人骨骼肌中的褐色脂肪细胞祖细胞的制作方法

人骨骼肌中的褐色脂肪细胞祖细胞的制作方法
【专利摘要】本发明涉及褐色脂肪组织(BAT)祖细胞和从骨骼肌分离BAT祖细胞的方法。还提供BAT祖细胞表面标志物以及用于诱导细胞分化成褐色脂肪细胞的培养基和试剂。在一些实施方案中，BAT祖细胞表达与内皮细胞相关的第一细胞表面标志物，第一细胞表面标志物在基于抗体的测定中使用第一抗体可检测到。另外，BAT祖细胞可大致上不含与内皮细胞相关的第二细胞表面标志物，所述第二细胞表面标志物在所述基于抗体的测定中使用第二抗体大致上不可检测到。BAT祖细胞还可大致上不含额外细胞表面标志物。
【专利说明】人骨骼肌中的褐色脂肪细胞祖细胞
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2011年11月10日提交的美国临时专利申请No. 61/558, 152的优先 权和权益，所述专利申请全部以引用方式并入本文。

【技术领域】
[0003] 本发明涉及褐色脂肪组织（BAT)祖细胞和从骨骼肌分离BAT祖细胞的方法。本发 明还涉及BAT祖细胞表面标志物以及诱导细胞分化的培养基和试剂。本发明用于研究、预 防和治疗各种代谢疾病如肥胖症、2型糖尿病、胰岛素抵抗和血脂异常。
[0004] 背景
[0005] 肥胖流行病与糖尿病、高血压、冠心病、癌症和其它病症的发病率增加紧密相关。 白色脂肪组织的作用是存储脂质，并且它与肥胖症相关。褐色脂肪组织（"BAT"）的作用事 实上相反。它专门从事脂质燃烧和以热量形式的能量耗散。事实上，褐色脂肪细胞含有许 多线粒体（其中发生细胞燃烧）并且独特地表达BAT解偶联蛋白-1 ( "UCP1"）。UCP1充 当氧化磷酸化的解偶联剂，导致能量以热量形式耗散。交感神经系统刺激线粒体发生以及 UCP1表达和活性。啮齿动物中的BAT相关生热作用在暴露于低温后增加（例如，预防体温 过低）或由于过度饱食、燃烧多余吸收脂肪和预防体重增加而增加。通过改变体重增加的 易感性和消耗大量葡萄糖，BAT也改进胰岛素敏感性。因此，它在保持体温、能量平衡和葡 萄糖代谢中发挥重要作用。
[0006] 使用转基因动物的实验支持BAT的潜在抗肥胖症性质。举例来说，已经报告BAT 的遗传切除可导致肥胖症，而BAT的数量和/或功能（和/或UCP1表达）的遗传增加据报 告可促进瘦的和健康的表型。具体来说，与对照小鼠相比，具有较高数量BAT的小鼠获得较 少体重并且更具有胰岛素敏感性。最近，异位BAT贮存物在小鼠肌肉中予以证实，已经提出 这些贮存物可提供防止体重增加和代谢综合征的基于遗传的机制。
[0007] 虽然UCP1据报告在控制啮齿动物体内的能量平衡中起作用并且表达UCP1的BAT 存在于人类新生儿体内，但是一直认为在成人中没有生理相关的UCP1表达。事实上，表达 UCP1的BAT被认为在生命早期消失，并且成人被认为没有BAT。
[0008] 因此，需要仔细识别并且研究可在成人体内提供更多BAT和/或刺激UCP1表达的 方法，以便研究、预防和治疗各种代谢疾病如肥胖症、2型糖尿病、胰岛素抵抗血脂异常和1 型糖尿病。
[0009] 概述
