宛氏拟青霉的检测方法

专利名称：宛氏拟青霉的检测方法
技术领域：
本发明涉及宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的检测方法。
背景技术：
宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)是自然界分布广泛的不完全真菌。宛氏拟 青霉在其生长周期中形成由双重细胞壁组成的被称为厚垣孢子的无性孢子。已知宛氏拟青 霉的厚垣孢子抗压性能极高，即使在杀灭一般真菌的热和试剂的杀菌条件下也可以生存、 增殖，是霉菌产生的原因所在。因此，宛氏拟青霉在食品工业和化妆品工业中被视作危害菌 而受到重视。为此，在确立防腐、防霉的体制中，宛氏拟青霉的检测、鉴定是极为重要的。宛氏拟青霉的检测和鉴定法都以通过培养进行形态学上的种分类为主。由于该方 法需要持续培养至发生形态学特征，即使最短也需要14天以上的长时间。此外，由于形态 学上的鉴定需要极高的专业性，有根据不同鉴定人鉴定的结果不同的危险性，因而存在鉴 定结果的可靠性的问题。因此，需要确立一种解决了快速性和可靠性问题的检测、鉴定方 法。作为快速并且可靠性高的菌类检测方法，已知有将基因的特定碱基序列作为目 的的扩增法(例如PCR法和LAMP法)(例如，日本特表平11-5057 号公报、日本特开 2006-61152号公报、日本特开2006-304763号公报、以及日本特开2007-174903号公报)。 然而，这些现有技术中并没有阐明宛氏拟青霉的特异性基因区域。因此，存在难以特异性并 且迅速地检测宛氏拟青霉的问题。

发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性、简便且迅速地检测在食品工业和化妆品工业 等中被视作危害菌的宛氏拟青霉的方法。此外，本发明的目的还在于提供能够适用于该方 法的DNA、引物组、寡核苷酸以及检测试剂盒。如上所述难以检测出宛氏拟青霉的原因之一在于，使用现有公知引物用PCR法可 能得出假阳性或者假阴性的结果。本发明人认为其原因在于，目前的宛氏拟青霉的基因数 据库较弱，不能正确地知道宛氏拟青霉的按种保存的基因区域，因而难以设计用于特异性 且迅速地检测、识别宛氏拟青霉的高灵敏度的引物等。鉴于上述问题，本发明人对于可以特异性检测、识别宛氏拟青霉的新的DNA区域 进行了潜心研究。其结果发现在宛氏拟青霉的微管蛋白基因中存在着一个区域，该区 域是具有能够明显区别于其它菌类有的特异性碱基序列的区域(以下，也称为“可变区”)。 此外，还发现以该可变区作为靶点，就能够对上述宛氏拟青霉进行特异性且迅速地检测。基 于上述认识从而完成了本发明。本发明涉及宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的检测方法。其特征在于，使 用以下述(a)或(b)的碱基序列表示的核酸，对宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)进 行鉴定。
(a)序列号1 4和22 33中任意一个所记载的β -微管蛋白基因的部分碱基 序列或其互补序列；(b)由序列号1 4和22 33中任意一个所记载的碱基序列中1个或多个碱基 缺失、置换或附加而成的并且能够用于宛氏拟青霉检测的碱基序列或其互补序列。此外，本发明还涉及用于宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)检测的上述(a) 或(b)的碱基序列表示的DNA。此外，本发明还涉及一种宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)检测用寡核苷酸， 其能够和上述(a)或(b)的碱基序列表示的核酸进行杂交，并且能够作为用于特异性检测 宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的核酸探针或者核酸引物发挥功能。此外，本发明还涉及宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)检测用寡核苷酸对或 寡核苷酸组，该寡核苷酸对或寡核苷酸组由选自下述(c)和(d)的寡核苷酸对、下述(e)和 (f)的寡核苷酸对、下述(e)和(g)的寡核苷酸对以及下述(e)、(f)和(g)的寡核苷酸组 中的至少1对或1组表示；(c)由序列号5中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有 70%以上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，(d)由序列号6中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有 70%以上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，(e)由序列号7中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有 70%以上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，(f)由序列号8中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有 70%以上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，(g)由序列号9中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有 70%以上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸。此外，本发明还涉及含有上述寡核苷酸对或寡核苷酸组的宛氏拟青霉 (Paecilomyces variotii)检测试剂盒。此外，本发明还涉及一种引物组，其是在利用环介导等温扩增(LAMP)法检测宛氏 拟青霉(Paecilomyces variotii)中使用的引物组，其含有以下引物由序列号10中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号11中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号12中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号13中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号14中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、以及由序列号15中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物。此外，本发明还涉及一种引物组，其是在利用环介导等温扩增(LAMP)法检测宛氏 拟青霉(Paecilomyces variotii)中使用的引物组，其含有以下引物由序列号10中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号11中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号12中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、以及由序列号13中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物。
