枯草芽孢杆菌a053及其在制备防治植物致病真菌发酵液中的应用的制作方法
【专利摘要】枯草芽孢杆菌A053及其在制备防治植物致病真菌发酵液中的应用，涉及枯草芽孢杆菌。所述枯草芽孢杆菌（Bacillus?subtilis）A053的保藏编号为CCTCC?NO：M2010269。所述枯草芽孢杆菌（Bacillus?subtilis）A053可用于制备防治植物致病真菌发酵液。所述防治植物致病真菌发酵液的使用方法如下：将防治植物致病真菌发酵液直接用于植物致病真菌的防治。所述植物致病真菌包括：立枯丝核菌、核盘菌、宛氏拟青霉、镰刀菌、绿色木霉、长柄链格孢、香蕉炭疽菌等。制备工艺简单，抑真菌谱广，对镰刀菌生防效果好。
【专利说明】枯草芽孢杆菌A053及其在制备防治植物致病真菌发酵液中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及枯草芽孢杆菌，特别是涉及一种枯草芽孢杆菌A053及其在制备防治植物致病真菌发酵液中的应用。
【背景技术】
[0002]植物病原真菌引起的植物病害位居植物3类病害(真菌病害、细菌病害和病毒病害)之首，其频繁发生成灾，造成重大的农业经济损失，是阻碍中国农业经济发展的突出问题之一。我国既是一个农业大国，也是一个海洋大国，从海洋微生物资源中寻找具有特殊功能的活性物质应用于陆地农业是一个较新的研究方向，有着很强的创新性和巨大的应用潜力。由于试制的农用抗生素可以直接在植物体上测试，不需要经过动物间接试验，因此研究过程较医药研究将大大缩短。现在也已获得一些有价值的活性物质，有的己经应用到植物病虫害的防治试验中，取得较好的效果。
[0003]由于极地环境特殊性以及人们寻找新型活性物质的兴趣与日俱增，近年来，极地微生物资源已越来越引起了人们的注意。北极由于其独有的地理及气候特征，是一个潜在的、有待开发的微生物资源库。它不仅是独特生态系统微生物的生存繁衍地，也是新型生物活性物质(如酶、抗生素、多糖及脂类等)和先导化合物合成菌株的潜在种源地。在这种特殊的生态多样性环境中生存的微生物，可能具有不同于陆生微生物的独特的遗传和代谢多样性。因此，北极微生物资源可能是新型化合物或新型活性代谢产物的潜在来源。
[0004]研究表明，许多海洋微生物可产生抗真菌活性物质，包括链霉菌属、气单胞菌属、假单胞菌属、芽抱杆菌属、黄杆菌属、微球菌属、子囊菌属、半知菌属等以及许多未定菌(沈寅初.农用抗生素研究开发的新进展.国外医药抗生素分册.1998，19(2): 155-160)。虽然已知有数种细菌具有抗真菌活`性，但是芽孢杆菌仍然是最好的选择(Handelsman J, StabbEV.Biocontrol of soil borne plant pathogens.Plant Celll996;8:1855-1869),因为对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力(黄海婵，裘娟萍.枯草芽孢杆菌防治植物病害的研究进展[J].浙江农业科学，2005，(3):213-215)，故其成为近年来植物病害防治研究的热点。尤其是来自北极极端条件下的芽孢杆菌，其生长条件、代谢类型和产物与陆地或其他海洋来源的不同，从而有可能开发出结构新颖的生物活性物质。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一在于提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) A053。
[0006]本发明的目的之二在于提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)A053在制备防治植物致病真菌发酵液中的应用及其方法。
[0007]所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)A053分离自中国第三次北极科学考察期间所采集的海水样品(N78° 57' 09.2"，E12° OOi 02.3 ");该菌已于2010年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学，邮编为430072，保藏中心保藏编号为CCTCC NO:M2010269。
[0008]所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)A053通过聚合酶链式反应(PCR)扩增其16S rDNA序列，与美国国家生物技术信息中心(NCBI)GenBank数据库中相应的序列进行比对分析，结果发现，其与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有99%的序列相似性。
[0009]所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)A053可用于制备防治植物致病真菌发酵液。其制备方法如下:
[0010]首先将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)A053在含有IOml LB培养基的试管中进行活化培养，然后将活化的菌株接种到5L发酵罐(培养基3L)中进行发酵培养，得到防治植物致病真菌发酵液。
[0011]所述LB 培养基的组成如下:葡萄糖 20g/L，KH2P046g/L, K2HPO414g/L, MgSO40.2g/L, (NH4)2S044g/L, 2ml 微量元素，0.1MPa 灭菌 30min,所述微量元素包括 FeSO4.4H20,CaCl2.2H20, MnSO4.4H20, ZnCl2各ImM，过滤除菌后放入无菌试剂瓶中备用。
[0012]所述活化培养的时间为8~12h ;所述发酵培养的条件可为:温度为30~37°C，pH为6.0~8.0,时间为36~72h。
[0013]所述防治植物致病真菌发酵液的使用方法如下:
[0014]将防治植物致病真菌发酵液直接喷洒在植物上。
[0015]在棉花枯萎病菌(镰刀菌感染引起)防治的盆栽实验中，A053发酵液具有较好的生物防治效果。 [0016]所述植物致病真菌包括:立枯丝核菌、核盘菌、宛氏拟青霉、镰刀菌、绿色木霉、长柄链格孢、香蕉炭疽菌等。在棉花枯萎病菌(镰刀菌)防治的盆栽试验中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) A053发酵液具有较好的生物防治效果，处理7天后，对照组的发病呈上升趋势，发病率从36.67%升高到69.23% ;而实验组的发病趋势得到遏制，发病率从45.95% 下降至Ij 37.93%。
[0017]与现有技术相比，本发明具有以下优点:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)A053发酵液的制备工艺简单，抑真菌谱广，对镰刀菌生防效果好。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) A053的菌落形态。
[0019]图2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)A053的发酵上清液对不同植物致病真菌的抑菌效果图。在图2中:A，立枯丝核菌，B，核盘菌，C，宛氏拟青霉，D，镰刀菌，E，绿色木霉，F,长柄链格孢，G,香蕉炭疽菌