[0010] 申请人:已经首次识别各种组织中的能够分化成褐色脂肪细胞的细胞的存在。在一 方面， 申请人:已经在骨骼肌中识别这类细胞的群体， 申请人:将其称作BAT祖细胞。本公开提 供分选来自各种组织的细胞以识别并且分离BAT祖细胞的方法。在一些实施方案中，BAT 祖细胞从人骨骼肌中分离。提供使BAT祖细胞在体外和体内分化成褐色脂肪细胞的方法。 在一些实施方案中，在人受试者体内，可导致BAT祖细胞在体内分化成褐色脂肪细胞。本发 明还涉及BAT祖细胞表面标志物（例如，CD31和CD34)和培养基以及诱导细胞分化的试剂 (例如，PPAR γ激动剂和BMP7)。
[0011] 在一些实施方案中，本公开的ΒΑΤ祖细胞可在培养物中扩增。在另一方面，分化的 ΒΑΤ祖细胞UCPlmRNA表达通过试剂如细胞渗透cAMP衍生物、过氧化物酶体增殖物活化受体 (PPAR如PPARY)激动剂等来增加。在一些实施方案中，已经分化成褐色脂肪细胞的BAT祖 细胞可含有大量线粒体转录因子A(mtTFA)和PPAR γ辅助活化剂-1 a (PGC-1 α )，其均涉及 控制线粒体发生，以及线粒体标志物细胞色素氧化酶IV (C0X IV)。分化的ΒΑΤ祖细胞可展 现以下特性中的一个或多个：高水平的UCP1表达、高水平的解偶联呼吸、高呼吸率、高代谢 率。 申请人:提供分化的细胞，这些细胞经过配备可经由氧化磷酸化的解偶联来代谢葡萄糖、 氧化脂肪酸，并且以热量形式来耗散能量。
[0012] 本公开提供检测成人骨骼肌中的UCPlmRNA的方法，和增加其在体内表达的方 法。虽然以前关于成人体内UCP1表达的研究集中于白色脂肪组织，但是 申请人:公开了具有 UCP1表达的实质性潜力的褐色脂肪祖细胞在人骨骼肌中的存在和分离。在一些实施方案 中，此BAT祖细胞库可用于调节能量耗散以及治疗肥胖症、糖尿病和代谢疾病。
[0013] 在一些方面，本公开提供识别人骨骼肌中的BAT祖细胞的方法和从人骨骼肌样品 中分离这些细胞的方法。还提供促进这些祖细胞在体外、体内或在这两者下分化成褐色脂 肪细胞的条件和试剂（例如化合物、蛋白质、生物材料等）。提供使用这些条件和试剂来治 疗代谢疾病如肥胖症、2型糖尿病、胰岛素抵抗、血脂异常等的方法。
[0014] 本公开提供允许识别试剂（例如，化合物、蛋白质、生物材料等）的测定，这些试剂 诱导UCP1基因的表达、促进BAT祖细胞在体外分化成褐色脂肪细胞、促进BAT祖细胞在体 内分化成褐色脂肪细胞，或这些活性的组合。根据一些实施方案，用这种方式识别的试剂可 用于治疗代谢疾病如肥胖症、2型糖尿病、胰岛素抵抗、血脂异常等。
[0015] 在一方面，提供褐色脂肪组织（BAT)祖细胞。BAT祖细胞从人骨骼肌中分离并且能 够分化成褐色脂肪细胞。BAT祖细胞表达与内皮细胞相关的第一细胞表面标志物，所述第一 细胞表面标志物在基于抗体的测定中使用第一抗体可检测到。另外，BAT祖细胞大致上不 含与内皮细胞相关的第二细胞表面标志物，所述第二细胞表面标志物在所述基于抗体的测 定中使用第二抗体大致上不可检测到。在某些实施方案中，BAT祖细胞可大致上不含第三、 第四和第五细胞表面标志物中的至少一个。举例来说，BAT祖细胞可大致上不含与造血细 胞相关的第三细胞表面标志物，所述第三细胞表面标志物在所述基于抗体的测定中使用第 三抗体大致上不可检测到。BAT祖细胞可大致上不含第三细胞表面标志物和/或与生肌细 胞相关的第四细胞表面标志物，所述第四细胞表面标志物在所述基于抗体的测定中使用第 四抗体大致上不可检测到。BAT祖细胞可大致上不含第三和/或第四细胞表面标志物，和/ 或与周细胞相关的第五细胞表面标志物，所述第五细胞表面标志物在所述基于抗体的测定 中使用第五抗体大致上不可检测到。