此外，本发明还涉及一种引物组，其是在利用环介导等温扩增(LAMP)法检测宛氏 拟青霉(Paecilomyces variotii)中使用的引物组，其含有以下引物由序列号16中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号17中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号18中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号19中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号20中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、以及由序列号21中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物。此外，本发明还涉及一种引物组，其是在利用环介导等温扩增(LAMP)法检测宛氏 拟青霉(Paecilomyces variotii)中使用的引物组，其含有以下引物由序列号16中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号17中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号18中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、以及由序列号19中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物。另外，本发明还涉及一种宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)检测试剂盒，其含 有在上述LAMP法检测中使用的任一引物组、DNA聚合酶、包含dATP、dCTP、dGTP和 dTTP 的 dNTP。根据本发明，可以提供一种特异性、简便且迅速地检测在食品工业和化妆品工业 等中被视作危害菌的宛氏拟青霉。此外，根据本发明，还可以提供能够适用于该方法的DNA、 引物组、寡核苷酸以及检测试剂盒。


图1 表示由本发明引物组1的引物识别的碱基序列在宛氏拟青霉IFM40913菌株 的微管蛋白基因的碱基序列中的位置关系的图。图2 表示由本发明引物组2的引物识别的碱基序列在宛氏拟青霉IFM40913菌株 和IFM40915菌株的β -微管蛋白基因的碱基序列中的位置关系的图。图3 在实施例1中使用本发明的(c)和(d)的寡核苷酸的PCR产物的电泳图。图4 在实施例1中使用本发明的(c)和(d)的寡核苷酸的PCR产物的电泳图。图5 表示实施例2中利用实时浊度法检测宛氏拟青霉的检测灵敏度的图。1表示 使用来自Paecilomyces variotii IFM40913菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，2表 示使用来自I^aecilomyces variotiiIFM40915菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，4表 示使用来自Byssochlamys nivea IFM51244菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，5表示 使用来自Hamigera avellanea IFM42323菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，7表示使 用来自Talaromyces luteus IFM53242菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度。图6 图6(a)和图6(b)是表示实施例3中利利用实时浊度法检测宛氏拟青霉的 检测灵敏度的图。在图6(a)中，1表示使用来自Paecilomyces variotii IFM40913菌株 的基因组DNA的样品的检测灵敏度，2表示使用来自Paecilomyces variotii IFM40915菌 株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，3表示使用来自Byssochlamys fluva IFM48421菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，7表示使用来自Neosartorya ficheri IFM46945菌 株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，8表示使用来自Neosartorya spinosa IFM46967 菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度。在图6(b)中，9表示使用来自Neosartorya glabra IFM46949菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，10表示使用来自Neosartorya hiratsukae IFM47036菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，11表示使用来自 Alterraria alternate IFM41348菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，12表示使用来 自Aureobasidium pullulans IFM41409菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，14表示使 用来自Fusarium oxysporum IFM50002菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，15表示使 用来自Trichoderma viride IFM40938菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度。图7:在实施例4中使用本发明的(e) (g)的寡核苷酸的PCR产物的电泳图。
具体实施例方式以下，对本发明进行详细说明。本发明是利用宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的β-微管蛋白基因的特定 部分碱基序列、即由宛氏拟青霉的微管蛋白基因序列中存在的宛氏拟青霉的特异性区 域(可变区)的碱基序列表示的核酸，来进行宛氏拟青霉的鉴定，对宛氏拟青霉进行特异性 识别、检测的方法。在此，“可变区”是指微管蛋白基因中易于积累碱基突变的区域，该 区域的碱基序列与其它真菌之间差别较大。本发明中的“宛氏拟青霉”属于线状不完全菌 类的拟青霉属(Paecilomyces)0此外，“ β _微管蛋白”是指构成微管的蛋白质，“ β _微管 蛋白基因”是指编码微管蛋白的基因。在本发明的宛氏拟青霉的检测方法中，使用由下述(a)或(b)的碱基序列表示的 核酸，对宛氏拟青霉进行鉴定。(a)序列号1 4和22 33中任意一个所记载的β -微管蛋白基因的部分碱基 序列或其互补序列；(b)由序列号1 4和22 33中任意一个所记载的碱基序列中的1个或多个碱 基缺失、置换或附加而成的并且能够用于宛氏拟青霉检测的碱基序列或其互补序列。由于由上述(a)或(b)的碱基序列表示的β -微管蛋白基因的可变区是宛氏拟青 霉固有的碱基序列，与其它通常菌类的可变区有明显区别。因此，根据本发明的宛氏拟青霉 的检测方法，可以特异性且迅速地检测宛氏拟青霉。此外，由上述(a)或(b)的碱基序列表 示的DNA也能够用于宛氏拟青霉的检测。基于序列号1和2，对宛氏拟青霉的微管蛋白基因的部分碱基序列进行说明。 另外，由序列号1表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM40913菌株的β -微管蛋白基因 的部分碱基序列，由序列号2表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM40915菌株的β -微 管蛋白基因的部分碱基序列。此外，将由序列号1和2表示的宛氏拟青霉IFM40913菌株和 IFM40915菌株的微管蛋白基因的部分碱基序列的一部分比较并记载在图2中。本发 明人发现在由序列号1和2表示的碱基序列中的50位 100位的区域以及280位 340 位的区域，真菌之间的碱基序列的保守性特别低，并且各菌种具有固有的碱基序列。本发明 将上述微管蛋白基因的部分碱基序列作为靶点。此夕卜，基于序列号3 4和22 33，对宛氏拟青霉的β-微管蛋白基因的部分碱基序列进行说明。由序列号3表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉EU037073菌株的β -微管蛋白 基因的部分碱基序列。由序列号4表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM50293菌株的β -微管蛋白 基因的部分碱基序列。由序列号22表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉NBRC4855菌株的β -微管蛋白 基因的部分碱基序列。由序列号23表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM52147菌株的β -微管蛋白 基因的部分碱基序列。