[0020]图3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)A053的发酵液防治棉花枯萎病菌的盆栽试验生防效果。在图3中，实验组:枯草芽孢杆菌(Bacillus sUbtilis)A053发酵液处理过棉花植株；对照组:发酵培养基处理过棉花植株(作为阴性对照)。
【具体实施方式】
[0021 ] 下面结合实施例对本发明作进一步描述。
[0022]实施例1:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) A053的分离筛选[0023]本发明涉及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)A053来源于本 申请人:来自中国第三次北极科学考察期间所采集的海水样品(N78° 57' 09.2"，E12° 00' 02.3")中所分离获得，该菌在LB培养基上生长，30°C培养24h后，菌体呈浅黄色，菌落较大，见图1。
[0024]实施例2:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) A053菌种鉴定
[0025]利用16S rDNA 通用引物 27F 和 1495R(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAT ；1495R:ACGGCTACCTTGTTACGACTT)对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) A05316S rDNA 序列进行PCR (聚合酶链式反应)扩增。以北极来源枯草芽孢杆菌A053总DNA为PCR扩增模板，在Eppendorf PCR扩增仪上进行PCR反应。反应条件为:94°C变性Imin ;55°C退火lmin;72°C延长1.5min，30个循环。扩增基因送测序公司测序，获得该菌株16S rDNA序列后，将该序列通过美国国家生物技术信息中心(NCBI) BLAST搜索引擎(http://ncb1.nlm.nih.gov/blast)与GeneBank中核酸数据进行对比分析。结果发现，枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis) A05316S rDNA 序列与 Bacillus subtilis (CP002905.1)、Bacillus subtilis(EU047884.1)、Bacillus subtilis(HQ327126.1)、Bacillussubtilis (AB325584.1)等菌株的序列相似性为99%，因此，将其命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) A053。
[0026]实施例3:植物致病真菌抗菌谱的测定
[0027]采用滤纸片法测定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) A053对7种植物致病真菌的抑制活性。用直径为6mm无菌打孔器将受试致病真菌制成菌块，用牙签挑取一菌块于马铃薯固体培养基(PDA)平板中央，28°C的条件下培养I~2天，等待受试致病真菌菌丝体扩散生长后，在每个菌块的四周放置若干灭菌的直径6mm的双层滤纸片，滤纸片距离菌块中心0.5~1cm，再在每 个滤纸片上加50 μ L的无菌发酵上清液，继续培养2~3天，通过与对照培养的比较，观测菌丝体的生长是否会受到抑制，如果受试致病真菌的菌丝体受到抑制时，菌丝体会形成月牙型或者线型边缘。结果如图2所示，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) A053发酵上清液对立枯丝核菌、核盘菌、宛氏拟青霉、镰刀菌、绿色木霉、长柄链格孢、香蕉炭疽菌等7种受试植物致病真菌具有抑制活性。
[0028]实施例4:棉花枯萎病菌(镰刀菌感染引起)的生物防治盆栽试验
[0029]在棉花发病较明显时每钵浇枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) A053发酵菌液50mL，共6钵，设为实验组；另设对照组6钵，浇清水。处理前，实验组的发病率达45.95%，对照发病率为36.67%，实验组的发病程度较对照组重。处理后7天，对照组的发病呈上升趋势，发病率达69.23% ;而实验组的发病趋势得到遏制，发病率为37.93%，见图3。实验结果表明，在棉花发病后用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) A053发酵菌液浇根能在一定程度遏制枯萎病的加重，从而有利于棉花后期的恢复生长。
【权利要求】
1.枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)A053,已于2010年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO:M2010269。
2.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) A053在制备防治植物致病真菌发酵液中的应用。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述防治植物致病真菌发酵液的制备方法如下: 首先将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)A053在含有IOml LB培养基的试管中进行活化培养，然后将活化的菌株接种到5L发酵罐中进行发酵培养，得到防治植物致病真菌发酵液。
4.如权利要求3所述应用，其特征在于所述LB培养基的组成如下:葡萄糖20g/L，KH2P046g/L，K2HP0414g/L，MgSO40.2g/L，(NH4) 2S044g/L，2ml 微量元素，0.1MPa 灭菌 30min,所述微量元素包括FeSO4.4H20, CaCl2.2H20, MnSO4.4H20, ZnCl2各ImM，过滤除菌后放入无菌试剂瓶中备用。
5.如权利要求3所述应用，其特征在于所述活化培养的时间为8~12h。
6.如权利要求3所述应用，其特征在于所述发酵培养的条件为:温度为30~37°C，pH为6.0~8.0，时间为36~72h。
7.如权利要求3所 述应用，其特征在于所述防治植物致病真菌发酵液的使用方法如下: 将防治植物致病真菌发酵液直接喷洒在植物上。
8.如权利要求3所述应用，其特征在于植物致病真菌包括:立枯丝核菌、核盘菌、宛氏拟青霉、镰刀菌、绿色木霉、长柄链格孢、香蕉炭疽菌。
【文档编号】C12R1/125GK103589673SQ201310636419
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年12月2日 优先权日:2013年12月2日
【发明者】陈新华, 陈志腾, 崔鹏飞 申请人:国家海洋局第三海洋研究所