[0016] 在另一个方面，本发明表征从骨骼肌分离的细胞群体，包括如本文描述的至少一 种BAT祖细胞。
[0017] 在另一方面，提供识别BAT祖细胞的方法。所述方法包括：提供从骨骼肌分离的细 胞群体；使细胞群体与分别对于第一和第二细胞表面标志物具有特异性的第一和第二抗体 接触，其中第一和第二细胞表面标志物各自与内皮细胞相关；以及在基于抗体的测定中确 定表达第一细胞表面标志物并且大致上不含第二细胞表面标志物的BAT祖细胞。在一些实 施方案中，所述方法可进一步包括以下中的至少一个：使细胞群体与对于与造血细胞相关 的第三细胞表面标志物具有特异性的第三抗体接触，所述第三细胞表面标志物在所述基于 抗体的测定中使用第三抗体大致上不可检测到；使细胞群体与对于与生肌细胞相关的第四 细胞表面标志物具有特异性的第四抗体接触，所述第四细胞表面标志物在所述基于抗体的 测定中使用第四抗体大致上不可检测到；和/或使细胞群体与对于与周细胞相关的第五细 胞表面标志物具有特异性的第五抗体接触，所述第五细胞表面标志物在所述基于抗体的测 定中使用第五抗体大致上不可检测到。在某些实施方案中，所述方法可进一步包括通过选 择表达第一细胞表面标志物并且不表达第二细胞表面标志物的细胞来分离细胞群体。在一 些实施方案中，所述方法可包括选择表达第一细胞表面标志物并且不表达第二细胞表面标 志物，以及第三、第四和第五细胞表面标志物中的至少一个细胞表面标志物的细胞来分离 细胞群体。举例来说，所述选择可包括选择表达⑶34并且不表达⑶31、⑶45、⑶56或⑶146 的细胞。所述方法还可包括分离BAT祖细胞和/或在增殖培养基中培养BAT祖细胞，从而 离体扩增BAT祖细胞。
[0018] 在另一个方面，提供诱导BAT祖细胞分化成褐色脂肪细胞的方法。所述方法包括： 提供本文描述的BAT祖细胞；使BAT祖细胞暴露于分化培养基；并且在分化培养基中培养 BAT祖细胞以诱导BAT祖细胞分化成褐色脂肪细胞。
[0019] 在另一个方面，本发明表征治疗患者的代谢疾病或病状的方法。所述方法包括：从 个体或供体的骨骼肌获得BAT祖细胞；通过在培养基中培养来使BAT祖细胞繁殖；并且将 培养细胞移植至个体。在某些实施方案中，所述方法可进一步包括经由在分化培养基中离 体培养来诱导BAT祖细胞分化成褐色脂肪细胞。在各种实施方案中，代谢疾病是肥胖症、超 重、葡萄糖耐量受损、胰岛素抵抗、2型糖尿病、血脂异常、高血压、心血管疾病、代谢综合征、 帕-魏二氏综合征（Prader-Willi Syndrome)或1型糖尿病。
[0020] 在另一个方面，提供识别诱导BAT祖细胞分化成褐色脂肪细胞的试剂的方法。所 述方法包括：提供本文描述的BAT祖细胞；使BAT祖细胞与试剂接触；确定是否BAT祖细胞 展现分化成褐色脂肪细胞的指标。在一些实施方案中，分化指标可为以下中的一个或多个 的增加：UCP1蛋白质或mRNA的表达、FABP4(aP2)蛋白质或mRNA的表达、PPARY2蛋白质或 mRNA的表达、mtTFA蛋白质或mRNA的表达、PGC-1 α蛋白质或mRNA的表达、解偶联呼吸、呼 吸率、代谢率、葡萄糖利用率、脂肪酸氧化率和其组合。