由序列号M表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM52145菌株的β -微管蛋白 基因的部分碱基序列。由序列号25表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM51(^8菌株的β -微管蛋白 基因的部分碱基序列。由序列号沈表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM51195菌株的β -微管蛋白 基因的部分碱基序列。由序列号27表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM55619菌株的β -微管蛋白 基因的部分碱基序列。由序列号28表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉NBRCM79菌株的β -微管蛋白 基因的部分碱基序列。由序列号四表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM51027菌株的β -微管蛋白 基因的部分碱基序列。由序列号30表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉NBRC31967菌株的β -微管蛋 白基因的部分碱基序列。由序列号31表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉NBRC31685菌株的β -微管蛋 白基因的部分碱基序列。由序列号32表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉SUM3339菌株的β -微管蛋白 基因的部分碱基序列。由序列号33表示的碱基序列表示的是宛氏拟青霉IFM50294菌株的β -微管蛋白 基因的部分碱基序列。本发明人发现上述微管蛋白基因的部分碱基序列也同样，真菌之间的碱基 序列的保守性特别低，各菌种具有固有的碱基序列。本发明将上述微管蛋白基因的部 分碱基序列作为靶点。在本发明的检测方法中使用的由宛氏拟青霉的微管蛋白基因的部分碱基序 列(可变区的碱基序列)表示的核酸是由序列号1 4和22 33的任意一个中所记载的 碱基序列或其互补序列表示的核酸。序列号1 4和22 33中记载的碱基序列及其互补序列是分别从宛氏拟青霉的 IFM40913 菌株、IFM40915 菌株、EU037073 菌株、IFM50293 菌株、NBRC4855 菌株、IFM52147 菌 株、IFM52145 菌株、IFM51(^8 菌株、IFM51195 菌株、IFM55619 菌株、NBRCM79 菌株、IFM51027 菌株、NBRC31967菌株、NBRC31685菌株、SUM3339菌株以及IFM5(^94菌株中分离、鉴定的微管蛋白基因的可变区的碱基序列。由于上述序列在宛氏拟青霉中的同源性非常高，而 且与宛氏拟青霉以外的菌类的同源性低，因而，通过确认被检体是否具有上述碱基序列就 可以特异性识别、鉴定宛氏拟青霉。此外，即使使用由在序列号1 4和22 33中记载的碱基序列中1个或多个碱 基缺失、置换或者附加后的碱基序列或其互补序列表示的核酸，也同样地可以特异性识别、 鉴定宛氏拟青霉。(以下，将序列号1 4和22 33中任意一个所记载的碱基序列或其互补序列以 及由序列号1 4和22 33中任意一个所记载的碱基序列或其互补序列中1个或多个碱 基缺失、置换或者附加而成的并且能够用于宛氏拟青霉检测的碱基序列统称为“本发明的 β-微管蛋白基因的可变区的碱基序列”。)作为使用由上述本发明的β-微管蛋白基因的可变区的碱基序列表示的核酸进 行鉴定宛氏拟青霉的方法，没有特别限制，可以用测序法、杂交法、PCR法、LAMP法等通常使 用的遗传工程学的方法进行。在本发明的检测方法中，对于使用由上述本发明的微管蛋白基因的可变区的 碱基序列表示的核酸进行的宛氏拟青霉鉴定，优选确定被检体微管蛋白基因的碱基序 列，并确认在该基因的碱基序列中是否含有上述(a)或(b)中记载的核酸的碱基序列。艮口， 本发明的检测方法是对被检体所具有的β-微管蛋白基因的碱基序列进行解析、确定，并 将已确定的碱基序列与本发明的微管蛋白基因的可变区的碱基序列进行比较，基于其 一致或差别来进行宛氏拟青霉的鉴定。作为解析、确定碱基序列的方法，没有特别限定，可以使用通常进行的RNA或DNA 测序的方法。具体而言，可以列举出Maxam-Gilbert法、桑格法(Sanger method)等电泳法，质 量分析法，杂交法等。在桑格法中，可以列举用放射性标记法、荧光标记法等来标记引物或 者终止子的方法。在本发明中，为了使用由上述本发明的微管蛋白基因的可变区的碱基序列表 示的核酸进行宛氏拟青霉的鉴定检测，可以使用能够与由本发明的微管蛋白基因的可 变区的碱基序列表示的核酸进行杂交、并且作为核酸探针或者核酸引物发挥功能的检测用 寡核苷酸。本发明的检测用寡核苷酸只要是能够用于检测宛氏拟青霉的寡核苷酸即可。即， 可以是用于宛氏拟青霉检测的能够作为核酸引物或核酸探针使用的寡核苷酸、在严格条 件下能够与宛氏拟青霉的微管蛋白基因杂交的寡核苷酸。另外，在此作为“严格的条 件，，，例如可以列举出 Molecular Cloning-Α LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook,David W. Russell. ,Cold Spring Harbor Laboratory Press]所记载的方法，例 如，使含有6 X SSC (IX SSC的组成0. 15M氯化钠、0. 015M柠檬酸钠，pH值7. 0),0. 5% SDS, 5 X Denhardt，s溶液以及100mg/mL鲱鱼精DNA溶液与探针在65°C下保温8 16小时进行 杂交的条件。作为本发明的上述检测用寡核苷酸，更优选作为由上述(a)或(b)的碱基序列表 示的核酸中的区域的、由序列号5 21中任意一个所记载的碱基序列或其互补序列表示的 寡核苷酸。此外，本发明的检测用寡核苷酸也可以是由与序列号5 21中任意一个所记载的碱基序列具有70%以上同源性的碱基序列或其互补序列表示的寡核苷酸，进一步优选同 源性为80%以上的寡核苷酸，进一步优选同源性为85%以上的寡核苷酸，更进一步优选同 源性为90%以上的寡核苷酸，特别优选同源性为95%以上的寡核苷酸。此外，可以用于本 发明的检测用寡核苷酸中还包括以下寡核苷酸由序列号5 21中任意一个所记载的碱基 序列或其互补序列中1个或多个、优选为1 5个、更优选为1 4个、进一步优选为1 3个、更进一步优选为1 2个、特别优选为1个碱基的缺失、插入或置换等突变、或修饰而 成的碱基序列表示的寡核苷酸。此外，也可以在序列后5 21中任意一个所记载的碱基序 列或其互补序列上附加上适当的碱基序列。关于碱基序列的同源性，按照Lipman-Pearson法Science，227，1435，1985)等计 算得到。具体而言，可以使用基因信息处理软件Genetyx-Win (Software开发制作)的同源 解析(Search homology)程序，将参数Unit size to compare (ktup)设定为2进行解析来算出。上述检测用寡核苷酸的键合方式不仅可以是天然核酸中存在的磷酸二酯键，还可 以是例如氨基磷酸酯键(phosphoroamidate bond)、硫代磷酸酯键等。本发明的检测用寡核苷酸可以用作核酸引物和核酸探针。核酸探针可以通过标记 物来标记上述寡核苷酸从而进行制备。作为上述标记物没有特别限制，可以使用放射性物 质、酶、荧光物质、发光物质、抗原、半抗原、酶底物、不溶性载体等通常使用的标记物。标记 方法可以是末端标记，也可以是在序列中间标记，还可以对糖、磷酸基、碱基部分进行标记。 所涉及的标记的检测方法，可以列举例如在用放射性同位素标记核酸探针时使用的放射自 显影法等、在用荧光物质标记时使用的荧光显微镜等、在用化学发光物质标记时使用的感 光薄膜解析或使用CCD照相机的数码解析等。此外，上述寡核苷酸可以与固相载体结合作为捕捉探针使用。该情况下，可以联合 捕捉探针和标记核酸探针组合来进行夹心杂交(sandwich assay)，也可以对目的核酸进行 标记、捕捉。在本发明的检测法中，为了鉴定、检测宛氏拟青霉，优选使用寡核苷酸作为核酸探 针来进行杂交，所述寡核苷酸是由序列号5 21中任意一个所记载的碱基序列号其互补序 列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列或其互补序列具有70%以上同源性并且可以作为 检测用寡核苷酸使用的寡核苷酸，进一步优选使用由序列号5 21中任意一个所记载的碱 基序列表示的寡核苷酸。