诸如平板或培养瓶的组织培养基质之前)、来源于组织的外植体中存 在的细胞，包括第一次培养的细胞类型和来源于这些培养细胞的细胞。名词“次级细胞”或 “细胞株”是指所有随后的培养步骤中的细胞。次代细胞是由已被传代一或多次的次代细胞 构成的细胞株。原代和次代干细胞可以从多种组织获得，包括可以在培养物中保持和繁殖的细胞 类型。优选从被给予BMP处理细胞的受试对象或动物中获取原代细胞。但也可以由供体 (例如，不是受体的受试对象，通常是相同物种，优选免疫相容的受试对象)获取原代细胞。 获得和培养这些细胞的方法是本领域已知的。所述方法可以包括允许^^-1+祖细胞进行足够轮的倍增，例如产生所需大小的 克隆细胞株或者异质细胞株，例如细胞株达到足够数量以便给受试对象提供治疗效果，或 者足够数量从而在BMP活化之前或之后建立稳定的细胞系。细胞没有转染而是用BMP处理 时，可以在没有BMP的情况下将细胞培养一段时间，然后在移植到受试对象之前，在有BMP 的情况下培养一段时间(例如，1、2、3或更多天)。细胞可以在移植前进行清洗(例如在等 渗PBS中)以便在移植前除去所有污染物，包括BMP或生长培养基成分。所需细胞数量不 同，取决于多种因素，包括但不限于转染细胞的用途、外源DNA在转染细胞中的功能水平、 转染细胞的植入部位(例如，可以使用的细胞数量受到植入解剖部位的限制)以及受试对 象的年龄、表面积和临床状况。在一些实施方案中，BMP处理干细胞群包括至少107、108、109 或更多细胞。BMP处理的ka-Ι+细胞是具有增强的BMP信号传导(例如BMP-2、_4、-5,-6和/ 或-7)水平的ka-Ι+细胞，其中BMP信号传导水平通过直接的人类干预被提高。可以通过 本领域已知的或者本文描述的任何方法增强细胞内的BMP信号传导，例如通过用能够增强 BMP信号传导的化合物，例如BMP多肽或核酸来处理细胞。通过本文描述的方法活化的干 细胞群也包含在本发明范围中。任选地，BMP处理细胞群可以悬浮在可药用载体中，例如用 于保存或移植。“可药用载体”这样的说法用在本文意图包括与用药和细胞活性相容的任意 和所有溶剂、培养基/介质、抗菌和抗真菌试剂、等渗剂等。一般来说，细胞被维持在无菌状 态。给药物活性物质使用这类培养基和试剂是已知的。除非某种常规培养基或试剂与活性 化合物不相容的情况，这类培养基都可以用于本发明的组合物中。补充性活性化合物也可以合并到组合物中。所述细胞可以是自体的、同种异体的(allogeneic)或者异种的(xenogeneic)。在 一些实施方案中，本文描述的方法可以包括从受试对象中获得干细胞群，任选对干细胞进 行培养和/或富集以获得纯化的干细胞群，如本文所述用能够增强BMP信号传导的试剂处 理细胞将细胞活化，以及将细胞移植到分离它们的同一受试对象中。在一些实施方案中，细 胞是同种异体的或者异种的；如果必要，可以提供免疫抑制来防止细胞排斥。在一些实施方案中，用于本文描述的方法和组合物的ka-Ι+祖细胞表达一或多 种BMP受体，例如I型或II型BMP受体。骨形态发生蛋白(BMP)在一些实施方案中，能够增强BMP信号传导的化合物是全长或截短的BMPs (例如 BMPs，多肽和肽)。BMP是转化生长因子超家族的成员，它们参与胚胎发育以及整个生命的多个关 M Ρ M (Kishigami and Mishina, Cytokine. Growth Factor. Rev. 16 :265-278(2005)； Chen et al. , Growth Factors. 22 :233-241 (2004) ；Yamamotoand Oelgeschlager, Naturwissenschaften 91 =519-534 (2004)) 已有报道显示BMPs在脂肪细胞发育的两个不 同阶段发挥作用。首先，BMP-2和4刺激多能间充质细胞和骨髓基质细胞在合适的条件下 分化为脂肪细胞(Butterwith et al. ,Biochem. Soc Trans 24 163S (1996) ；Chen et al.， J. Cell.Biol. 142 :295-305(1998) ；Chen et al. , J Cell Biochem. 82 187-199(2001)； Tang et al. , Proc Natl. Acad Sci U S. A. 101 :9607-9611 (2004))。此外，BMPs 还刺激 已定型的白色前脂肪细胞的分化(Sottile and Seuwen, FEBS Lett. 475 :201-204(2000)； Rebbapragada et al.，Mol. Cell. Biol. 23 :7230-7242 (2003))。但是其他研究显示，BMP-2 借助同源框基因Msx2在多能间充质祖细胞中抑制脂肪形成分化并促进骨发生(Ichida et al. ， J. Biol. Chem. 279 :34015-34022 (2004) ；S. L. Cheng et al. ， J. Biol. Chem. 278 45969-45977(2003))。BMPs结合特异I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体复合体_RIa、Rib和RII，这 些复合体通过SMAD蛋白或p38有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)进行信号传导。BMI3s是组 织发育和形态发生许多方面中关键事件(包括胚胎发生过程中的骨形成、出生后生长、骨 骼的重构和再生的过程)的重要调节物。在人和小鼠组织中进行的定位研究显示在脂肪、 心、肺、小肠、肢芽和牙齿中有各种BMPs的高水平mRNA表达和蛋白合成。BMPs曾被用于临床治疗骨和软骨病症或损伤。Einhorn，J. Bone and Joint Surgery 85A :82-88(2003)和 Sandhu，Spine 28(15) :S64_73 (2003)中讨论了重组 BMP 的 有效临床应用。BMP多肽(例如成熟BMP多肽)自身是可行的治疗性化合物，因为BMI^s是 小的分泌蛋白，能够进入其靶细胞并在其中发挥活性。虽然本文描述的是人蛋白，本领域 技术人员可以理解当处理细胞的预期接受者是另一物种时，可以使用来自该物种，例如牛、 猪、绵羊或山羊的同源蛋白。这些同源蛋白可以利用本领域已知的方法来鉴定，例如检索现 有数据库(例如Homologene数据库)寻找目标物种中鉴定到的同源物。正如本文描述的，BMP-2、-4、_5、_6和_7参与褐色脂肪细胞分化，用 BMP-2、-4、-5、-6和/或-7处理祖细胞促进褐色脂肪组织形成。因此 BMP-2、-4、-5、-6和/或-7是诸如肥胖症及相关病症(比如糖尿病、胰岛素抗性、高血糖症、高脂血症和高胆固醇血症)的脂肪组织相关病症的治疗、诊断和药物开发的针对目标。 总的来说，本文描述的方法包括将文中描述的BMP处理的ka-Ι+细胞群移植给受试对象。适合用于本文描述的方法的BMP包括BMP-2BMP-2的长度为396个氨基酸，位于人的染色体20pl2。Wozney et al.，Science 242(4885) :1528-1534(1988)中公开了人BMP-2的核苷酸和氨基酸序列。BMP2属于转化生 长因子-β (TGFi3)超家族。骨形态发生蛋白诱导骨形成，BMP2是常染色体显性遗传病-进 行性肌肉骨化症(肌炎)的可能基因。骨形态发生蛋白2通过前肌原形成细胞中剂量依赖 性PAX3表达来调节肌细胞生成，并通过S0X9在SHM调控下在中胚层表达。人BMP-2如下所示。氨基酸38-268是TGF β前肽结构域，291-396是TGF β家族N 末端结构域。氨基酸沘3-396 是成熟肽。Wozney et al.，Science 242 :1528-1534(1988) 中提供了序列。1 MVAGTRCLLA LLLPQVLLGG AAGLVPELGR RKFAAASSGR PSSQPSDEVL SEFELRLLSM61 FGLKQRPTPS RDAWPPYML DLYRRHSGQP GSPAPDHRLE RAASRANTVR SFHHEESLEE121 LPETSGKTTR RFFFNLSSIP TEEFITSAEL QVFREQMQDA LGNNSSFHHR INIYEIIKPA181 TANSKFPVTR LLDTRLVNQN ASRffESFDVT PAVMRffTAQG HANHGFVVEV AHLEEKQGVS241 KRHVRISRSL HQDEHSffSQI RPLLVTFGHD GKGHPLHKRE KRQAKHKQRK RLKSSCKRHP301 LYVDFSDVGff NDffIVAPPGY HAFYCHGECP FPLADHLNST NHAIVQTLVN SVNSKIPKAC361 CVPTELSAIS MLYLDENEKV VLKNYQDMVV EGCGCR (SEQID NO 1)BMP-2的成熟形式每个多肽链中含有四个可能的N连接糖基化位点，和四个可能 的二硫键。参见 UniProt entry No. P12643 ;HomoloGene :926。BMP-4BMP-4诱导软骨和骨的形成，对中胚层诱导、牙齿发育、肢体形成和骨折修复非常 重要。BMP-4前蛋白原的序列如下所示。氨基酸41-276是TGFii前肽结构域，302-408 是TGF β家族N末端结构域。氨基酸四3_408是成熟肽。Wozney et al.，Science 242 1528-1534(1988)中提供了序列。1 MIPGNRMLMV VLLCQVLLGG ASHASLIPET GKKKVAEIQG HAGGRRSGQS HELLRDFEAT61 LLQMFGLRRR PQPSKSAVIP DYMRDLYRLQ SGEEEEEQIH STGLEYPERP ASRANTVRSF121 HHEEHLENIP GTSENSAFRF LFNLSSIPEN EAISSAELRL FREQVDQGPD WERGFHRINI181 YEVMKPPAEV VPGHLITRLL DTRLVHHNVT RffETFDVSPA VLRffTREKQP NYGLAIEVTH241 LHQTRTHQGQ HVRISRSLPQ GSGNWAQLRP LLVTFGHDGR GHALTRRRRA KRSPKHHSQR301 ARKKNKNCRR HSLYVDFSDV GffNDffIVAPP GYQAFYCHGD CPFPLADHLN STNHAIVQTL361 VNSVNSSIPK ACCVPTELSA ISMLYLDEYD KVVLKNYQEM VVEGCGCR(SEQ ID NO 2)BMP-4的成熟形式在每个多肽链中含有四个可能的N连接糖基化位点。存在V152
#HUniProtAccession No. P12644 ;HomoloGene :7247。BMP-5BMP-5前蛋白原是如下所示具有4 个氨基酸的蛋白质。BMP-5诱导软骨和骨形 成。Celeste et al.，Proc. Natl. Acad. ki. U. S. Α.，87，9843-9847，1990 中提供了它的序 列。
1MHLTVFLLKGIVGFLffSCffVLVGYAKGGLGDNHVHSSFIYRRLRNHERREIQREILSILG
61LPHRPRPFSPGKQASSAPLFMLDLYNAMTNEENPEESEYSVRASLAEETRGARKGYPASP
121NGYPRRIQLSRTTPLTTQSPPLASLHDTNFLNDADMVMSFVNLVERDKDFSHQRRHYKEF
181RFDLTQIPHGEAVTAAEFRIYKDRSNNRFENETIKISIYQIIKEYTNRDADLFLLDTRKA
241QALDVGffLVFDITVTSNHWVINPQNNLGLQLCAETGDGRSINVKSAGLVGRQGPQSKQPF
301MVAFFKASEVLLRSVRAANKRKNQNRNKSSSHQDSSRMSSVGDYNTSEQKQACKKHELYV
361SFRDLGffQDffIIAPEGYAAFYCDGECSFPLNAHMNATNHAIVQTLVHLMFPDHVPKPCCA
421PTKLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRSCGCH(SEQ ID NO 3)
成熟BMP-5蛋白被认为是SEQID NO 3中的氨基酸323-454，每个多肽链含有四
个可能的N连接糖基化位点和四个可能的二硫键。参见UniProtAccession Nos. P22003 ； Q9H547 或 Q9NTM5 ；HomoloGene :22412。BMP-6BMP-6是软骨细胞分化的自分泌刺激物，参与胚胎神经和泌尿系统的发育，以及 肝和角化细胞的分化。BMP-6敲除小鼠能够存活，在胸骨的骨化方面略有延迟。BMP-6(前 体)是57kD的蛋白，长513个氨基酸，位于人染色体6pM。美国专利5，187，076中公开了 人BMP-6的核苷酸和氨基酸序列。预测BMP-6是被合成为前体分子，然后切割产生132个 氨基酸的成熟多肽，其计算分子量大约15Kd。成熟形式的BMP-6每个多肽链含有三个可能 的N连接糖基化位点。活性BMP-6蛋白分子可能是二聚体。将BMP-6加工为成熟形式包括 二聚体化和去除N末端区，其方式与相关蛋白TGFii的加工过程(Gentry et al. , Molec. Cell. Biol. 8 :4162(1988) ；Dernyck et al. ,Nature 316 :701(1985))类似。人 BMP-6 前体 如下所示。成熟多肽被认为包括SEQ ID NO :4中的氨基酸374-513。其他活性BMP-6多肽