为了检测被检体中的宛氏拟青霉，可以将由序列号5 21中任意一个所记载的碱 基序列号其互补序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列或其互补序列具有70%以上同 源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的寡核苷酸标记，作为核酸探针，使得到的核酸探 针与DNA或RNA杂交，再利用适当的检测法对已杂交的探针的标记进行检测。上述核酸探 针由于和宛氏拟青霉的微管蛋白基因可变区的一部分特异性杂交，因而可以迅速并且 简便地检测被检体中的宛氏拟青霉。作为测定已与DNA或RNA杂交的核酸探针的标记的方 法，可以使用通常的方法(FISH法、点杂法(dot blot法)、DNA杂交(southern blot) ,RNA 杂交(northern blot)等)。此外，在本发明的检测方法中，为了使用由上述本发明的微管蛋白基因可变 区的碱基序列表示的核酸来进行宛氏拟青霉的鉴定，优选对含有该碱基序列的全部或一部分区域的DNA片段进行扩增，确认有无扩增产物。作为对含有该区域的DNA片段进行 扩增的方法，没有特别限制，可以使用PCR(Polymerase Chain Reaction)法、LCR(Ligase Chain Reaction)法、SDA(Strand Displacement Amplification)法、NASBA(Nucleic Acid Sequence-based Amplification)法、RCA (Rolling-circle Amplification)法、LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification)法等通常的方法。但是，在本发明中，优选使用PCR 法或LAMP法。在本发明中，对于利用PCR法进行扩增反应从而进行宛氏拟青霉检测的情况进行 了说明。作为由本发明的上述检测用寡核苷酸组成的引物，优选能够与以下区域进行杂交 的寡核苷酸，所述区域是选自上述本发明的微管蛋白基因的可变区的碱基序列的区域 并且满足以下4个条件(1)含有宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)所固有的基因的 碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域，(2)寡核苷酸的GC含量大约为30% 80%， (3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm(熔解温度melting temperature) 值大约为 65°C。在上述(1)中“宛氏拟青霉所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的 区域”是指，即使在上述本发明的微管蛋白基因的可变区中，不同种之间的碱基序列的 保守性特别低(即，宛氏拟青霉的特异性特别高)，宛氏拟青霉所固有的碱基序列中以大约 10个碱基连续出现的区域。此外，上述(3)中“寡核苷酸的自退火的可能性低”是指从引物 的碱基序列预测引物之间不会互相结合。作为本发明的检测用寡核苷酸的碱基数，没有特别限定，但优选为13个碱基 30 个碱基，更优选为18个碱基 23个碱基。杂交时的寡核苷酸的Tm值优选为在55°C 65°C 的范围内，更优选为在59°C 62°C的范围内。寡核苷酸的GC含量优选为30% 80%，更 优选为45% 65%，最优选为55%左右。此外，在使用由序列号1或2记载的β -微管蛋白基因的部分碱基序列或其互补 序列、或者该碱基序列或其互补序列中的1个或多个碱基缺失、置换或附加而成的并且能 够用于宛氏拟青霉检测的碱基序列表示的核酸来进行宛氏拟青霉的鉴定的情况下，优选对 作为序列ι或2中记载的碱基序列的一部分的该碱基序列的50 100位和/或280 340 位的碱基序列的全部或一部分进行扩增，或者对该碱基序列中的1个或多个碱基缺失、置 换或附加后的碱基序列的全部或一部分进行扩增。该情况下，作为寡核苷酸的碱基数，没有 特别限定，但优选为13个碱基 30个碱基，更优选为18个碱基 23个碱基。为了利用PCR法进行扩增反应来检测宛氏拟青霉，优选将下述(C)或(d)的寡核 苷酸作用核酸引物，进一步优选使用由优选序列号5中记载的碱基序列表示的寡核苷酸以 及由优选序列号6中记载的碱基序列表示的寡核苷酸。(C)由序列号5中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有 70%以上的同源性并且可以作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸。(d)由序列号6中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有 70%以上的同源性并且可以作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸。另外，本发明的宛氏拟青霉检测用寡核苷酸对是由上述(C)的寡核苷酸和上述 (d)的寡核苷酸组成的寡核苷酸对。
由序列号5和序列号6表示的寡核苷酸存在于宛氏拟青霉的β -微管蛋白基因区 域，是具有和可变区的一部分碱基序列或其互补序列相同的碱基序列的寡核苷酸。上述寡 核苷酸可以和宛氏拟青霉的DNA的一部分特异性杂交。由上述(c)和(d)表示的寡核苷酸分别对应于序列号1中记载的碱基序列中的第 64位 第85位、第306位 第325位的区域。因此，通过使上述寡核苷酸与宛氏拟青霉的 β-微管蛋白基因杂交，可以特异性检测宛氏拟青霉。此外，在本发明中，为了利用PCR法进行扩增反应来检测宛氏拟青霉，优选将下述 (e)的寡核苷酸、以及(f)的寡核苷酸以及/或者(g)的寡核苷酸用作核酸引物，进一步优 选使用由序列号7中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、以及由序列号8中记载的碱基序列 表示的寡核苷酸以及/或者由序列号9中记载的碱基序列表示的寡核苷酸，特别优选使用 由序列号7中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、由序列号8中记载的碱基序列表示的寡核 苷酸和由序列号9中记载的碱基序列表示的寡核苷酸。(e)由序列号7中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有 70%以上的同源性并且可以作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，(f)由序列号8中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有 70%以上的同源性并且可以作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，(g)由序列号9中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有 70%以上的同源性并且可以作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸。此外，本发明的宛氏拟青霉检测用寡核苷酸对(寡核苷酸组)是由上述(e)的寡 核苷酸和上述(f)的寡核苷酸组成的寡核苷酸对、由上述(e)的寡核苷酸和上述(g)的寡 核苷酸组成的寡核苷酸对、以及由上述(e)的寡核苷酸和上述(f)的寡核苷酸组成的寡核 苷酸对和上述(g)的寡核苷酸组成的寡核苷酸对。由序列号7、序列号8和序列号9表示的寡核苷酸存在于宛氏拟青霉的β -微管 蛋白基因区域，是具有和可变区的一部分碱基序列或其互补序列相同的碱基序列的寡核苷 酸。上述寡核苷酸可以和宛氏拟青霉的DNA的一部分特异性杂交。以上述(e)和(f)表示的寡核苷酸分别对应于序列号22中记载的碱基序列中的 第98位 第116位、第266位 第285位的区域。由上述(e)和(g)表示的寡核苷酸分别 对应于序列号28中记载的碱基序列中的第92位 第110位、第261位 第280位的区域。 因此，通过使上述寡核苷酸与宛氏拟青霉的微管蛋白基因进行杂交，可以特异性检测 宛氏拟青霉。本发明中的PCR反应的条件，只要可以将目的DNA片段扩增至可以检测的程度，则 没有特别的限制。作为PCR的反应条件的优选的一个例子，例如，使双链DNA变成单链DNA 的热变性反应在95 98°C下进行10 60秒，引物组与单链DNA杂交的退火反应在约59°C 下进行约60秒，在DNA聚合酶的作用下的延伸反应在约72°C下进行约60秒，以此为一次循 环，进行约30 35次循环。在本发明中，可以采用通常的方法对利用PCR法扩增后的基因片段进行确认。例 如可以列举出在基因扩增反应时将用放射性物质等标记过的核苷酸加入的方法，将PCR反 应产物进行电泳以确认是否具有与已扩增的基因产物的大小相对应的条带的方法，解读 PCR反应产物的碱基序列的方法，在已扩增的DNA双链之间加入荧光物质使其发光的方法等，但本发明并不限定于这些方法。在本发明中，优选在基因扩增处理后进行电泳，确认是 否具有与已扩增的基因的大小相对应的条带的方法。在被检测体中含有宛氏拟青霉的情况下，将本发明的寡核苷酸对作为引物组使用 进行PCR反应，将得到的PCR反应产物进行电泳，确认出这些菌类的特异性DNA片段的扩 增。具体而言，用上述(c)和(d)的寡核苷酸作为核酸引物时，可以确认约250bp的DNA片 段的扩增；用上述(e)的寡核苷酸、以及(f)的寡核苷酸以及/或者(g)的寡核苷酸作为核 酸引物时，可以确认约200bp的DNA片段的扩增。通过进行这些操作，可以确认被检测体是 否含有宛氏拟青霉。在本发明中，在利用LAMP法使含有可变区的DNA片段扩增的情况下，由于不需要 周期性的温度变化控制，可以在恒温下进行互补链合成反应。因此，可以简便且迅速检测出 检测体中所含有的特定的菌类。LAMP法是不需要周期性温度变化控制的环介导等温扩增法(国际公开第 00/28082号小册子)，通过使引物的3’侧与作为模板的核酸退火成为互补链合成的起点， 同时使退火的引物与此时形成的环状结构结合，从而可以在等温下进行互补链合成反应。 在该LAMP法中，至少需要4个识别作为模板的核酸的6个碱基序列区域的引物。这些引物 由于通常被设计成其3’侧与作为模板的核酸退火，可以重复进行基于碱基序列的互补结合 的检查机制，从而可以进行高灵敏度且高特异性的核酸扩增反应。LAMP法所用的引物识别的6个碱基序列区域，从作为模板的核酸的5’侧顺次叫做 F3、F2、F1，从3，侧顺次叫做B3c、B2c、Blc，此外，F1、F2、F3的互补碱基序列分别叫做Flc、 F2c、F3c，Blc、B2c、B3c的互补碱基序列分别叫做Bi、B2、B3。上述6个碱基序列区域可以用以下方法选择，但是本发明并不限于此。对作为检测对象的菌种基因的碱基序列进行比对(alignment)，使用I^rimer Explorer V4(荣研化学HP)等软件，设计多个引物。合成这些引物，实际进行LAMP反应，采 用可以特异性检测宛氏拟青霉的引物。详细地说，1.使用Clustal X等比对软件，制作作为检测对象的菌种的目的区域的碱基序列 的信息的比对档案。2.基于比对档案中的信息，使用I^rimer Explorer V4(荣研化学HP)来设计引物。3.从所设计的引物组的候补中，选择稳定地(难形成dimer结构)、延伸方向的前 端含有较多突变(菌种的特异性突变)的引物组。特别是内引物的延伸方向上含有较多突 变的话可以与相近菌种区别的可能性越高。无法进行引物组候补的情况下，将引物设计成 其Tm值和弓I物的碱基数的设定具有较宽的范围。4.实际使用所选择的引物组进行试验，确认有效性。确认有效性后，设计环状引 物，从而缩短反应时间。LAMP法所用的引物设计，首先，从目的区域的碱基序列确定上述6个碱基序列区 域，其后，设计下述的内引物F和B以及外引物F和B。LAMP法所用的“内引物”是指，识别目的碱基序列上的特定核苷酸序列区域，且在 3’侧具有提供合成起点的碱基序列，同时在5’侧具有相对于以此引物为起点的核酸合成反 应产物的任意区域互补的碱基序列的寡核苷酸。其中，将含有在3’侧具有上述F2区域、并且在5’侧具有Flc区域的碱基序列的引物称为内引物F(以下，称为FIP)，将含有在3’侧 具有上述B2区域、并且在5’侧具有Blc区域的碱基序列的引物称为内引物B(以下，称为 BIP)。此内引物在F2区域和Flc区域之间，或者在B2区域和Blc区域之间，也可以具有碱 基数为0 50的任意长度的碱基序列。另一方面，“外引物”是指，具有识别目的碱基序列上的“某个特定的核苷酸碱基序 列”且提供合成起点的碱基序列的寡核苷酸，该“某个特定的核苷酸碱基序列”存在于“某个 特定核苷酸序列区域”(例如上述F2区域或者B2区域)的5’末端侧；可以列举出含有选 自F3区域的碱基序列的引物以及含有选自B3区域的碱基序列的引物。此处，将含有选自 F3区域的碱基序列的引物称为“外引物F” (以下，称为“F3引物”)，将含有选自B3区域的 碱基序列的引物外称为“引物B” (以下，称为“B3引物”)。这里，各个引物中的F是表示与目的碱基序列的反义链互补结合，并提供合成起 点的引物；各个引物中的B是表示与目的碱基序列的正义链互补结合，并提供合成起点的 引物。在LAMP法中的核酸的扩增中，优选除了使用内引物和外引物以外，还使用环状引 物(loop primer)(以下，称为“LF”、“LB”)。环状引物是指，在用LAMP法扩增的产物的同 一条链上的互补序列互相退火形成环状时，在其3’侧含有与这个环内序列互补的碱基序列 的引物(每一个对应构成双链的每条链)。即，是具有与哑铃结构的5’侧的环状结构的单 链部分的碱基序列互补的碱基序列的引物。如果使用该引物，则由于增加了核酸合成的起 点，就可以缩短反应时间和提高检测灵敏度(国际公开第02/24902号小册子)。环状引物的碱基序列如果与上述 铃结构的5’侧的环状结构的单链部分的碱基 序列互补，就可以从目的区域的碱基序列或者其互补链中选择环状引物的碱基序列，也可 以从其它碱基序列中选择。此外，环状引物可以是1种，也可以是2种。如果利用上述至少4种以上的引物，对含目的区域的DNA片段进行扩增的话，就能 使该DNA片段的量扩增至可以特异性且高效地检测出的量。因此，通过确认扩增产物的有 无，可以检测出特定的菌种。在LAMP法中可以使用的引物优选为15个碱基以上，进一步优选为20个碱基以 上。此外，各引物可以是单一的碱基序列的寡核苷酸，也可以是多个碱基序列的寡核苷酸的 混合物。此外，在LAMP法中可以使用的外引物也可以用于使含目的区域的DNA片段扩增的 PCR法中。在PCR法中，如果使用上述引物，将被检测体中的β-微管蛋白基因作为模板，并 用耐热性DNA聚合酶进行PCR的话，则可以使目的DNA片段扩增。接着，对于利用LAMP法检测宛氏拟青霉情况下优选使用的引物组进行说明。为了 特异性检测宛氏拟青霉，更优选使用下述引物组(引物组1)。用于检测宛氏拟青霉的引物组1LPae 1F3 引物ACGATCCTATAGGCAGACCA (序列号 10)LPae 1B3 引物CCAGCGGCCTATTTATTGGT (序列号 11)LPaelFIP 引物CGTCTCTCTCGATTCCGTGTCGCCTTGACGGCTCTGGTGT (序列号 12)LPaelBIP 引物CTCCGACCTTCAGCTCGAGCGGAGCGTTCCTCTTGGGAT (序列号 13)为了检测宛氏拟青霉，优选除了上述引物以外还使用环状引物。作为环状引物，优选使用下述引物。用于检测宛氏拟青霉的环状引物LPaelLF 引物TCCCCAGATATCGTGTACTTAC (序列号 14)LPaelLB 引物ACTTCAACGAGGTAGTTGTTG (序列号 15)图1中表示上述引物识别的碱基序列在宛氏拟青霉IFM40913菌株的β -微管蛋 白基因的碱基序列中的位置关系。在本发明中，优选利用LAMP法使用下述引物组(弓丨物组2)检测宛氏拟青霉。用于检测宛氏拟青霉的引物组2LPae2F3 引物CGATATCTGGGGATGCTTCG (序列号 16)LPae2B3 引物CGTCCATGGTACCAGGCT (序列号 1了)LPae2FIP 弓丨物ATGCGCTCGAGCTGAAGGTCCGGAATCGAGAGAGAGACGACT (序列号 18)