包括含有SEQ ID NO 4中氨基酸382-513、388_-513和412-513的多肽。
MPGLGRRAQffLCffffffGLLCSCCGPPPLRPPLPAAAAAAAGGQLL⑶GGSPGRTEQPPPSP61
QSSSGFLYRRLKTQEKREMQKEILSVLGLPHRPRPLHGLQQPQPPALRQQEEQQQQQQLP121
RGEPPPGRLKSAPLFMLDLYNALSADNDEDGASEGERQQSWPHEMSSSQRRQPPPGAAH181
PLNRKSLLAPGSGSGGASPLTSAQDSAFLNDADMVMSFVNLVEYDKEFSPRQRHHKEFKF241
NLSQIPEGEVVTAAEFRIYKDCVMGSFKNQTFLISIYQVLQEHQHRDSDLFLLDTRVVffA301
SEEGffLEFDITATSNLffVVTPQHNMGLQLSVVTRDGVHVHPRAAGLVGRDGPYDKQPFMV361
AFFKVSEVHVRTTRSASSRRRQQSRNRSTQSQDVARVSSASDYNSSELKTACRKHELYVS421
FQDLGffQDffIIAPKGYAANYCDGECSFPLNAHMNATNHAIVQTLVHLMNPEYVPKPCCAP481
TKLNAISVLYFDDNSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQID NO 4) 人 BMP-6 启动子已被表征(参见 Tamada et al.，Biochim Biophys Acta. 1998， 1395(3) :247-51)，可以用在本文描述的方法中。参见 UniProt Accession No. P22004 ； HomoloGene 1300.BMP-6 的给药、反义治疗和定量在 Boden et al. (Endocrinology Vol. 138， No. 72820-2828)中有描述。BMP-7BMP-7同样属于TGFii超家族。它诱导软骨和骨形成，并且可能是造成上皮成骨这 一现象的骨生成诱导因子。BMP-7在钙调节和骨骼稳态，以及成人肠组织的抗炎反应中发挥作用。BMP-7的序列如下所示1 MHVRSLRAAA PHSFVALffAP LFLLRSALAD FSLDNEVHSS FIHRRLRSQE RREMQREILS61 ILGLPHRPRP HLQGKHNSAP MFMLDLYNAM AVEEGGGPGG QGFSYPYKAV FSTQGPPLAS121 LQDSHFLTDA DMVMSFVNLV EHDKEFFHPR YHHREFRFDL SKIPEGEAVT AAEFRIYKDY181 IRERFDNETF RISVYQVLQE HLGRESDLFL LDSRTLffASE EGffLVFDITA TSNHWVVNPR241 HNLGLQLSVE TLDGQSINPK LAGLIGRHGP QNKQPFMVAF FKATEVHFRS IRSTGSKQRS301 QNRSKTPKNQ EALRMANVAE NSSSDQRQAC KKHELYVSFR DLGffQDffIIA PEGYAAYYCE361 GECAFPLNSY MNATNHAIVQ TLVHFINPET VPKPCCAPTQ LNAISVLYFD DSSNVILKKY421 RNMVVRACGC H(SEQ ID NO 5)氨基酸1- 是潜在的信号序列；30-431是前肽原，293-431是成熟蛋白。成熟形 式的BMP-7每个多肽链含有四个可能的N-连接糖基化位点，和四个可能的二硫键。参见 UniProtAccession No. P18075 ；HomoIoGene :20410。本文描述的组合物和方法也考虑到与以上显示的BMP序列有至少50% (例如至 少60%、70%、80%、90%、95%、98%和99% )相同度的氨基酸序列的使用。用在文中，这 些序列也被称为BMP。为了确定两条序列的相同度百分比，将序列为了最佳比较而做对位排列(根据最 佳比对的需要，在第一和第二氨基酸或核苷酸序列中引入空位，并且为了进行比较，可以不 考虑非同源序列)。为了比较，对位排列的参照序列长度是至少80% (在一些实施方案中， 是参照序列长度的大约85^^90^^95%或100% )。然后对相应位点上的核苷酸或残基进 行比较。当占据第一序列中某位点的核苷酸或残基与第二序列的相应位点相同时，则分子 在该位点是相同的。考虑为了两个序列的最佳比对所引入的空位的数量以及每个空位的长 度，两个序列间的相同度百分比是序列共有的相同位点的数量的函数。对序列进行比较以及确定两个序列的相同度百分比可以利用数学算法来实现。例 如,可以利用被并入GCG软件包中GAP程序的Needleman和Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48 444-453)算法来确定两个氨基酸序列之间的相同度百分比，其中使用空位罚分为12、空位 延伸罚分为4和读框移动空位罚分为5的Blossum 62评分矩阵。Biffs可以利用重组技术或化学合成来产生。产生这类多肽的方法以及纯化这类多 肽所需的方法都是本领域已知的,参见例如Sambrook and Russel, Molecular CloninR ;A laboratory Mannual(CSHL Press,3rtd Edition,2001)。可以对BMP进行修饰从而改变该蛋白的药物代谢动力学特性。例如，所述修饰可 以导致更长的循环系统半寿期、更高的细胞摄入、向靶组织的分布改善、清除减少和/或免 疫原性下降。可以用于优化BMP的治疗活性的多种措施是本领域已知的，包括化学修饰。表达系统可以将BMI3S表达为重组蛋白。对于重组蛋白，表达系统的选择会影响到其药物动 力学特性。表达系统之间在翻译后加工上的差异会产生不同分子大小和电荷的重组蛋白， 而这又会影响到例如循环系统半寿期、清除率和免疫原性。蛋白质的药物动力学特性可以 通过适当地选择表达系统(比如选择细菌、病毒或哺乳动物表达系统)使之优化。可以用 做治疗性蛋白的表达系统的示范性哺乳动物细胞系有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴C0S-1 细胞系和CV-I细胞系。
本发明的重组表达载体可以设计成便于在原核或真核细胞中表达BMP。例如，可 以在大肠杆菌、昆虫细胞(例如，利用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表 达本发明的蛋白。合适的宿主细胞在Goeddel,Gene Exrression Technology :Methods in Enzymology, 185, (Academic Press, San Diego, CA 1990)中有更多讨论。替代地,重组表 达载体可以利用例如T7启动子调控序列和T7聚合酶在体外转录和翻译。化学修饰可以通过化学方式将BMPs改变从而在保持活性的情况下，改善其药物动力学特 性。蛋白可以被共价连接上多种部分，改变蛋白的分子大小和电荷，从而使药物动力学特 征也被改变。所述部分优选无毒并且生物相容。在一个实施方案中，可以给蛋白共价附 着上聚乙二醇(PEG)(聚乙二醇化)。有多种PEG分子是已知的和/或可以购买的(参 见例如Sigma-Aldrich产品目录)。聚乙二醇化可以提高蛋白的稳定性，通过表位的空 间掩盖降低免疫原性，以及通过减少肾小球滤过而提高半寿期(参见例如Harris and Zalipsky, Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, ACS Symposium Series,No. 680,American Chemical Society (1997) ；Harris et al·,Clinical Pharmacokinetics, 40 485-563，2001)。以PEG构建体的方式给药的治疗性蛋白实例包 括 Adagen (PEG-ADA)和 Oncospar (Pegylated asparaginase)。另一个实施方案中， 蛋白可以借助氨基基团类似地连接上氧化葡聚糖(参见Sieffield，Curr. Drug Targets Cardiovas.Haemat.Dis.，1 :1-22，2001)。再一个实施方案中，精氨酸寡聚物与环孢霉素A 的接合可以促进局部递送(Rothbard et al.，Nat. Med.，旦1253-1257，2000)。此外，蛋白可以化学连接另一个蛋白，例如与载体蛋白交联(例如经由双功能交 联剂)形成分子量更大的复合物，则具有更长的循环系统半寿期和更高的细胞摄入。在一 些实施方案中，载体蛋白可以是血清蛋白，比如白蛋白。另一个实施方案中，治疗性蛋白可 以借助例如异基双功能或同基双功能交联剂自身交联形成同型二聚体、三聚体或更高的多 聚体(参见 Mykowski et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 :1184-1188,1998) 通过二 聚体化或三聚体化提高治疗性蛋白的分子量和大小可以减少蛋白被清除。蛋白制剂也可以对蛋白制剂进行优化。例如，可以将Biffs配制在载体系统中。载体可以是 胶体系统。胶体系统可以是脂质体这种磷脂双层介质。在一个实施方案中，在保持蛋白完 整性的情况下，治疗性蛋白被包裹在脂质体中。本领域技术人员明白，有许多方法可以制备 月旨质体(参见 Lichtenberg et al. ，Methods Biochem. Anal. ,33 :337-462,1988 ；Anselem et al. , Liposome Technology, CRC Press (1993))。脂质体制剂可以延迟蛋白被清除并提 高其细胞摄入(参见 Reddy，Ann. Pharmacother. ,34 :915-923, 2000)。载体也可以是聚合物，例如生物可降解、生物相容的聚合物基质。在一个实施方 案中，治疗性蛋白可以在保持蛋白完整性的同时包埋在聚合物基质中。所述聚合物可以是 天然的，比如多肽、蛋白或多糖；或者是合成的，比如多聚(α-羟基)酸。实例包括由例 如胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、醋酸纤维素、硝酸纤维素、多糖、纤维蛋白、明胶以及它们 的组合制成的载体。在一个实施方案中，聚合物是聚乳酸(PLA)或聚乳酸/聚乙醇酸共聚 物(PGLA)。聚合物基质可以制备和分离成各种形式和大小，包括微球和纳米球。聚合物制 剂可以使治疗效果持续更长时间(参见Reddy，Ann. Pharmacother. ,M :915-923,2000)。人生长激素(hGH)的聚合物制剂已被用于临床试验(参见Kozarich and Rich, Chemical Biology,2 :548-552,1998)。PCT 公开文本 WO 99/15154 (Tracy et al.)、美国专利 5，674，534 和 5，716，644 (both to Zale et al.)、PCT 公开 WO 96/40073 (Zale et al.)和 PCT 公开 WO 00/38651 (Shah et al.)中描述了聚合物微球缓释制剂的实例。美国专利5，674，534和 5，716，644以及PCT公开WO 96/40073描述了含有促红细胞生成素颗粒的聚合物基质，其中