LPae2BIP 引物TGATCCCAAGAGGAACGCCCCACGAGGAACGTACTTCTTGCC (序列号 19)为了检测宛氏拟青霉，优选除了上述引物以外还使用环状引物。作为环状引物，优 选使用下述引物。用于检测宛氏拟青霉的环状引物LPae2LF 引物GGAGGAGCCATTGTAGCTAA (序列号 20)LPae2LB 弓丨物GAGCTCACCAATAAATAGGCC (序列号 21)图2中表示上述引物识别的碱基序列在宛氏拟青霉IFM40913菌株和IFM40915菌 株的微管蛋白基因的碱基序列中的位置关系。本发明的用于检测宛氏拟青霉的引物组是在LAMP法检测中使用的引物组，其特 征在于，含有以下引物由序列号10中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序 列号11中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号12中记载的碱基序列表 示的寡核苷酸组成的引物、由序列号13中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物。上 述引物组优选还含有由序列号14和序列号15中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引 物。此外，本发明的其它用于检测宛氏拟青霉的引物组是在LAMP法检测中使用的引 物组，其特征在于，含有以下引物由序列号16中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的 引物、由序列号17中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号18中记载的碱 基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号19中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成 的引物。上述引物组优选还含有由序列号20和序列号21中记载的碱基序列表示的寡核苷 酸组成的引物。通过使用上述引物组，可以利用LAMP法特异性、迅速并且高灵敏度地对含有宛氏 拟青霉的微管蛋白基因的目的区域的DNA片段进行扩增。因此，在该DNA片段的扩增 被确认时，可以判断被检测体中存在宛氏拟青霉。此外，作为本发明的用于检测宛氏拟青霉的寡核苷酸，其优选形式是，在从微 管蛋白基因的碱基序列所选出的目的区域的5’侧，作为碱基序列区域选择F3、F2以及F1， 从上述目的区域的3，侧，作为碱基序列区域选择B3c、B2c以及Blc，并且将上述B3c、B2c 以及Blc的互补碱基序列分别作为B3、B2以及Bi，将上述F3、F2以及Fl的互补碱基序列 分别作为F3c、F2c以及Flc时，由对应于下述(a’) (f’)中任意一个的碱基序列表示。
(a’ )在3’侧具有上述B2区域、且在5’侧具有上述Blc区域的碱基序列，(b’ )具有上述B3区域的碱基序列，(c’ )在3’侧具有上述F2区域、且在5’侧具有上述Flc区域的碱基序列，(d’ )具有上述F3区域的碱基序列，(e’ )具有与上述Bl区域和上述B2区域之间的部分互补的序列的碱基序列，(f’ )具有与上述Fl区域和上述F2区域之间的部分互补的序列的碱基序列。本发明的寡核苷酸不仅可以作为LAMP法所用的引物，而且还可以作为PCR法等的 引物、核酸检测用探针等使用。用LAMP法扩增含有目的区域的DNA片段时所用的酶，只要是通常所用的则没有特 别限制，优选为具有链置换活性的模板依赖性核酸合成酶。作为这样的酶，可以列举出Bst DNA聚合酶(大片段(large fragment) )、Bca (exo_) DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，优选为Bst DNA聚合酶(大片段)。本发明中可以用的酶可以是从病毒或者 细菌等纯化而成，也可以是利用基因重组技术制造而成。另外，这些酶也可以是经片段化或 者氨基酸置换等改变而成。利用LAMP法使含有目的区域的DNA片段扩增时的温度没有特别限制，优选为 55 68"C、更优选为60 65"C。可以采用通常的方法，对含有目的区域的DNA片段的扩增进行确认。在利用LAMP 法使含有目的区域的DNA片段扩增的情况下，例如，也可以利用特异性识别已扩增的碱基 序列的标记寡核苷酸作为探针进行杂交，用荧光嵌入燃料法(日本特开2001-242169号公 报)检测，或者，将反应结束后的反应液直接在琼脂糖凝胶上进行电泳以检测器条带。在琼 脂糖凝胶电泳中，LAMP扩增产物被检测出其碱基长度不同的众多条带呈阶梯(梯子)状。此外，在LAMP法中，由于核酸的合成造成底物被大量消耗，作为副产物的焦磷酸 离子与共存的镁离子反应生成焦磷酸镁。焦磷酸镁一旦生成，反应液就会出现肉眼可以确 认程度的白色浑浊。以此白色浑浊为指标，用可以对反应结束后或反应中的浊度上升进行 实时的光学观测的测定仪器进行检测。例如，用分光光度计确认400nm的吸光度的变化，就 可以检测出核酸的扩增反应(国际公开第01/83817号小册子)。在本发明中，为了使含有目的区域的DNA片段扩增所使用的引物，可以基于设计 的序列进行化学合成，也可以从试剂生产商购买。具体而言，可以使用寡核苷酸合成装置来 合成。此外，还可以使用在合成后利用吸附柱、高速液体层析或电泳法精制后的产物。此 外，具有1个或多个碱基置换、缺失、插入或者附加后的碱基序列的寡核苷酸也可以使用公 知的方法合成。在本发明中，作为被使用的检测体没有特别限制，可以使用饮食品本身、饮食品的 原材料、分离的菌体、培养的菌体等。作为从被检测体制备DNA的方法，只要得到的DNA是可以进行宛氏拟青霉检测所 需的充分纯度和量的话，则对此没有特别限制，可以使用未精制的状态，也可以经过分离、 提取、浓缩、精制等前处理后再使用。例如，可以通过苯酚和氯仿提取进行精制，也可以使用 市售的提取试剂盒进行精制后提高核酸纯度再使用。此外，还可以使用逆转录被检测体中 的RNA所得到的DNA。使用本发明的引物组含有目的区域的DNA片段进行扩增时，所必需的各种试剂类可以预先包装成为试剂盒。例如，本发明的试剂盒含有可以用于LAMP法的上述引物组(优选为以下引物组 含有由序列号10 13中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物的引物组、含有由序 列号10 15中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物的引物组、含有由序列号16 19中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物的引物组、含有由序列号16 21中记载 的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物的引物组)、DNA聚合酶、包含dATP、dCTP、dGTP以 及dTTP的dNTP。本发明的试剂盒优选含有上述引物组、作为环状引物所必需的各种寡核 苷酸(优选为由序列号7和8中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物)、作为核酸合 成底物的4种dNTP (dATP、dCTP、dGTP以及dTTP)、具有链置换活性的模板依赖性核酸合成 酶等DNA聚合酶、以及提供给酶反应适合条件的缓冲液、作为辅助因子的盐类(镁盐或者锰 盐等)、稳定酶或者模板的保护剂，进一步根据需要还含有检测反应产物所必需的试剂类。 本发明的试剂盒也可以含有阳性对照(positive control)，其用来确认利用本发明的引物 的LAMP反应是否正常进行。作为阳性对照，例如，可以列举出含有由本发明的方法所扩增 的区域的DNA。此外，本发明的宛氏拟青霉检测试剂盒含有寡核苷酸对或寡核苷酸组作为核酸引 物，该寡核苷酸对或寡核苷酸组由选自上述(c)和(d)的寡核苷酸对、上述(e)和(f)的寡 核苷酸对、上述(e)和(g)的寡核苷酸对、以及上述(e)、(f)和(g)的寡核苷酸对中的至少 1对或1组表示。该试剂盒优选用于利用PCR法来检测宛氏拟青霉的方法中。本发明的试 剂盒除了含有上述核酸引物以外，还根据需要含有标记检测物质、缓冲液、核酸合成酶(DNA 聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等)、酶底物(dNTP、rNTP等)等、菌类检测中通常所用的物 质。本发明的试剂盒中也可以含有为了确认利用本发明的引物的PCR反应是否正常进行的 阳性对照。作为阳性对照，例如，可以列举出含有由本发明的方法所扩增的区域的DNA。根据本发明的方法，可以在约60 120分钟的短时间内进行从被检测体的制备工 序到菌类的检测工序。实施例以下，基于实施例进一步详细地说明本发明，但是本发明并不限于这些实施例。实施例1利用PCR法确定宛氏拟青霉的β-微管蛋白基因的碱基序列将供试菌放置在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基中，在25°C下暗处培养7天。使用 Gen Torukun (Takara Bio (株)社生产)，从菌体中提取DNA。作为目的部位的PCR扩增， 使用 PuRe TaqTMReady-To-Go PCR Beads (GE Health Care UK LTD 生产)，作为引物使用 B t2a (5，-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3，，序列号 34)、Bt2b (5，-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC -3，，序列号 35) (Glass and Donaldson, Appl Environ Microbiol 61 :1323-1330，1995)。 