用盐使颗粒抗聚集而稳定。在一些实施方案中，融合蛋白包含细胞穿膜肽序列来协助BMP进入细胞，所述肽包 括例如HIV来源的TAT肽、穿膜肽(penetratins)、transportans或hCT来源的细胞穿膜肽， 参见例如 Caron et al.，Mol Ther. 3 :310-8,2001 ；Langel, Cell-Penetrating Peptides Processes and Applications(CRC Press,Boca Raton FL 2002) ；El-Andaloussi et al., Curr. Pharm. Des.，U :3597-611,2005 以及 Deshayes et al. , Cell. Mol. Life Sci. ,62 1839-49,2005。肽模拟物在一些实施方案中，BMP蛋白是肽模拟物(例如肽或非肽的肽模拟物)。合 成能够模拟肽序列的非肽化合物是本领域已知技术。这类肽模拟物包括可以根据本领 域已知方法进行修饰产生拟肽类(ρ印tidomimetics)的BMPs。参见例如Kazmierski， W. Μ. , ed. , Peptidomimetics Protocols, HumanPress(Totowa NJ 1998) ；Goodman et al. ， eds. ， Houben-ffeyl Methods of OrRanic Chemistry:Synthesis of Peptides and Peptidomimetics, Thiele Verlag (New York 2003)；以及 Mayo et al. , J. Biol. Chem., 278 :45746, 2003。在一些情况中，本文公开的肽和片段的这些经过修饰的拟肽类形式相对 非拟肽类肽，表现出更高的体内稳定性。制备拟肽类的方法包括用D-氨基酸对映体取代肽 序列中的一或多个，例如全部氨基酸。这种序列在文中称为“反构型(retro)”序列。另一 个方法中，氨基酸残基的N末端到C末端顺序被反过来，因此原始肽从N端到C端的氨基酸 残基顺序变成了被修饰拟肽类中C端到N端的氨基酸残基顺序。这种序列可以称为“反排 列(inverso)”序列。拟肽类可以是反构型，也可以是反排列形式，即文中公开的肽的“反构 型-反排列(retro-inverso)”形式。新的拟肽类可以由D-氨基酸构成，其排列使得拟肽 类从N端到C端的氨基酸残基顺序对应原始肽中C端到N端的氨基酸残基顺序。制备拟肽类的其他方法包括将肽的一或多个氨基酸残基替换为化学属性不同但 公认的氨基酸功能类似物，即人工氨基酸类似物。人工氨基酸类似物包括氨基酸、 β-取代的β-氨基酸(“β 3_氨基酸”)、氨基酸的含磷类似物(比如V-氨基膦酸和V -氨基三亚甲基膦酸)，以及含有非肽连接的氨基酸。人工氨基酸可以用于制成拟肽类，比 如类肽寡聚物(例如类肽酰胺或酯类似物)、β -肽、环肽、寡聚脲或寡聚氨基甲酸酯肽，或 者杂环分子。这些序列可以通过例如氨基端的生物素化和羧基端的酰胺化被修饰。本文描述的任何肽，包括文中描述的变体形式还可以包含异源多肽。所述异源多 肽可以是能够提高其所附着的(例如象在融合蛋白中那样融合)肽的循环半寿期的多肽。 异源多肽可以是白蛋白(例如人血清白蛋白或其部分)或者免疫球蛋白的一部分(例如 IgG的Fc区域)。异源多肽可以是能够穿过线粒体的部分。本公开还考虑了合成性的模拟化合物。正如本领域已知的，可以通过与诸如二环己基碳二亚胺(DCC)的偶联剂反应，将氨基基团连接到已被活化的羧基基团上合成肽。游 离氨基基团对活化羧基的攻击导致形成肽键并释放二环己脲。可能有必要保护氨基和羧基 基团之外的可能发生反应的活性基团。例如，可以用叔丁氧羰基基团阻断含有活化羧基基 团的成分的α-氨基基团，通过将肽与稀释酸接触可以随后将这个保护基团去除，留下完 整的肽键。利用这种方法，通过将氨基酸依次加到连接在不溶性基质(比如聚苯乙烯珠)上 不断生长的肽链上，经固相法可以容易地合成肽。首先将所需肽序列的羧基端氨基酸(带 有氨基保护基团)锚定到聚苯乙烯珠子上。然后除去氨基酸的保护基团。下一个氨基酸 (带有保护基团)利用偶联剂添加上。之后是清洗循环。可以按照需要重复该循环。在一些实施方案中，本公开所述模拟物是与本文描述的BMP蛋白具有序列同源性 的肽。这些模拟物包括，但不限于其中L-氨基酸被它们的D-异构体替代的肽。一种常 见的评估序列同源性，更重要的是评估统计学显著性类似度的方法学是通过利用Lipman 和Pearson写的算法的Monte Carlo分析获得Z值。根据该分析，Z值大于6表明可能的 显著性，Z值大于10被认为是统计学显著性的(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA),85 :2444-2448,1988 ；Lipman and Pearson, Science,227 :1435-1441,1985)。 更概括地说，可以利用任何已知方法来合成本文描述的BMPs和以上描述的模拟物，包括 Merrifield et al. ,Biochemistry,21 :5020-5031,1982 ；Houghten ffellings,Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) ,82 :5131-5135,1985 ；Atherton, Methods in Enzymology,289 :44-66, 1997 或者 Guy and Fields, Methods in Enzymology, 289 :67-83,1997 中描沭的莶包 (tea-bag)方法学或者固相肽合成程序，或者利用商品自动合成仪。目标肽在一些实施方案中，可以将BMPs和/或BMP激动剂在体外和/或体内导靶至 ka-Ι+细胞。将化合物导靶到特定细胞类型和组织的方法是本领域已知的。例如将肽和其 他治疗剂导靶到特定细胞或组织的组合物和方法包括利用可以寻靶预期目标细胞或组织 上独特或特异的抗原或标记物的物质，例如包括但不限于抗体或抗体的抗原结合片段，以 及短的亲和肽。在一些实施方案中，这类物质可以是ka-Ι和/或⑶四特异的。作为一个实例，可以利用连接BMP或BMP激动剂以及连接寻靶部分(例如 抗-Sca-I抗体或其抗原结合片段)的纳米颗粒。BMP和寻靶部分可以位于相同或不同的纳 米颗粒上。在一些实施方案中，组合物包含BMP和分开的寻靶部分，例如与ka-Ι寻靶部分 连接的纳米颗粒。本领域已知多种生物相容纳米颗粒，例如有机或无机纳米颗粒。脂质体、树状大分 子、碳纳米材料和聚合物胶束是有机纳米颗粒的例子。也可以使用量子点。无机纳米颗粒 包括金属纳米颗粒，例如Au、Ni、Pt和TW2纳米颗粒。也可以使用磁性纳米颗粒，例如!^2+ 和/或!^3+核心被葡聚糖或PEG分子包围的10-20nm球形纳米晶体。在一些实施方案中， 使用了胶体金纳米颗粒，例如象 Qian et al. , Nat. Biotechnol. 26(1) =83-90(2008)；美国 专利7060121、7232474以及美国专利申请公开2008/0166706中描述的。合适的纳米颗粒 以及构建和使用多功能纳米颗粒的方法在例如Sanvicens and Marco, Trends Biotech., 26(8) :425-433(2008)中有讨论。在所有实施方案中，纳米颗粒借助功能基团附着(连接)在BMP和本文描述的寻 靶部分上。一些实施方案中，纳米颗粒与包含功能基团的聚合物关联，并且用于防止金属氧化物各自分散开来。所述聚合物可以是合成聚合物，比如但不限于聚乙二醇或硅烷 ’天然聚 合物；或者是合成聚合物或天然聚合物的衍生物；或者它们的组合。有用的聚合物是亲水 性的。在一些实施方案中，聚合物“包衣”不是包围磁性金属氧化物的连续膜，而是附着和 围绕在金属氧化物的延伸聚合物链的“筛网”或者“云层”。聚合物可以包含多糖及其衍生 物，包括葡聚糖、pullanan、羧基葡聚糖、羧甲基葡聚糖和/或还原羧甲基葡聚糖。金属氧化 物可以是相互接触的或者各自被聚合物包裹或围绕的一或多个晶体集合。其他实施方案中，纳米颗粒与非聚合物功能基团成分关联。合成不带有相关聚合 物的稳定、功能化的纳米颗粒的方法是已知的，也涵盖在本发明的范围内。这类方法在例如 Halbreich et al. , Biochimie, 80 (5-6) :379_90，1998 中有描述。在一些实施方案中，纳米颗粒整体大小以直径计算低于约Ι-lOOnm，例如约 25-75nm，例如约40-60nm，或约50-60nm。一些实施方案中的聚合物成分可以是包衣的形 式，例如厚约5到20nm或更多。纳米颗粒的整体大小大约15到200nm，例如约20到lOOnm， 约40到60nm ；或约60nm。抗体在一些实施方案中，可以利用抗体将BMPs导靶到ka-Ι+细胞或包含细胞 的组织上，例如选择性地对细胞寻靶。在一些实施方案中，可以用例如能够提高细胞内一或多种BMP的表达和/或活性 的抗体替代BMP蛋白，或者与BMP蛋白结合使用。名词“抗体”用在文中是指全长、双链免疫球蛋白分子及其抗原结合部分和片段， 包括合成的变体。典型的全长抗体包含两个重(H)链可变区(文中缩写为VH)，和两个轻 (L)链可变区(文中缩写为VL)。名词抗体的“抗原结合片段”用于本文是指全长抗体中保 持与目标特异结合的能力的一或多个片段。抗原结合片段的实例包括，但不限于(i)Fab 片段，由VL、VH、CL和CHl结构域片段构成的单价片段；(ii)F(ab‘ )2片段，由两个通过二硫 键在铰链区连接的Fab片段构成的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CHl结构域构成；(iv) Fv片段，由抗体一个臂的VL和VH结构域构成；(ν) dAb片段(Ward et al.，Nature 341 544-546(1989))，由VH结构域构成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片 段的两个结构域-VL和VH是由不同基因编码的，可以利用重组技术，通过合成连接肽将它 们连接起来，使它们被产生为一个蛋白链，其中VL和VH区联合形成单价分子(被称为单链 Fv(scFv)；参见例如 Bird et al. Science :423_426，1988 ；以及 Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883,1988)。这种单链抗体也涵盖在名词“抗原结合片段” 中。抗体和抗体片段的制备在本领域已有很好的记载。参见例如Harlow and Lane, 1988.Antibodies, A L aboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York :CoId Spring Harbor Laboratory。例如 Jones et al. ,Nature321 :522_525，1986，该文章公开了用小鼠 抗体的⑶R取代人抗体的⑶R。Marx, Science 229 =455-456,1985讨论了具有小鼠可变区 和人恒定区的嵌合抗体。Rodwell，Nature 342 :99-100,1989讨论了来源于抗体CDR信息 的较低分子量识别元件。Clackson，Br. J. Rheumatol. 3052 :36-39,1991讨论了基因工程化 的单克隆抗体，抗体包括Fv片段衍生物、单链抗体、融合蛋白嵌合抗体和人源化啮齿类动 物抗体。Reichman et al. ,Nature 332 :323-327,1988讨论了其上移植了大鼠高变区的人抗体。Verhoeyen, et al. ,Science 239 :1534-1536,1988教导了将小鼠的抗原结合位点移 植到人抗体上。小分子药物一些实施方案中，本发明提供了促进BMP蛋白表达或活性的药物(例如小分子药 物)。一些实施方案中，这类小分子药物可以利用本文描述的药物筛选方法来鉴定。在优选 实施方案中，本发明的小分子药物促进细胞中的BMP活性和/或表达。一些实施方案中，小 分子药物是利用以下描述的药物筛选方法鉴定的。在一些实施方案中，BMP激动剂是美国专利7，482，329中公开的分子或其拟肽。BMP 核酸ka-Ι+祖细胞源可以例如转染外源核酸，所述外源核酸包含异源核苷酸序列，例 如编码BMP-2、-4、-5、-6和/或-7或其激动剂，以及有或没有编码信号肽的核苷酸序列， 并在一段时间内瞬时或稳定地产生所编码的产物。异源氨基酸还可以是调控序列，例如启 动子，该调控序列导致内源BMP-2、-4、-5、-6和/或-7序列的表达，例如组成型或诱导型 表达或者上调它们的表达。可以通过例如美国专利5，641，670 (其内容通过引用并入本文) 中描述的同源重组将内源核酸序列导入原代或次代细胞。转染细胞还可以包含编码可选择 标记物的DNA，所述标记物赋予它们用于挑选的表现型，协助其鉴定和分离。在一些实施方案中，文中描述的可以增强BMP信号传导的化合物包括，例如BMP核 酸，例如BMP-2、-4、-5、-6和/或-7编码序列或其活性片段，以及任何下述序列启动子 序列，例如来自BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因或者另一个基因的启动子序列；增强子序 列，例如5'非翻译区(UTR)，例如来自BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因或另一个基因的 5' UTR, 3' UTR，例如来自BMP-2、-4、-5、-6和/或-7基因或另一个基因的3' UTR ；多腺 苷酸化位点；隔离子序列(insulator sequence)；或另一种能够提高ΒΜΡ_2、-4、-5、_6和/ 或-7的表达的序列。本文描述的核酸，例如编码如文中所述BMP-2、-4、-5、_6和/或_7多肽的核酸， 可以引入基因构建体。本文描述的方法可以利用这类表达载体在特定的细胞类型(例如干 细胞，例如多能间充质干细胞)中体外转染和表达本文描述的BMP-2、-4、-5、-6和/或-7 多肽。包含BMP核酸序列的表达构建体可以放在任何有效载体中给予，例如能够有效地将 带有的基因体内递送给细胞的任何制剂或组合物。措施包括将基因插入病毒载体，包括重 组逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、痘病毒、α病毒和单纯疱疹病毒-1，或者重组 细菌或真核细胞质粒。病毒载体可以直接转染细胞；质粒DNA的递送可以用裸DNA或者在 例如阳离子脂质体(Lipofectamine)或其衍生物(例如偶联了抗体)、多聚赖氨酸偶联物、 短杆菌肽S、人工病毒被膜或其他这类胞内载体的帮助下进行，也可以体内进行基因构建体 或CaP04沉淀的直接注射。在一些实施方案中，表达载体是含有一或多个BMP核酸序列(例如cDNA)的病毒 载体。用病毒载体感染细胞的优势是靶细胞中的一大部分可以接收到核酸。此外，病毒载 体中编码的分子，例如病毒载体中含有的cDNA所编码的分子可以在摄入病毒载体核酸的 细胞中有效地表达。逆转录载体和腺相关病毒载体可以作为体内转移外源基因，特别是转移到人体中 的重组基因递送系统。这些载体能够将基因有效地递送到细胞内，被转移的核酸稳定整合到宿主的染色体DNA中。只会产生复制缺陷型逆转录病毒的专门细胞(称为“包装细 胞”)的发展提高了逆转录病毒在基因治疗中的用途，缺陷型逆转录病毒用于为基因治疗目 的而进行的基因转移已有研究(在 Hu and Pathak, Pharmacol. Rev. 52 :493-511 (2000)； Young et al. , J. Pathol. 208 =229-318 (2006)中有综述)。复制缺陷型逆转录病毒可以 包装成毒粒，毒粒可以用于通过标准技术借助辅助病毒来转染靶细胞。产生重组逆转录病 毒和用这些病毒体外或体内转染细胞的试验方案可以在Ausubel，et al.，eds.，Current Protocols in Molecular RioIory, Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9. 10-9. 14和其他标准实验手册中找到。合适的逆转录病毒的例子包括本领域技术人员 已知的PLJ、pZIP、pffE和pEM。用于制备亲嗜性和兼嗜性逆转录病毒系统的合适包装病毒 系例子包括 WCrip、ΨCre, Ψ2、ΨΑπκ ρΑ12 和 ΡΑ317 (综述参见 Miller et. al, Hum. Gene Ther.l :5-14(1990))。逆转录病毒已被用于将多种基因体外和/或体内引入包括上皮细胞 的许多不同细胞类型(参见例如 Eglitis et al.，Science 230 1395-1398 (1985) ；Danos and Mulligan, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85 :6460-6464(1988) ；Wilson et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :3014-3018(1988) ；Armentano et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :6141-6145(1990) ；Miller et al.，Blood 76 :271-8(1990) ；Huber et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :8039-8043(1991) ；Ferry et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 8377-8381(1991) ；Chowdhury et al. S cience 254 1802~1805(1991) ；van Beusechem et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :7640-7644(1992) ；Kay et al. Human Gene Therapy 3 :641-647(1992) ；Dai et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10892-10895 (1992) ；Hwu et al. J. Immunol. 150 :4104-4115 (1993) ；Cavazzana-CaIvo et al. , Science 288 669-672(2000)；美国专利 4，868，116 ；美国专利 4，980，沘6 ；PCT 申请 WO 89/07136 ；PCT 申 it WO 89/02468 ；PCT 申请 WO 89/05345 ；以及 PCT 申请 WO 92/07573)。可用于本发明的方法的另一种病毒基因递送系统利用了腺病毒衍生载体。产生复 制缺陷型腺病毒是通过操纵腺病毒的基因组，从而使得它编码并表达目的基因产物，但其 正常的裂解病毒生命周期中的复制能力被灭活。参见例如Berkner et al. ,BioTechniques 6 :616(1988) ；Rosenfeld et al.，Science 252 :431-434(1991)；禾口 Rosenfeld et al.， Cell M :143-155(1992)。来源于腺病毒株Ad 5型dl3M的合适腺病毒载体是本领域技 术人员已知的。重组腺病毒在特定情况中是有利的，因为它们不能感染不分裂细胞并且可 以用于感染包括上皮细胞的许多不同的细胞类型(Rosenfeld et al. , (1992)，同上)。此 外，病毒颗粒相对稳定和易于纯化和浓缩，并且如上所述，可以通过修饰影响其感染范围。 另外，引入的腺病毒DNA(以及其中含有的外来DNA)不会整合到宿主细胞的基因组中而是 保持游离状态，从而避免了因为在引入DNA整合到宿主基因组(例如逆转录DNA)的地方发 生插入突变而带来的可能问题。而且，腺病毒基因组携带外来DNA的能力相对其他基因递 送载体很大(可达至1J 8 kilobases (kb), Berkner et al.,同前；Haj-Ahmand and Graham, J. Virol. 57 :267(1986)).再者，已制备出可以含有301Λ以上转基因的特殊的高容量腺病 毒(HC-Ad)载体(Kochanek et al. , Hum. Gene Ther. 10 :2451-9 (1999)) 还有一种可用于递送核酸的病毒载体系统是腺相关病毒(AAV)。腺相关病毒是天 然缺陷型病毒，它需要诸如腺病毒或疱疹病毒的另一种病毒作为辅助病毒来获得有效的复 制和有生产力的生命周期(综述见McCarty et al.，Annu Rev Genet 38 =819-45(2004)；Daya et al.，Clin. Microbiol. Rev. :583-93 (2008))。它还是少数几种可能将 DNA 整合到不分裂细胞中的病毒之一，表现出高频率的稳定整合带来长期表达(参见例如 Samulski et al.，J. Virol. :3822-3828(1989)；和 McLaughlin et al. , J. Virol. 62 1963-1973(1989) ；Flotte et al. , Am. J. Respir Cell. Mol. Biol. 7 :349-356(1992)； Miller et al. , Nature Genet. 36 :767-773 (2004)) 含有少到 300 个碱基对的 AAV 的载 体仍可以包装并整合。可供外源DNA的空间限于大约4kb。诸如"Tratschin et al. , Mol. Cell. Biol. 5 :3251-3260(1985)中描述的AAV载体可被用于将DNA引入细胞。通过利用来 源于许多不同血清型的AAV载体，已有各种核酸被引入不同细胞类型(参见例如Hermonat et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6466-6470(1984) ；Tratschin et al. , Mol. Cell. Biol. 4 :2072-2081 (1985) ；Wondisford et al. , Mol. Endocrinol. 2 :32-39 (1988)； Tratschin et al. , J. Virol. 51 :611-619 (1984)；以及 Flotte et al.，J. Biol. Chem. 268 3781-3790(1993) ；Summerford et al. , J.Virol. 72 1438-45(1998) ；Davidson et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3428-32(2000) ；Zabner et al. , J. Virol. 74 3852-8(2000) ；Rabinowitz JE et al. , J. Virol. 76 :791-801(2002) ；Davidoff et al.， Mol Ther. 11 :875-88(2005) ；Mueller et al.，Gene Ther. 15 :858-63. (2008)) 除了以上阐述的病毒转移法，也可以采用非病毒方法带来本文描述的核酸化合物 的表达(这类方法的综述可以参见Niidome et al. ,Gene Ther. 9 1647-52 (2002)) 一般 来说，基因转移的非病毒法依赖哺乳动物所用的正常机制进行大分子的摄入和胞内运输。 在一些实施方案中，非病毒基因递送系统可以依赖胞吞途径使对象基因被靶细胞摄入。示 范性的这种类型的基因递送系统包括来源于脂质体的系统、诸如多聚胺和多聚赖氨酸的多 聚阳离子缀合物，以及人工病毒被膜。其他实施方案包括诸如Cohen et al. ,Gene Ther. 7 1896-905(2000) ；Tam et al. , Gene Ther. 7 1867-74(2000) ；Meuli et al. , J. Invest. Dermatol. 116 :131-135(2001)；或Fenske et al. ,Methods Enzymo 1. 346 :36-71(2002)中 描述的质粒注射系统。在一些实施方案中，可以利用裸DNA构建体和/或基于DNA载体的构建体来表达 BMP。裸DNA构建体和这类构建体的治疗应用是本领域技术人员公知的(参见例如 Chiarella et al., Recent Patents Anti-Infect. Drug Disc. ,3 :93-101,2008 ；Gray et al. , Expert Opin. Biol. Ther.,旦911-922,2008 ；Melman et al. , Hum. Gene Ther.,17 1165-1176,2008)。一般来说，裸DNA构建体包含一或多个治疗性核酸(例如，编码BMP的 DNA)和启动子序列。裸DNA构建体可以是DNA载体，通常称为pDNA。裸DNA —般不会整合 到染色体DNA中。通常，裸DNA构建体不需要脂质、聚合物或病毒蛋白的存在，或者不会与 它们联合使用。这类构建体还可以包含本文描述的一或多种非治疗性成分。DNA载体是本领域已知的，一般是环形双链DNA分子。DNA载体的大小通常在3到 5千碱基对范围内(例如，包括插入的治疗性核酸)。与裸露DNA—样，DNA载体可以用于 在靶细胞中递送并表达一或多种治疗性蛋白。DNA载体不会整合到染色体DNA中。通常，DNA载体包含至少一个启动子序列以便在靶细胞内进行复制。通过将DNA载 体与例如阳离子脂质组合，形成DNA复合体可以协助(例如提高)DNA载体的摄入。在一些实施方案中，DNA载体可以经由常规转化或转染技术引入靶细胞。名词“转化”和“转染”用于本文是指多种本领域认可的向靶细胞引入外来核酸(例如DNA)的技术， 包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染或电穿孔。制备本文描述的表达构建体所需的所有分子生物学技术都是本领域技术人员能 够理解的标准技术。详细方法还可以在例如Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (eds. )Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9. 10-9. 14 以 及其他标准实验手册中找到。编码改变的BMP氨基酸序列(例如与文中所示野生型BMP序 列有至少50、60、70、80、90、95、98和99%相同度的氨基酸序列)的DNA可以利用例如定点 突变技术制备。制剂通常，在使用BMP多肽或核酸的情况中，所述多肽或核酸来自与受试对象相同的 物种，例如人、猫、犬、牛、猪或绵羊。文中描述的BMP化合物可以以任何合适的方式配制，例如配制在载体系统中用 于与细胞群接触。载体可以是胶体系统。胶体系统可以是脂质体这种磷脂双层介质。在 一些实施方案中，在保持蛋白完整性情况下，蛋白被包被在脂质体中。本领域技术人员知 道有许多方法可以制备脂质体(参见Lichtenberg et al.，Methods Biochem Anal, 33 337-462(1988) ,LIPOSOME TECHNOLOGY Anselem et al. ,CRC Press，1993)。可以由大小和 取代基各不相同的磷脂来制备脂质体，脂质体还可以含有其他低毒性成分，比如胆固醇。脂 质体可以配制和分离为各种形状和大小。此外，可以给脂质体表面附着上部分以便进一步 提高载体的药物动力学特性。所述部分可以附着到磷脂或胆固醇分子上，可以调节表面上 引入的部分的百分比来达到最佳脂质体稳定性和药物动力学特征。一个实施方案包含表面 上添加聚乙二醇(PEG)的脂质体。脂质体制剂可以延迟清除和增加细胞摄入(参见Reddy， Annals of Pharmacotherapy,34(7/8) :915-923(2000))。