扩增条件为β -微管蛋白部分长度的变性温度为95°C，退火温度为59°C，延伸温度为72°C， 实施；35 次循环。PCR 产物使用 Auto SegTM G-50 (Amersham Pharmacia Biotech 社生产) 进行纯化。PCR 产物使用 BigDye (注册商标)terminator Ver. 1. 1 (Applied Biosystems 社 生产)标记，以 ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems 社生产)实施电 泳。在从电泳时的荧光信号来确定碱基序列时，使用软件“ATGC Ver. 4”(GenetyX社生产)。(2)引物的制备基于上述得到的宛氏拟青霉的β-微管蛋白序列、以同样方法确定的Hamigeraavellanea> Talaromyces flavus> Talaromyces luteus、Talaromyces trachyspermus> Byssochlamys nivea、Byssochlamys fulva的β -微管蛋白序列以及各种菌类的公知的 β-微管蛋白序列，使用DNA解析软件(Clustal W)进行比对解析，确定宛氏拟青霉的特异 的碱基序列区域(序列号1 4和22 33)。从确定区域中3’末端侧的宛氏拟青霉的特 异性特别高的区域，对满足如下4个条件的区域进行研究(1)存在种固有的碱基序列的数 个碱基，(2)GC含量大约为30% 80%，(3)自退火的可能性低，(4) Tm值大约为55°C 65°C左右。基于该碱基序列设计5组引物组，该引物组含有由序列号5和6中记载的碱基 序列表示的寡核苷酸组成的引物，该引物是委托Sigma Aldrich Japan公司合成(脱盐纯 化品，0.02 μ mol等级)并购入的。(3)被检测体的制备作为用于评价已设计的引物的有效性的真菌类，即宛氏拟青霉及其它耐热菌和一 般霉菌，使用表1和表2中记载的菌。作为这些菌类，购入使用的是保管在千叶大学医学部 真菌医学研究中心并利用IFM序号管理的菌类。在最适条件下培养各菌体。培养条件为使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(商品名 Pearlcore马铃薯葡萄糖琼脂培养基，荣研化学株式会社生产)，一般霉菌在25°C、耐热霉 菌在30°C下培养7天。表1:
权利要求
1.一种宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的检测方法，其特征在于，使用由下述(a)或(b)的碱基序列表示的核酸来进行宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的鉴定，(a)序列号1 4和22 33中任意一个所记载的β-微管蛋白基因的部分碱基序列 或其互补序列，(b)由序列号1 4和22 33中任意一个所记载的碱基序列中的1个或多个碱基缺 失、置换或附加而成的并且能够用于宛氏拟青霉检测的碱基序列或其互补序列。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，为了进行鉴定，确定被检测菌的微管蛋白基因区域的碱基序列，确认该区域的碱 基序列中是否含有所述(a)或(b)的碱基序列。
3.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，为了进行鉴定，对所述(a)或(b)的碱基序列的全部或一部分进行扩增，确认有无扩增产物。
4.如权利要求3所述的检测方法，其中，通过聚合酶链反应(PC 法来进行所述扩增反应。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，将能够与以下区域杂交的寡核苷酸用作核酸引物进行基因扩增反应，所述区域是由所 述(a)或(b)中记载的碱基序列表示的核酸中的区域并且满足下述4个条件⑴ (4)(1)含有宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)所固有的基因的碱基序列以大约10个 碱基连续出现的区域，(2)寡核苷酸的GC含量为30% 80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值为55 65°C。
6.如权利要求4或5所述的检测方法，其中，将下述(c)和(d)的寡核苷酸、或者下述(e)的寡核苷酸以及(f)的寡核苷酸和/或 (g)的寡核苷酸用作核酸引物，进行所述聚合酶链反应(PCR)法，(c)由序列号5中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70%以 上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，(d)由序列号6中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70%以 上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，(e)由序列号7中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70%以 上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，(f)由序列号8中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70%以 上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，(g)由序列号9中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70%以 上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸。
7.如权利要求3所述的检测方法，其中，通过环介导等温扩增(LAMP)法来进行所述扩增反应。
8.如权利要求7所述的检测方法，其中，使用引物组，所述引物组含有由序列号10 13或序列号16 19中记载的碱基序列 表示的寡核苷酸。
9.如权利要求7所述的检测方法，其中，使用含有由序列号10 13中记载的碱基序列表示的寡核苷酸的引物组，还使用由序 列号14中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物和/或由序列号15中记载的碱基序 列表示的寡核苷酸组成的引物。
10.如权利要求7所述的检测方法，其中，使用由序列号16 19中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物组，还使用由序 列号20中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物和/或由序列号21中记载的碱基序 列表示的寡核苷酸组成的引物。
11.一种用于宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)检测的DNA，由下述(a)或(b)的 碱基序列表示(a)序列号1 4和22 33中任意一个所记载的β-微管蛋白基因的部分碱基序列 或其互补序列，(b)由序列号1 4和22 33中任意一个所记载的碱基序列中的1个或多个碱基缺 失、置换或附加而成的并且能够用于宛氏拟青霉检测的碱基序列或其互补序列。
12.一种宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)检测用寡核苷酸，能够与由下述(a)或 (b)的碱基序列表示的核酸杂交，并且能够作为用于特异性检测宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的核酸探针或者核酸引物发挥功能，(a)序列号1 4和22 33中任意一个所记载的β-微管蛋白基因的部分碱基序列 或其互补序列，(b)由序列号1 4和22 33中任意一个所记载的碱基序列中的1个或多个碱基缺 失、置换或附加而成的并且能够用于宛氏拟青霉检测的碱基序列或其互补序列。
13.如权利要求12所述的宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)检测用寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸是由(a)或(b)的碱基序列表示的核酸中的区域，由所述序列号5 21 中任意一个所记载的碱基序列或其互补序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列或其互 补序列具有70%以上的同源性并且能够作为检测用寡核苷酸使用的寡核苷酸。