载体还可以是聚合物，例如生物可降解、生物相容性的聚合物基质。在一些实施 方案中，可以在保持蛋白完整性的情况下，将蛋白包埋在聚合物基质内。所述聚合物可以 是天然的，比如多肽、蛋白或者多糖；或者是合成的，比如聚(α-羟基)酸。实例包括由 胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、醋酸纤维素、硝酸纤维素、多糖、纤维蛋白、明胶以及它们的 组合制成的载体。在一些实施方案中，聚合物是聚乳酸(PLA)或聚乳酸/聚乙醇酸共聚 物(PGLA)。聚合物基质可以制备和分离为各种形式和大小，包括微球和纳米球。聚合物 制剂可以使治疗效果持续更长时间(参见Reddy，Annals of Pharmacotherapy, 34 (7/8) 915-923(2000))。人生长激素(hGH)的聚合物制剂已被用于临床试验(参见Kozarich and Rich, Chemical Biology, 2 :548-552,1998)。聚合物微球缓释制剂的实例在PCT公开WO 99/15154 (Tracy et al.)、美国专利 5，674，534 和 5，716，644 (均授予 Zale 等)、PCT 公开 W 96/40073 (Zale et al.)和 PCT 公 开 TO 00/38651 (Shah et al.)中有描述。美国专利 5，674，534 和 5，716，644 以及 PCT 公 开WO 96/40073描述了含有促红细胞生成素颗粒的聚合物基质，其中用盐使颗粒抗聚集而稳定。分化方法这里描述的是通过用一或多种BMP与^^_1+祖细胞群进行接触，产生成熟BAT细 胞或具有成熟BAT细胞特性的细胞的方法。所述一或多种BMP的量(例如浓度或剂量)以及处理时间足以增加ka-Ι+祖细胞群中BAT细胞或者具有成熟BAT细胞特性的细胞的数 量。本领域技术人员利用已知方法可以确定BMP用量和处理时间。在一些实施方案中，所 述 BMP 是 BMP-7。在一些实施方案中，一或多个BMP的量可以包含例如每种ΒΜΡ0. 1_50ηΜ。在一些实施方案中，处理时间可以是例如1-2天、1-3天、1-4天、1_5天和1_5天以上。在一些实施方案中，ka-Ι+细胞在例如没有任何分化诱导步骤情况下，只与一或 多种BMP进行接触。替代地，Sca-I+细胞用包含一或多种BMP的第一溶液和包含一或多种 化学或激素性分化诱导剂和/或噻唑烷二酮的第二溶液进行处理。ka-Ι+细胞可以顺序 (例如，第一然后第二，或者第二然后第一)或者同时接触所述第一和第二溶液。本领域技 术人员利用已知方法可以很容易地确定第一和第二溶液的用量、处理时间以及第一和第二 溶液的使用顺序。在一些实施方案中，包含一或多种化学或激素性分化诱导剂和/或噻唑烷二酮的 第二溶液是成骨、软骨形成、肌组织形成或脂肪形成分化溶液。示范性的分化溶液已有描述 (Klien et al.，J. Biol. Chem. ,274 :34795-34802,1999 ；Hauner et al.，J. Clin. Invest.， M =1663-1670,1989)。为了促进本文描述的细胞分化为BAT系或者向该谱系分化，可以用 噻唑烷二酮处理细胞。替代地或者附加的，可以象例如先前描述的，用含有胰岛素、地塞米 松、三碘甲腺原氨酸、异丁基甲基黄嘌呤和0. 125mM吲哚美辛(indomethacin)的脂肪形成 诱导混合液处理本文描述的细胞(Klien et al.，J. Biol. Chem. ,2U =34795-34802,1999)。在一些实施方案中，通过确定细胞群中一或多种标记物的存在与否对分化处理进 行评价。在一些实施方案中，方法包括评价BMP处理细胞和细胞群的脂肪形成水平。脂肪 形成的评价可以通过(例如利用油红O(ORO)染色)测量例如一或多种脂质的累积。油 红0染料用于将细胞中的中性脂质染色。染色的量与细胞中脂质的量直接成比例，可以通 过分光光度法测量。确定脂质累积的量作为分化的参数。替代地或者此外，可以通过测 量脂肪形成的一或多种标记物来评价脂肪形成，例如选自过氧化物酶体增殖物激活受体 Y ( 々1 ￥)、脂肪酸结合蛋白4尔48 4，aP2)、和/或脂肪酸合成酶(FAS)的一或多种标记 物。在一些实施方案中，方法包括评价细胞或细胞群的BAT脂肪形成水平。BAT分化可 以通过测量以下的一或多种一或多种BAT特异标记物，比如解偶联蛋白(UCP)、诱导细胞 死亡DFF45样效应因子A (CIDEA) ,PPAR γ共活化因子(PGC) -I α，和/或PPAR γ共活化因 子(PGC)-I β和/或PRDM-16 ；BAT形态学(例如利用目测，例如对细胞显微镜观测)；或者 BAT热动力学，例如细胞色素氧化酶活性、Na+-K+-ATPaSe酶单位、或者其他参与BAT产热的 酶。在一些实施方案中，方法可以包括评价细胞内前脂肪细胞因子(pref)-l这种脂 肪形成抑制剂的水平，其中相对例如合适的未处理对照细胞或相同细胞在处理前的pref-1 水平，pref-Ι水平的下降表明细胞已发生BAT分化。在一些实施方案中，方法包括用环化AMP(cAMP)或其类似物，比如二丁酰cAMP或 β 3-肾上腺素能激动剂CL316249处理细胞来估计细胞激活产热的能力。冷诱发的体内产热由一个信号传导级联介导，该信号传导级联涉及交感神经系统和BAT中的β 3肾上腺素 能受体的活化。这些事件导致细胞质cAMP水平增加，继而引发参与成熟褐色脂肪细胞产热 的基因的表达。为了确定分化细胞是否成为真正的褐色脂肪细胞，可以测量用细胞穿膜性 cAMP类似物-二丁酰cAMP (Sigma)或β 3-肾上腺素能激动剂CL316249 (Sigma)处理过的 分化脂肪细胞中产热基因(比如UCP-1)的表达。这些方法包括评估(例如测量)成熟褐 色脂肪细胞中参与产热的一或多个基因的表达。示范性的这类基因包括，但不限于UCP-1、 CIDEA、PGC-I、PRDM16以及参与线粒体生物形成和功能的基因。显示表达一或多个这类基 因的细胞即可鉴定为成熟BAT细胞和/或具有成熟褐色脂肪细胞特征的细胞。在一些实施方案中，方法包括评价WAT分化，例如评价WAT特异标记物，比如抵抗 素(resistin)、TCF21、瘦素(1印tin)和/或核受体相互作用蛋白1 (RIP140)中的一或多 个，和/或评价WAT形态学。WAT和BAT可以通过常规技术予以区分，例如WAT或BAT特异的形态学改变，或者 评价WAT-特异的或者BAT-特异的标记物。例如，BAT细胞可以通过解偶联蛋白(UCP)(例 如UCP-1)的表达来鉴定。治疗方法本文描述的方法和组合物可用于治疗肥胖症和体重相关疾病。通常方法包括将有 效量的BMP处理细胞给予有需要的受试对象，包括被诊断为需要这种治疗的对象。受试对象的选择在一些实施方案中，方法包括鉴定需要治疗的受试对象(例如，超重或肥胖受试 对象，例如体质量指数(BMI) 25- 或30或更高，或者患有体重相关疾病的受试对象)并给 予受试对象有效量的BMP处理细胞。需要用本文描述的方法进行治疗的受试对象可以根据 受试对象的体重或体质量指数来选择。在一些实施方案中，方法包括评价受试对象体重、脂 肪组织储存、脂肪组织形态学、胰岛素水平、胰岛素代谢、葡萄糖水平、产热能力和冷敏感度 中的一或多项。在一些实施方案中，受试对象的选择可以包括估计受试对象中BAT的量或 活性并记录这些观察。在给予化合物之前、过程中和/或之后可以进行评价。例如，可以在给药之前和/ 或之后至少1天、2天、4、7、14、21、30或更多天进行评价。在一些实施方案中，Sca-I+祖细胞可以从被挑选接受治疗的受试者获得。细胞疗法本文描述的方法可以包括将BMP处理的ka-Ι+细胞，如文中描述地移植给待治疗 受试对象，其中所述BMP处理的干细胞群或者它们的后代(即子细胞)发生褐色脂肪组织 形成。ka-Ι+细胞一移植后，通常会经历脂肪组织发生，在受试对象中产生BAT。这些细胞治疗方法可以用于例如治疗受试对象的肥胖症和胰岛素抗性，或者治疗 与缺少线粒体相关的疾病，例如糖尿病、癌症、神经系统退行和衰老。BMP处理的ka-Ι+细胞群(例如，用本文描述的分化方法处理过的细胞) 的植入方法是本领域已知的，例如利用设计成能将细胞导入受试对象的递送系统进行植 入。一般来说，递送系统可以包含含有细胞群的储存容器和与该容器液体相通的针头，其中 所述细胞群包含BMP处理的ka-Ι+细胞。BMP处理的细胞群一般在有或没有细胞 可附着其上的支架、基质或其他可移植装置(实例包括由胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、醋酸纤维素、硝酸纤维素、多糖、纤维蛋白、明胶以及它们的组合制成的载体)的情况下，置 于可药用载体中。这类递送系统也在本发明的范围内。通常这类递送系统被保持无菌状态。 可以使用各种给药途径和各种部位(例如，肾包膜下、皮下、中枢神经系统(包括鞘内)、血 管内、肝内、内脏内、腹膜内(包括网膜内)、肌内植入)。通常细胞将被皮下植入受试对象。 在一些实施方案中，植入的BMP处理的ka-Ι+细胞群包含至少107Q、108、109或更多细胞。在使用了非免疫相容性细胞的情况下，可以给予受体受试对象剂量足够抑制细胞 排斥的免疫抑制化合物，例如药物或抗体。免疫抑制剂的剂量范围是本领域已知的。参见 例如 Freed et al. , N. Engl. J. Med. 327 1549 (1992) ；Spencer et al.，N. Engl. J. Med. 327 1541(1992) ；Widner et al.，N. Engl. J. Med. 327 :1556 (1992))。剂量值可能根据各种因素， 比如受试对象的疾病状态、年龄、性别和体重而不同。在一些实施方案中，除了 BMP处理的细胞，方法还包括接触、给予或表达一或多种 下列其他化合物，例如过氧化物酶体增殖物激活受体Y (PPAR0、类视黄醇X受体α (RxRV )、胰岛素、Τ3、噻唑烷二酮(TZD)、视黄酸、另一种BMP蛋白(例如BMP-I或BMP-3)、维生素 A、视黄酸、胰岛素、糖皮质激素或其激动剂、无翅型(Wingless-type (Wnt)，例如Wnt-Ι)、胰 岛素样生长因子-I(IGF-I)或其他生长因子(例如表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因 子(FGF)、转化生长因子(TGF)-a ,TGF-β，肿瘤坏死因子α (TNF α )、巨噬细胞集落刺激因 子(MCSF)、血管内皮生长因子(VEGF)和/或血小板衍生生长因子(PDGF))。其他实施方案 中，化合物可以是本文描述的ΒΜΡ-2、-4、-5、-6和/或-7蛋白或其部分连接了异源多肽序 列，例如第二种BMP蛋白，从而形成嵌合分子或融合蛋白。在一些实施方案中，方法包括将 化合物与第二治疗方法联合给予，例如肥胖症或诸如糖尿病的相关疾病的第二治疗方法。 例如，第二治疗方法可以是胰岛素、orlistat、苯二甲吗啉(phendimetrazine)和/或苯丁 胺(phentermine)。体内疗法 在一些实施方案中，本公开提供了体内治疗方法。所述方法包括如上所述挑选受 试对象，并将能够增强受试对象的BMP信号传导的一或多种化合物给予受试对象，其中所 述各种化合物特异靶向受试对象中的ka-Ι+细胞。可以用于这些方法的化合物包括，例如 BMPs和特异靶向ka-Ι+细胞的BMP激动剂。这类化合物可以特异结合和/或细胞 表面的⑶四受体。有效剂量通过标准药物学程序，例如培养细胞或实验动物确定LD5CI(对群体50%致死的剂 量)和ED5tl (在群体50%治疗有效的剂量)可以确定本文描述的化合物和药物组合物的毒 性和治疗有效。毒性效果和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数，可以表达为比率LD5tl/ ED500优选表现出较大治疗指数的多肽或其他化合物。由细胞培养分析和进一步的动物研究获得的数据可以用于制定给人使用的剂量 范围。优选这类化合物的剂量落在这样的循环浓度范围内，该范围包含ED5tl，只有很少的或 者没有毒性，并且对人的听力有小的或者没有副作用。根据所采用的剂量形式和给药途径， 剂量可能在该范围内变化。对于本文描述的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以 首先由细胞培养分析来估计。可以在动物模型中制定出剂量从而达到包含细胞培养中确 定出来的IC5(I(即实现症状最大抑制的一半时的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。可以利用这样的信息更准确地确定人使用的剂量。示范性的分化剂剂量是至少每天大约 0. 01 到 3000mg，例如每天每公斤体重至少大约 0. 00001,0. 0001,0. 001,0. 01,0. 1、1、2、5、 10、25、50、100、200、500、1000、2000 或 3000mg 或者更多。可以针对要治疗的疾病或病症以及被治疗的具体人来决定剂型和给药途径。受试 对象可以在一周、一个月、六个月、一年或更长时间内每天接受一个或两个或更多个药剂剂 量。治疗可以持续无限期，比如人的一生。可以按照规律或不规律的间隔(每两天一次或 者每周两次)给予治疗，给药剂量和时机在治疗期间可以调整。剂量在治疗方案期间可以 保持不变，或者在治疗期间可以降低或提高。通常剂量在预防和治疗方面均达到预期目的，而没有不希望的副作用，比如毒 性、有刺激或过敏反应。虽然受试对象需求可能不同，确定制剂的最佳有效量范围是本 领域常规技术。人剂量可以容易地由动物研究推出(Katocs et al. , Chapter 27 In: ReminRton' s Pharmaceutical Sciences,18th Ed. ,Gennaro,ed. ,Mack Publishing Co.， Easton, Pa.，1990)。通常，提供有效量制剂所需的用药量(本领域技术人员可以对其进行 调节)可能根据多种因素而变化，这些因素包括受体的年龄、健康和身体状况、体重、疾病 或病症的类型和程度、治疗频率、可能同时进行的治疗的性质以及预期效果的性质和范围 (Nies et al. , Chapter 3, In Goodman & Gilman' s “The Pharmacological Basis of Therapeutics，，,9th Ed. , Hardman et al. , eds. , McGraw-Hi 11, New York, N. Y. , 1996)。治疗的评价/验证在一些实施方案中，本文描述的方法可以包括在治疗后评价受试对象体内BAT的 量或活性并记录这些观察数据。这些治疗后观察数据可以与挑选受试对象期间做的观察进 行比较。在一些实施方案中，受试对象具有提高的BAT水平和/或活性。在一些实施方案 中，受试对象会表现出减少的症状。一些实施方案中，评估可以包括确定治疗前和/或后受试对象的体重或BMI，并对 受试对象治疗前的体重或BMI与治疗后的体重或BMI进行比较。观察到体重或BMI下降即 指示着成功。在一些实施方案中，另外给予治疗一或多次直至实现目标体重或BMI。替代 地，可以使用围长的测量值，例如腰围、胸围、臀围、大腿围或者臂围。这些评估可以用于给受试对象确定将来的疗程。例如治疗可能没有变化地继续、 做改变(例如附加的治疗或者更激进的治疗)后继续，或者可以终止治疗。在一些实施方案中，方法包括另外的一或多轮植入BMP活化细胞从而提高例如褐 色脂肪组织形成，以便例如维持或进一步减轻受试对象的肥胖。筛选方法在一些实施方案中，本文描述的方法包括鉴定BAT祖细胞的筛选方法。这些方法 包括获取ka-Ι+祖细胞。在一些实施方案中，这些细胞将被通过评估细胞表面标记物表 达、RNA和DNA特性以及蛋白组学进行表征。替代地或者此外，可以利用文中描述的分化方 法来处理细胞。在一些实施方案中，可以单独用BMP-7或者与一或多种分化诱导混合液组 合来处理ka-Ι+细胞。然后可以对细胞进行评价来确认细胞群包含一或多种成熟BAT细 胞或者具有BAT细胞特征的细胞。这些成熟BAT细胞或者具有BAT细胞特征的细胞然后可 以被分离，并通过例如评估细胞表面标记物表达、RNA和DNA特性以及蛋白组学进行表征。 所做观察将被记录并与用类似处理的ka-Ι+细胞得到的观察进行比较。在一些实施方案中，所做观察与利用未处理祖细胞得到的观察进行比较从而确定分化前和后存在哪些标记 物。然后可以确定经常出现的观察结果，并用于给能够分化为BAT细胞系或者向该谱系分 化的细胞建立谱(profile)。然后可以利用该谱从异质细胞群中挑选出BAT祖细胞。试剂盒本发明提供了试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可以包括(1) 一或多种ka-1+ 祖细胞；⑵一或多种BMP，其能够促进所述一或多种ka-Ι+祖细胞分化为成熟BAT细胞系 或者向该谱系分化；C3)用于将细胞给予受试对象的装置；(4)给药说明；以及任选的(5) 一或多种分化诱导混合液。一些实施方案中，试剂盒可以包含(1) 一或多种BMP处理的ka-Ι+细胞；(2)用 于将细胞给予受试对象的装置；和( 给药说明。也包括相同容器中含有两种或多种(包 括全部)成分的实施方案。提供试剂盒时，组合物的不同成分可以包装在独立的容器内并在临用前混合。成 分的这种独立包装可以保证长期保存而不丧失活性成分的功能。当具体试剂盒中包含一种 以上生物活性剂时，所述生物活性剂可以(1)分别包装，在临用前用合适的(类似于不同 的，但是相容的)助剂或赋形剂混合，(2)包装在一起，在临用前一起混合，或者C3)分别包 装，在临用前一起混合。如果选定的化合物在混合后仍保持稳定，化合物可以在使用前的一 个时间，包括例如使用前几分钟、几小时、几天、几个月、几年和生产时混合，而不需在临用 前混合。包含在本发明的具体试剂盒中的组合物可以放在任何类型的容器中提供，使得不 同成分的寿命可以得到最佳保存，并且不会被容器材料所吸收后改变。容器的合适材料可 以包括，例如玻璃、有机聚合物(例如聚碳酸酯和聚苯乙烯)、瓷、金属(例如，铝)、合金或 任何其他常用于盛放类似化学剂的材料。示范性的容器可以包括，但不限于试管、小瓶、三 角瓶、瓶子、注射器等。正如以上的陈述，试剂盒中还可以提供说明材料。这些说明可以是印刷的和/或 不限于作为电子可读介质提供，比如软盘、⑶-ROM、DVD、Zip盘、录像带、录音带和闪存装置 (flash memory device)。替代地，说明可以是公开在互联网址或者以电子邮件发送给使用
者ο所述试剂盒还包括用于治疗或预防体重相关疾病和肥胖症的试剂盒。通过以下实施例进一步描述本发明，这些实施例并不限制权利要求中描述的发明 范围。
实施例实施例1 在无化学和/或激素的分化诱导剂的情况下，骨形态发生蛋白的处理促 进BAT分化按照以下方法分析用骨形态发生蛋白BMP-2、_4、_5、_6和_7处理野生型褐色前 脂肪细胞和3T3-L1白色前脂肪细胞的效果。次融汇状态细胞在补充有10%胎牛血清以及BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6 或BMP-7的Duibecco，s Modified Eagles Medium(DMEM)中培养。对照细胞培养基不含 BMP。细胞不与化学或激素的分化诱导剂或噻唑烷二酮接触。将细胞培养8天。然后收集细胞进行油红0染色和RNA提取。脂质累积利用油红0染色分析。简而言之，细胞在室温下用过滤过的油红0溶液 (溶于异丙醇的0. 5%油红O(Sigma-Aldrich))染色2个小时。如图IA所示，与对照细胞群相比，BMP-2、BMP-4、BMP-6和BMP-7导致野生型褐色 前脂肪细胞中脂质积累显著增加，因为油红0积累增加这些细胞表现出更深的颜色表明了 这一点。相反，如图IB所示，3T3-L1白色前脂肪细胞中未观察到脂质积累增加。这些数据表明，即使在不含化学或激素性分化诱导剂的生长培养基中，多种 BMP (BMP-2、BMP-4、BMP-6和BMP-7)均能够促进褐色前脂肪细胞中脂质累积的增加。因为脂 质累积与这些细胞向BAT表现型分化是一致的，这些结果表明BMP-2、BMP-4、BMP-6和BMP-7 能够促进BAT祖细胞分化为BAT细胞系或者向该谱系分化。解偶联蛋白-(UCP-I)和诱导细胞死亡DFF45样效应因子A(CIDEA)是常用于确 认 BAT 分化的特异标记物(Zhou et al.，Nat. Genet. ,35 49-56，2003)。为 了分析 BMP-2、 BMP-4、BMP-6和BMP-7是否促进褐色前脂肪细胞分化为成熟BAT细胞，用如上制备的细胞 进行了定量RT-PCR来评估UCP-I和CIDEA的表达。野生型褐色前脂肪细胞在有各种BMP存在的情况下培养8天。然后收集细胞，用 QIAzol裂解试剂Oliagen，Valencia, CA)分离RNA。用于扩增UCP-I的有义和反义引物购 自 SuperArray (产品目录 No. PPM05164A)。用于扩增CIDEA的有义和反义引物分别是5，-ATCACAACTGGCCTGGTTACG-3，SEQ ID NO 6 ；禾口5，-TACTACCCGGTGTCCATTTCT-3，SEQ ID NO :7。按照生产商的使用说明(BDBiosciences, Palo Al to，CA)，利用 Advantage RT-PCR试剂盒由1 μ g RNA制备cDNA，并稀释至终体积250 μ 1。5 μ 1稀释的cDNA用在含有 SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)的 20 μ 1 PCR 反应中。每 种引物使用浓度为300ηΜ。每个样品的PCR反应一式两份，利用ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems)进行定量。如图2A所示，BMP-7处理的细胞与对照细胞群相比，表现出显著增加的UCP-I和 CIDEA表达。BMP-2处理的细胞中也观察到CIDEA表达增加。这些结果表明BMP-2和BMP-7促进野生型褐色前脂肪细胞分化为BAT。利用Wfestern Blotting也证实了以上观察结果。简单地说，次融汇状态褐色和白 色前脂肪细胞在对照培养基和补充有3. 3nM BMP-6或BMP-7的培养基中培养13天。由BMP-6、BMP-7和对照处理的褐色和白色前脂肪细胞获得的蛋白提取物经 SDS-PAGE分离，并利用Western印迹分析。膜在剥离前首先用抗UCP的特异抗体(Santa Cruz, CA)检测，再用抗微管蛋白的特异抗体再次检测作为上样对照。如图2Β所示，接触ΒΜΡ-7的褐色细胞群中，UCP-I被特异上调。UCP-I上调现象在 接触ΒΜΡ-7的白色细胞群、或者ΒΜΡ-6或对照处理的褐色和白色细胞中未观察到。除了以上描述的观察结果，ΒΜΡ-7还促进线粒体生物发生的增加。这些数据表明，ΒΜΡ-7是一种重要的褐色脂肪形成因子和产热调节剂。实施例2 干细胞抗原-1阳性褐色脂肪细胞祖细胞的分离和表征候选褐色脂肪祖细胞分离自成年小鼠骨骼肌。然后通过与ΒΜΡ-7接触，考察这些分离细胞分化为BAT细胞的能力。来自小鼠四肢肌纤维相关间质细胞的干细胞抗原-1阳性(Sca-Ι+)和CD45/ Mac-I阴性(Sca-Ι+/⑶45-/Mac-l-)非肌原祖细胞群通过荧光活化细胞分选(FACS)纯化。 简单来说，用二氧化碳将动物处死，然后颈椎脱白。从前后肢解剖肌肉组织，收集到15ml Digestion Buffer I (DMEM、0. 2%胶原酶 II 型，Invitrogen # 17101-015)中。将样品在 37°C水浴中轻柔震荡消化90分钟。加入3ml胎牛血清(FBS)终止消化反应。分离组织片， 用F10+20%FBS培养基清洗两次，磷酸盐缓冲液(PBQ洗一次，不能破坏组织片。将组织在 PBS中切碎获得完整的肌肉纤维。然后通过沉淀3到4次清洗肌肉纤维以除去间质细胞。初步清洗后，除去上清，使 终体积为 3_5ml，然后加入 5-6ml Digestion Buffer II (F10、0. 0125%胶原酶 II 型、0. 05% 分散酶，Invitrogen # 17105-041)。样品然后在轻柔震荡下于37°C温育30分钟。然后向溶液加入1. 5ml FBS终止消 化。通过将样品上下吸放大约4次使样品中存在的肌纤维相关细胞释放出来。样品然后低 速离心1分钟除去未消化的组织片。将上清经70 μ m细胞过滤网过滤。离心收集细胞并重 悬于小体积分选培养基(溶于Hanks缓冲盐溶液HBSS的2% FBS)中进行抗体染色。在分选培养基中完成一个清洗步骤后，细胞经gauge net过滤。加入活性选择标记 物-碘化丙啶(用于检测死细胞)和钙荧光素蓝(calcein blue)(用于检测活细胞)后，对 细胞进行荧光活化细胞分选(FACS)，阴性选择PE (表达Mac-I和⑶45)，阳性选择APC (表 达^^-1)。所有抗体以1 200稀释度加入细胞悬液，在冰上孵育20分钟。所用抗体包 括抗 ka-l(APC-标记的；eBioscience # 17-5981-82)、Mac_l (PE-标记的；eBioscience # 12-0112-82)和 CD45(PE-标记的；eBioscience # 12-0451-82)的抗体。然后将细胞重悬于生长培养基(含有10% FBS和谷胱氨酰的F10)并以每孔 25. 000个细胞的密度接种在包被层粘连蛋白/胶原蛋白的M孔细胞培养板上。生长期间， 细胞每天补充加入5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Sigma-Aldrich # F(^91)。Sca-1+/CD45-/Mac_l-祖细胞然后与补充有10%胎牛血清和3. 3nM BMP-7的DMEM 接触3天。对照细胞与补充10%胎牛血清、没有BMP-7的DMEM接触。然后细胞与脂肪细 胞诱导培养基接触4天。具体来说，脂肪细胞分化的诱导是通过将融汇细胞在补充了 20nM 胰岛素和InM三碘甲腺原氨酸(Τ3)、0.5μΜ异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)、5mM地塞米松和 0. 125mM吲哚美辛的培养基中处理48小时。这一诱导期(第二天)之后，将细胞放回补充 有胰岛素和T3的生长培养基，然后该培养基被每两天换一次。然后固定细胞进行油红0染 色并分离RNA进行定量RT-PCR。如实施例1所述进行油红0染色。如图3A和;3B所示，BMP-7处理的ka-l+/CD45-/Mac_l-与相应对照细胞群相比， 表现出显著增加的脂质累积。然后进行定量RT-PCR来确定脂肪形成标记物和褐色脂肪细胞特异的脂肪形成标 记物的表达水平。