14.如权利要求12或13所述的宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)检测用寡核苷 酸，其中，从选自宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的β -微管蛋白基因的碱基序列的目的 区域的序列的5’侧，按顺序选择作为碱基序列区域的F3、F2和F1，从所述目的区域的3’侧，按顺序选择作为碱基序列区域的B3c、B2c和Blc，将所述F3、F2和Fl的互补碱基序列分别作为F3c、F2c和Flc，将所述B3c、B2c和Blc的互补碱基序列分别作为B3、B2和Bi，此时，所述寡核苷酸由对应于下述(a’ ) (f，)中任意一个的碱基序列表示，(a’ )在3’侧具有所述B2区域、且在5’侧具有所述Blc区域的碱基序列，(b’ )具有所述B3区域的碱基序列，(c’ )在3’侧具有所述F2区域、且在5’侧具有所述Flc区域的碱基序列，(d’ )具有所述F3区域的碱基序列，(e’ )具有与所述Bl区域和所述B2区域之间的部分互补的序列的碱基序列，(f’ )具有与所述Fl区域和所述F2区域之间的部分互补的序列的碱基序列。
15.如权利要求12 14中任意一项所述的宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)检 测用寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸为核酸引物。
16.如权利要求12 15中任意一项所述的宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)检 测用寡核苷酸，其特征在于，所述检测用寡核苷酸是能够与以下区域杂交的寡核苷酸，所述区域是由所述(a)或 (b)中记载的碱基序列表示的核酸中的区域并且满足下述4个条件(1) (1)含有宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)所固有的基因的碱基序列以大约10个 碱基连续出现的区域，(2)寡核苷酸的GC含量为30% 80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值为55 65°C。
17.一种宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)检测用寡核苷酸对或寡核苷酸组，由 选自下述(c)和(d)的寡核苷酸对、下述(e)和(f)的寡核苷酸对、下述(e)和(g)的寡核 苷酸对、以及下述(e)、(f)和(g)的寡核苷酸组中的至少1对或1组表示，(c)由序列号5中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70%以 上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，(d)由序列号6中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70%以 上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，(e)由序列号7中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70%以 上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，(f)由序列号8中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70%以 上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸，(g)由序列号9中记载的碱基序列表示的寡核苷酸、或者由与该碱基序列具有70%以 上的同源性并且能够作为核酸引物使用的碱基序列表示的寡核苷酸。
18.一种宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)检测试剂盒，含有权利要求17所述的 寡核苷酸对或寡核苷酸组。
19.一种引物组，是在利用环介导等温扩增(LAMP)法检测宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)中使用的引物组，并且所述引物组选自下述(i) (iv)的引物组(i)引物组，含有以下引物由序列号10中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引 物、由序列号11中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号12中记载的碱基 序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号13中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的 引物、由序列号14中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、以及由序列号15中记载 的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物；( )引物组，含有以下引物由序列号10中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引 物、由序列号11中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号12中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、以及由序列号13中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组 成的引物；(iii)引物组，含有以下引物由序列号16中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的 引物、由序列号17中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号18中记载的碱 基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号19中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成 的引物、由序列号20中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、以及由序列号21中记 载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物；(iv)引物组，含有以下引物由序列号16中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引 物、由序列号17中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组成的引物、由序列号18中记载的碱基 序列表示的寡核苷酸组成的引物、以及由序列号19中记载的碱基序列表示的寡核苷酸组 成的引物。
20. 一种宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)检测试剂盒，含有权利要求19所述的引物组、DNA聚合酶、包含 dATP、dCTP、dGTP 以及 dTTP 的 dNTP。
全文摘要
本发明涉及宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的检测方法。本发明的检测方法是使用由下述(a)或(b)的碱基序列表示的核酸来进行宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的鉴定，(a)序列号1～4和22～33中任意一个所记载的β-微管蛋白基因的部分碱基序列或其互补序列，(b)由序列号1～4和22～33中任意一个所记载的碱基序列中的1个或多个碱基缺失、置换或附加而成的并且能够用于宛氏拟青霉检测的碱基序列或其互补序列。
文档编号C12N15/00GK102083976SQ20098012616
公开日2011年6月1日 申请日期2009年5月29日 优先权日2008年5月29日
发明者中山素一, 弘佑介, 德田一, 矢口贵志, 细谷幸一 申请人:花王株式会社