所分析的脂肪形成标记物是过氧化物酶体增殖物激活受体Y(PPARY)、 脂肪酸结合蛋白4(FABA4，aP2)和脂肪酸合成酶(FAQ。褐色脂肪细胞特异的脂肪形成标 记物是 UCP-I、CIDEA、PPAR γ 共活化剂(PGC)-I α 和 PGC-I β。定量RT-PCR如实施例1所述进行。用于扩增PPAR γ的有义和反义标记物分别是5，-TCAGCTCTGTGGACCTCTCC-3，SEQ ID NO 8 ；禾口5，-ACCCTTGCATCCTTCACAAG-3，SEQ ID NO :9。用于扩增FABA，aP2的有义和反义标记物分别是5，-GATGCCTTTGTGGGAACCT-3，SEQ ID NO 10 ；禾口5，-CTGTCGTCTGCGGTGATTT-3，SEQ ID NO :11。用于扩增FAS的有义和反义标记物分别是5，-GAGGACACTCAAGTGGCTGA-3，SEQ ID NO 12 ；禾口5，-GTGAGGTTGCTGTCGTCTGT-3，SEQ ID NO :13。用于扩增PGC-I α的有义和反义标记物分别是5，-GTCAACAGCAAAAGCCACAA—3 ‘ SEQ ID NO 14 ；禾口5，-TCTGGGGTCAGAGGAAGAGA-3，SEQ ID NO :15。用于扩增PGC-I β的有义和反义标记物分别是5，-CTTGCTTTTCCCAGATGAGG-3，SEQ ID NO 16 ；禾口5，-CCCTGTCCGTGAGGAACG-3，SEQ ID NO :17。如图4Α所示，ΒΜΡ-7处理导致脂肪形成标记物(PPAR y、FABP4、aP2和FAS)和褐 色脂肪选择性标记物(UCP-1和CIDEA)均有显著增加。观察到的最低诱导是PPAR Y，相对 对照有2倍增加。其他所有标记物相对对照均有2倍以上增加。增加最大的是CIDEA，其相 对对照有3. 5倍增加。这些观察结果表明，BMP-7处理促进⑶45-/Mac-l-祖细胞分化为真正的 BAT细胞。为了进一步证实BMP-7处理的⑶45-/Mac_l-细胞已分化为能够产热的 成熟褐色脂肪细胞，将BMP-7处理的ka-Ι+/⑶45-/Mac-l-细胞和未处理对照细胞与环化 AMP(cAMP)类似物二丁酰cAMP (Sigma)或β 3-肾上腺素能激动剂CL316249 (Sigma)接触。 这两种化合物均能模拟诱发冷引发的产热，因此启动参与产热的基因的表达，而这专门发 生在成熟褐色脂肪细胞中。这两种化合物常用于褐色脂肪细胞的功能表征，以及将褐色脂 肪细胞与白色脂肪细胞区分开来。处理后，利用定量RT-PCR如上所述分析UCP-I的表达。如图4B所示，与对照细胞群细胞，BMP-7处理的ka-l+/CD45-/Mac_l-细胞群在 cAMP之后显示UCP-I表达增加大约300倍。这一观察结果表明接触了 BMP-7的Sca-I+/ CD45-/Mac-1-祖细胞分化为了真正的褐色脂肪细胞，完全能够应答儿荼酚胺刺激从而开启
产热程序。这些数据一起强烈提示，BMP-7能够诱导ka-Ι+祖细胞，特别是ka-l+/CD45-/ Mac-I-祖细胞分化为真正的褐色脂肪细胞。实施例3 新的褐色脂肪细胞祖细胞的鉴定文中给出的结果显示，BMP能够在ka-Ι+间充质祖细胞群中限定褐色还是白色脂 肪的命运。Sca-I表达代表了异质前体集合。为了鉴定实施例1和2中描述的之外的ka-1+ 细胞来源，以及可以用于鉴定或纯化这些细胞的褐色脂肪细胞祖细胞表面上的ka-Ι之 外的标记物，通过FACS从各种来源分离ka-Ι+祖细胞，所述来源包括肌肉以及包括肩胛间BAT、皮下白色脂肪组织和内脏白色脂肪组织的脂肪组织。然后将分离的ka-Ι+细胞与 BMP7接触来评估细胞分化为成熟褐色脂肪细胞的能力。然后确定能够分化为褐色脂肪细胞 的细胞的细胞表面标记物。这些另外的BAT祖细胞特异细胞表面标记物可以用于鉴定褐色 脂肪细胞祖细胞。更具体地说，按照以下程序，从骨骼肌、骨髓以及包括肩胛间BAT、皮下白色脂肪组 织和内脏白色脂肪组织的脂肪组织和储存中分离非造血ka-Ι+祖细胞骨骼肌来源的ka-Ι+细胞按照实施例1和2中使用的方法分离并培养ka-Ι+细胞。具体来说，用二氧化碳 将动物处死，然后做颈椎脱白。从前后肢解剖肌肉组织并收集在15ml的Digestion Buffer I (DMEM，0· 2%胶原酶 II 型，Invitrogen # 17101-015)中。将样品在37°C水浴中轻柔震荡消化90分钟后，加入3ml胎牛血清(FBQ终止消化 反应。分离组织片，用F10+20% FBS培养基清洗两次，磷酸盐缓冲液(PBQ洗一次，不能破 坏组织片。将组织在PBS中切碎获得完整的肌肉纤维。然后通过沉淀3到4次清洗肌肉纤维以除去间质细胞。初步清洗后，除去上清，使 终体积为 3_5ml，然后加入5-6ml Digestion Buffer II (F10、0. 0125%胶原酶 II 型、0. 05% 分散酶，Invitrogen # 17105-041)。样品然后在轻柔震荡下于37°C温育30分钟。加入1. 5ml FBS终止消化。将样品 上下吸放4次释放肌纤维相关细胞后，样品低速离心1分钟除去未消化的组织片。然后将 上清经70 μ m细胞过滤网过滤。离心收集细胞并重悬于小体积分选培养基(溶于Hanks缓 冲盐溶液HBSS的2% FBS)中进行抗体染色。所有抗体以1 200稀释度加入细胞悬液，在冰上孵育20分钟。抗体(APC 标记的；eBioscience # 17-5981-82)、Mac-1 (PE 标记的；eBioscience # 12-0112-82)和 CD45(PE标记的；eBioscience # 12-0451-8 的抗体。在分选培养基中完成一个清洗步骤 后，细胞经gauge net过滤。加入活性选择标记物一碘化丙啶(用于检测死细胞)和钙荧 光素蓝(calcein blue)(用于检测活细胞)后，对细胞进行荧光活化细胞分选(FACS)，阴性 选择PE (表达Mac-I和CD45)，阳性选择APC (表达Sca-1)(参见图6A)。然后将细胞重悬于生长培养基(发表在Calcif Tissue Int, 2008 Jan ； 82(1) :44-56) ο生长培养基由60%含有少量葡萄糖的Dulbecco，s Modified Eagle Medium(D-MEM) (Invitrogen, 11885-084)和 40% MCDB201 培养基(Sigma_Aldrich，M6770) 构成。培养基中补充有2%胎牛血清、青霉素/链霉素(Invitrogen，15140-155)、1ηΜ地 塞米松(Sigma-Aldrich，D-4902)、0. ImM L-抗坏血酸 2-磷酸(Sigma-Aldrich，A8960)、 Ix胰岛素转铁因子硒(ITS)混合液(Sigma-Aldrich，13146)以及Ix亚油酸-白蛋白 (Sigma-Aldrich Aldrich,L9530)。细胞以每孔25. 000-50. 000个细胞的密度接种在包被基 质胶的M孔细胞培养板上。生长培养基还补充了以下生长因子10ng/ml EGF(PeproTech, 315-09) U0ng/ml LIF(购自 Millipore 的 ESGR0，ESG1107)、10ng/ml PDGF-BB (PeproTech, 315-18)和5ng/ml bFGF(Sigma-Aldrich, F0291)。每次隔天换培养基前加入新鲜配制 的生长因子。生长期间，细胞每天补充加入5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF， Sigma-Aldrich#F0291)。这些分离细胞在用BMP7处理后，如下检测它们产生褐色脂肪细胞的能力。简单来说，如先前描述(Klein et al. , Τ. Biol. Chem. ,274 :34795-34802,1999 Hauner et al.， J. Clin. Invest. ,84 :1663-1670，1989)的，分离的细胞在有或没有脂肪形成分化培 养基的情况下与BMP7接触。更具体地说，在细胞90-95%融汇时或者分选后扩增7天后收 获细胞。第二天向含有全部生长因子的生长培养基加入3. 3nM BMP-7开始预处理。此外， 与前面一样每天补充bFGF。72小时后，诱导脂肪形成分化48小时。对于脂肪形成诱导混合液，使用了 不含生长因子的生长培养基。替代的，加入了以下化合物5yg/yl胰岛素(Roche， 11376497001)、50μΜ 吲哚美辛(Sigma-Aldrich, 17378),0. 5μ M IBMX (Sigma-Aldrich, 15879)、1 μ M 地塞米松(Sigma-Aldrich, D-4902)禾Π InM Τ3 (Sigma-Aldrich, Τ6397)。脂 肪形成诱导2天后，将培养基换成含有5 μ g/μ 1胰岛素和InM Τ3的培养基，最多再培养7 天。随后利用油红0染色和定量RT-PCR分析脂肪形成。如图5A-5C所示，与图1中显示的数据一致，用ΒΜΡ7处理分离自小鼠后肢骨骼肌 的ka-Ι+细胞促进了脂质积累的显著增加。在BMP7处理前，对这些骨骼肌来源的细胞进 行细胞表面标记物的分析。如图6A所示，这些分离的骨骼肌细胞是^^-1阳性、⑶45阴性 和Mac-I阴性。如图6B-6F所示，这些ka-1+BAT祖细胞对细胞表面标记物⑶29/整联蛋 白β 1和⑶34也是阳性的。相反，细胞对细胞表面标记物⑶31/PECAM-1和⑶117/C_kit 是阴性的。这些观察证明，Sca-1+BAT祖细胞可以从骨骼肌分离。观察结果还支持了可以通 过阳性鉴定单独的细胞表面标记物ka-Ι或者ka-Ι组合⑶四和⑶34中的一或多种来鉴 定和/或纯化这类细胞。这类细胞可以通过它们没有⑶45、Mac-l、⑶31和⑶117的细胞表
面表达来进一步鉴定。为了进一步证实这些ka-Ι+细胞分化为真正的褐色脂肪细胞的能力，如实施例1 和2中所述进行定量RT-PCR来分析这些骨骼肌源ka-Ι+细胞中脂肪形成标记物以及褐 色脂肪细胞特异的脂肪形成标记物的表达。除了实施例1和2中描述的标记物，还检测了 PRDM-16,ATPase,Pref-UBMPR-11A,BMPR-1B,BMPR-2 和 ACVR-I 的表达水平。如上文所述， UCP-I是高度可靠的BAT标记物。类似地，PRDM-16是褐色脂肪细胞特异的脂肪形成标记 物，UCP-I是常用于鉴定BAT的标记物。MPR-11A、BMPR-1B、BMPR-2和ACVR-I是脂肪形成 标记物。I^ref-I是可以用于脂肪形成的确认的脂肪形成抑制剂。RT-PCR中使用的引物如 实施例2和以下所示。用于扩增UCP-I的有义和反义标记物分别是5，-CTGCCAGGACAGTACCCAAG-3，SEQ ID NO 185，-TCAGCTGTTCAAAGCACACA-3，SEQ ID NO 19用于扩增PRDM-16的有义和反义标记物分别是5，-CAGCACGGTGAAGCCATTC-3，SEQ ID NO 205，-GCGTGCATCCGCTTGTG-3，SEQ ID NO 21用于扩增AIPase的有义和反义标记物分别是5’ -ACCTATCCCAGCCTCGTCTC-3，SEQ ID NO 225' -AGGACTTGCCCACTTCTCTTT-3，SEQ ID NO 23用于扩增的有义和反义标记物分别是5’ -AGTACGAATGCTCCTGCACAC-3，SEQ ID NO 24
5’ -CTGGCCCTCATCATCCAC-3，SEQ ID NO 25用于扩增BMPR-IA的有义和反义标记物分别是5，-AATGCAAGGATTCACCGAAAGCCC-3，SEQ ID NO 265，-ACAGCCATGGAAATGAGCACAACC-3，SEQ ID NO 27用于扩增BMPR-IB的有义和反义标记物分别是5，-AGAAGAGCACAGAGGCCCAATTCT-3，SEQ ID NO 285，-TGCAAGGTACACAGCAGTGCTAGA-3，SEQ ID NO 29用于扩增BMPR-2的有义和反义标记物分别是5，-AGCAATCGCCCATCGAGACTTGAA-3，SEQ ID NO 305’ -TTCTGGAGGCATATAGCGCTTGGT-3，SEQ ID NO 31用于扩增ACVR-I的有义和反义标记物分别是5’ -TGCTAATGATGATGGCTTTCC-3，SEQ ID NO 325，-TTCACAGTGGTCCTCGTTCC-3，SEQ ID NO 33如图7所示，ka-Ι+细胞的BMP7处理导致BAT特异标记物UCP-I的表达水平显 著提高。此外，这些细胞中的UCP-I表达在试验使用的整个12天期间继续增加。还观察到 BAT特异标记物PRDM-16、CIDEA、PGC-I α和PGC-I β的水平增加以及AIPase的表达水平 提高。脂肪形成标记物？ 々1 ^、冲2、 43、810^-认和810^-2的表达水平也观察到增加。相 反，观察到脂肪形成抑制剂I^ref-I的表达水平下降。这些观察结果一起证明，接触了细胞分化为脂肪细胞，而且是特异 分化为褐色脂肪细胞。细胞如实施例2所述还与cAMP进行了接触，如图8所示，这些细胞 中UCP-I的表达进一步显著提高。这一观察再次支持了 ka-Ι+细胞成为真正的褐色脂肪 细胞，完全能够通过激活产热程序应答儿荼酚胺刺激。脂肪组织来源的ka-Ι+细胞从脂肪组织，包括肩胛间BAT(BAT)、皮下白色脂肪组织(SQ-WAT)和内脏白色脂肪 组织(EPI-WAT)分离ka-Ι+细胞，并使用以上描述的用于骨骼肌源细胞的方法进 行培养。然后将分离的细胞与BMP7接触。利用油红0染色和RT-PCR确定细胞分化为BAT 的能力。如图9所示，分离自BAT和SQ-WAT的细胞通过分化为BAT应答BMP7处理。 相反，分离自EPI-WAT的ka-Ι+细胞没有。这些视觉观察结果利用RT-PCR进行了证实。从来源于遗传上易于肥胖的小鼠 C57B1/6 (B6)和肥胖抗性小鼠129_S6(129)的BAT (BAT)、皮下白色脂肪组织(SQ-WAT)和内 脏白色脂肪组织(EPI-WAT)中分离^^-1+。从这些小鼠分离的细胞按照上文对来源于肌肉 的细胞的描述与BMP7接触，利用定量RT-PCR评估脂肪形成标记物FAS和BAT特异标记物 UCP-I。如图IOA和IOB所示，从既有肥胖倾向也有肥胖抗性动物中获得的BAT和SQ-WAT 分离的ka-Ι+细胞中FAS和UCP-I的水平均提高。相反，从来自两种动物的EPI-WAT获得 的ka-Ι+细胞中没有观察到FAS水平的增加，并且未能检测到UCP-I。值得一提的是，从肥 胖抗性1 小鼠的BAT或SQ-WAT分离的ka-Ι+细胞中UCP-I表达水平更高，BMP-7预处 理进一步诱导了这些细胞中的UCP-I的表达。
这些观察支持了 ka-1+BAT祖细胞可以从脂肪组织中分离，BMP-7可以诱导BAT标 记物的表达。实施例4 肥胖倾向相对于肥胖抗性动物模型中，存在于肌肉的ka-Ι+细胞的利 用度和功能利用FACS和实施例3中描述的细胞分离方法评估肥胖倾向和C57B1/6 (B6)肥胖 抗性129-S6(U9)小鼠中ka-Ι+细胞的数量。如图11所示，B6和129中的细胞总数大体相同。这一观察提示遗传上易 于肥胖或对肥胖抗性并不影响ka-Ι+细胞数量。为了研究分离自B6和129小鼠的细胞应答BMP7的方式是否存在功能性差别，如 实施例3所述从每种动物中分离ka-Ι+细胞，培养并与BMP7接触。利用RT-PCR评估BAT 特异的标记物UCP-I和脂肪形成标记物PPARK的水平。如图12A和12B所示，BMP7处理使得分离自肥胖抗性小鼠(129)的Sca-I+细胞 UCP-I表达水平增长远远超过在肥胖倾向动物(B6)中观察到的增长。UCP-I的基础水平 在肥胖抗性小鼠(129)中也高于肥胖倾向动物(B6)。相反，PPARy水平在肥胖抗性小鼠 (129)和肥胖倾向动物(B6)中相当。这些观察结果表明，遗传背景是ka-Ι+细胞的褐色脂肪形成潜能的决定因素。实施例5 :BMP7处理的细胞分化为非脂肪细胞谱系的能力研究了在有骨生成和肌原性分化培养基的情况下，有或没有BMP预处理，Sca-I+ 细胞分化为不同细胞谱系的能力。具体来说，分离自肌肉的ka-Ι+细胞在用含有激素和 化学物质的骨生成或肌原性诱导混合液诱导发生分化(Peister et al. , Blood 103(5) 1662-82003)之前，用BMP-7处理。与BMP7接触过的分离自骨骼肌的细胞未进行向 骨生成或肌原性谱系的分化。这些观察表明，BMP7特异地使ka-Ι+细胞分化为BAT细胞。 可以从这些数据得到的另外一个结论是ka-Ι+是可以分化为WAT或BAT的脂肪形成细胞， 但是用BMP7与这些细胞接触使得细胞定向分化为功能性BAT谱系。实施例6 :BMP7处理的祖细胞的体内植入为了确定这些BMP处理的ka-Ι+祖细胞在体内向褐色还是白色脂肪细胞分化，从 基因工程化绿色荧光蛋白(GFP)小鼠分离的BMP7处理的^^-1+细胞被注射到相同遗传背 景但不表达GFP的小鼠的后肢和/或胸骨区。利用这种方法，可以容易地跟踪移植细胞的命运，从而确定细胞是否具备体内自 我更新和分化的能力。从表达GFP的小鼠分离细胞并用实施例3中描述的方法培养。然后如下移植这些 细胞。将大约切IO5细胞直接注射到非GFP受体C57BL/6小鼠的后肢肌肉和侧腹周围的 皮下白色脂肪中。植入10天后，通过落射荧光术测量表明BMP-7处理的ka-Γ细胞在两 个注射部位均发展成GFP+脂肪垫。如图13和图14所示，植入后10天在SQ-WAT组织中检测到植入的BMP7处理 Sca-I+细胞。并且，植入后30天仍可检测到BMP7处理的细胞。这些数据表明BMP7处理的细胞经受了细胞植入，并且在植入后仍有活力。实施例7 :BMP3、BMP4 和 BMP7 处理细胞利用实施例3中描述的方法从骨骼肌中分离的ka-Ι+细胞与BMP3、BMP4或BMP7接触。然后利用定量RT-PCR以及实施例2和3中描述的方法，评估了 UCP-I、CIDEA、PPAR γ、 FAS、肌细胞生成素和MyoD的水平，用于扩增肌细胞生成素的有义和反义标记物分别是5’ -CTACAGGCCTTGCTCAGCTC-3，SEQ ID NO 345’ -TGTGGGAGTTGCATTCACTG-3，SEQ ID NO 35用于扩增MyoD的有义和反义标记物分别是5，-TGGTTCTTCACGCCCAAAAG-3，SEQ ID NO 365，-TCTGGAAGAACGGCTTCGAA-3‘ SEQ ID NO 37用于扩增ACVR-I的有义和反义标记物分别是5’ -TGCTAATGATGATGGCTTTCC-3，SEQ ID NO 385，-TTCACAGTGGTCCTCGTTCC-3，SEQ ID NO 39如图15所示，BMP7和BMP4促进了细胞中BAT特异标记物UCP-1和CIDEA 的表达增加。这些数据表明除了 BMP7，还可以使用BMP4来促进祖细胞分化为BAT。实施例8 细胞植入ka-Ι+细胞还可以包埋在支架、基质或细胞可以附着其上的其他结构以便协助植 入。得到的组织通过一般组织学和免疫组织化学来分析上文描述的褐色和白色特异性标记 物。密切监测体重、葡萄糖和脂质代谢以及与植入有关的整体能量平衡的改变。还将从其他组织分离ka-Ι+祖细胞来确定是否分化产生褐色脂肪细胞的能力是 组织特异性的，所述其他组织包括骨骼肌、前列腺、真皮、心血管系统、乳腺、肝、新生儿皮 肤、颅盖。实施例9 表征定型的前脂肪细胞不同BMP引发多能祖细胞定型为褐色或白色脂肪细胞。具体来说，BMP-2和BMP-4 促进分化为白色脂肪细胞系，而BMP-7促进分化为褐色脂肪细胞系。利用全面的基因组和蛋白组方法对接触了 BMP的ka-Ι+祖细胞进行表征，以便确 定分子标志物和细胞表面标记物，生成能够区分定型的褐色前脂肪细胞、定型的白色前脂 肪细胞和未定型的干细胞的细胞谱。这些谱将被用于根据其产生褐色或白色脂肪细胞的能 力来鉴定和挑选细胞群。基因组学方法将包括利用Affymetric芯片进行表达谱研究以及细胞培养物的 稳定同位素标记(SILAC)用于蛋白组学分析。还将在BMP处理的ka-Ι+祖细胞中研究 MicroRNA。这样，通过研究接触过BMP的ka-Ι+祖细胞的DNA、RNA、蛋白和MicroRNA性质， 可以生成细胞谱，以便用于鉴定能够分化为褐色或白色脂肪细胞谱系的祖细胞群。实施例10 分析褐色和白色祖细胞在糖尿病治疗中的生理相关性将ka-Ι+祖细胞和由BMP-7处理这些细胞得到的成熟褐色脂肪细胞移植到肥胖 小鼠中。然后对动物进行研究评估其体重、代谢和/或糖尿病的变化。用文中描述的方法鉴定的细胞被注射到具有不同肥胖倾向性的试验单位模型中。 合适的动物是肥胖抗性株Ugse/SvEvhc、肥胖倾向株C57BL/6、ob/ob小鼠和db/db小鼠， 后两种小鼠分别是瘦素和瘦素受体缺陷的。还利用Rogers和WelDb描述的方法(RogersP. and Webb G. P.，Br. J. Nutr. 43 :83-86，1980)评估了体重增长和 / 或肥胖。然后进行试验来评价以下各项的效果(1)含有不同量或比率脂肪、碳水化合物 或蛋白的饮食，(2)使用药物制剂，包括抗糖尿病药物罗格列酮(rosiglitazone)进行的治 疗，和/或C3)对照动物(未接受细胞)和实验动物(接受了移植细胞)进行的运动。然后在移植之前和之后以及整个测试过程中对对照和实验动物进行评估。通过分 析动物在体重(通过将活体动物称重)、血清葡萄糖(通过测量活体动物的血清葡萄糖水 平)和/或血清胰岛素(通过测量血清胰岛素水平)方面的变化来测试动物。然后处死 一些动物，用于进一步分析。其他动物用于长期研究。其他动物利用Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS, Columbus Instruments, Columbus, OH)用于代谢评估， 该监测系统能够测量空间活动、食物和液体消耗、温度、产尿、代谢率，以及氧气和二氧化碳 交换。其他实施方案应当理解，尽管本发明是结合其详尽说明书进行的描述，以上说明书是用于阐述 而非限制发明范围，发明范围由所附权利要求的范围所限定。其他方面、改良和变化也包含 在以下权利要求的范围内。
权利要求
1.增加体外细胞群中具有褐色脂肪组织(BAT)细胞特征的细胞的数量的方法，所述方 法包括获得包含干细胞抗原-1阳性(Sca-Ι+)祖细胞的细胞群；以及将所述体外祖细胞群与有效量的能够促进骨形态发生蛋白(BMP)-2、-4、-6或-7中一 或多种的表达增加的化合物接触，接触时间足以使所述细胞群中具有褐色脂肪组织(BAT) 细胞特征的细胞的数量增加；或者，对所述细胞群进行遗传改造，使BMP-2、-4、-6或-7中一或多种的表达水平足以 将所述细胞群中具有BAT细胞特征的细胞数量增加。
2.权利要求1的方法，还包括在第一细胞生长培养基中培养所述祖细胞群，该培养基包含0. I-IOOnM胰岛素和 0. I-IOnM三碘甲腺原氨酸(Τ3)、0· 1_5 μ M异丁基甲基黄嘌呤(IBMX) ,0. l_50mM地塞米松， 和0. Ol-IOmM吲哚美辛；禾口在包含胰岛素和T3的第二细胞生长培养基中培养所述祖细胞群。
3.权利要求1或2的方法，还包括将所述祖细胞群与一或多种下列化合物接触 BMP-U BMP-3、过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPAR(y )、类视黄醇X受体α (RxRa)、 胰岛素、Τ3、噻唑烷二酮(TZD)、维生素Α、视黄酸、胰岛素、糖皮质激素或其激动剂、无翅型 (Wnt)、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转 化生长因子(TGF)-a、TGF-β、肿瘤坏死因子a (TNF a )、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、 血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)。
4.权利要求1的方法，其中所述祖细胞群获得自骨骼肌、前列腺组织、真皮组织、来自 心血管系统的组织、乳腺组织、肝组织、新生儿皮肤、颅盖、骨髓、小肠组织、脂肪组织，以及 脂肪组织沉积物。
5.权利要求1的方法，其中所述祖细胞群从骨骼肌获得。
6.权利要求1的方法，所述祖细胞群包含至少60%ka-Ι+祖细胞。
7.权利要求1的方法，其中所述化合物是BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7激动剂中的一或 多种。
8.权利要求1的方法，其中所述化合物是BMP-7或BMP-4激动剂。
9.权利要求1的方法，其中所述具有BAT细胞特征的细胞与未处理的ka-Ι+祖细胞相 比，表达更高水平的解偶联蛋白(UCP-I)和诱导细胞死亡的DFF45样效应因子A(CIDEA)。
10.权利要求2的方法，其中第一细胞生长培养基包含20nM胰岛素和InM三碘甲腺原 氨酸(T3)、0. 5 μ M异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)、5mM地塞米松和0. 125mM吲哚美辛。
11.细胞群，通过权利要求1-10之一的方法制得。
12.药物组合物，含权利要求11的细胞群和可药用载体。
13.细胞递送系统，包含储存容器以及与该储存容器有液相接触的递送装置，所述储存 容器含有存在于可药用载体中的权利要求11所述的细胞群。
14.促进受试对象的褐色脂肪形成的方法，所述方法包括挑选需要治疗的受试对象；将权利要求1-9之一的方法获得的细胞群给予受试对象，其中所述方法有效地增加受 试对象中具有BAT细胞特征的细胞的数量。
15.权利要求14的方法，其中所述包含干细胞抗原-1阳性(Sca-Ι+)祖细胞的细胞群 从挑选接受治疗的受试对象获得。
16.权利要求14的方法，其中所述受试对象需要治疗肥胖症或与体重相关的疾病。
17.权利要求14的方法，其中所述受试对象需要减少脂肪储存、降低体重，和/或提高 对胰岛素的敏感度。
18.权利要求14的方法，其中所述方法有效地增加受试对象中的褐色脂肪形成。
19.权利要求14的方法，其中所述受试对象是人。
20.权利要求14的方法，其中所述受试对象是食用性动物。全文摘要
治疗肥胖症及相关疾病的方法和组合物。所述方法包括使用经BMP-2、-4、-5、-6和/或-7处理过的Sca-1+祖细胞。
文档编号C12N5/0775GK102083969SQ200980126155
公开日2011年6月1日 申请日期2009年5月6日 优先权日2008年5月6日
发明者曾玉华, 蒂姆.J.舒尔茨 申请人:乔斯林糖尿病中心股份有限公司