[0021] 在另一个方面，提供识别诱导UCP1的表达或活性水平的试剂的方法。所述方法包 括：提供本文描述的BAT祖细胞；使BAT祖细胞与试剂接触；确定是否BAT祖细胞展现UCP1 表达或活性的增加。
[0022] 本发明还包括使用本文描述的任何一种方法所识别的试剂在制造药物中的用途， 所述药物用于治疗代谢疾病，和/或用于治疗或预防患者的体温过低。
[0023] 在一些实施方案中，第一细胞表面标志物可为⑶34并且第一抗体可为抗-⑶34抗 体。在一个实施方案中，第二细胞表面标志物可为CD31并且第二抗体可为抗-CD31抗体。 第三细胞表面标志物，例如，可为CD45并且第三抗体可为抗-CD45抗体。第四细胞表面标 志物，例如，可为⑶56并且第四抗体可为抗-⑶56抗体。第五细胞表面标志物，例如，可为 ⑶146并且第五抗体可为抗-⑶146抗体。
[0024] 在各种实施方案中，BAT祖细胞可在分化培养基中分化成褐色脂肪细胞。举例来 说，分化培养基可为基本分化培养基（MDM)。分化培养基可进一步包括过氧化物酶体增殖物 活化受体Y (PPARY)激动剂和/或骨形态形成性蛋白质-7(BMP7)。在一些实施方案中，在 添加分化培养基之前，BMP7可存在于允许增殖BAT祖细胞的增殖培养基中。
[0025] 本发明的额外方面包括分离的BAT祖细胞、其原代培养物、从其中产生的建立或 永生细胞系、培养BAT祖细胞或细胞系、转染或转导或感染或转化细胞或细胞系，和可从这 类BAT祖细胞或细胞系或转化株分化的任何细胞或培养物。本公开的这些和其它特征在本 文中阐明。
[0026] 附图简述
[0027] 图1展示人胎儿肌肉中的间质血管细胞的免疫组织化学描述和FACS分析和分选。
[0028] 图2展示从人胎儿肌肉中分选的细胞在成脂条件下的培养和CD34+细胞的RT-PCR 和蛋白质印迹分析。图2A、2B、2C :相差；比例尺：50μπι。
[0029] 图3展示人胎儿肌肉⑶34+细胞中的线粒体呼吸的解偶联和UCPlmRNA表达的控 制。
[0030] 图4展示成脂培养物中的成人肌肉和WAT细胞的表征。图4A、4C :相差；比例尺： 50 μ m〇
[0031] 图5展示罗格列酮对于人骨骼肌中的UCPlmRNA表达的效果。
[0032] 图6展示扩增之前的⑶31-细胞群体（图6A :EMC309,继代2 ;图6B :EMC314,继代 1)。
[0033] 图7展示扩增之前的⑶31+细胞群体（图7A :EMC309,继代4 ;图7B :EMC314,继代 3)。
[0034] 图8展示扩增之前的⑶56+细胞群体（图8A :EMC309,继代1 ;图8B :EMC314,继代 3)。
[0035] 图9展示⑶31-细胞群体分化成褐色脂肪细胞（图9A-9D :EMC309,第14天的继 代4 ;图9E-9H :EMC314,第14天的继代3)。
[0036] 图10展示CD31+细胞不分化成脂肪细胞（图10A-10D :EMC309,第14天的继代6 ; 图 10E-10H :EMC314,第 14 天的继代 5)。
[0037] 图11展示⑶56+细胞不分化成脂肪细胞（图11A-11D :EMC309,第14天的继代6 ; 图 11E-11H :EMC314,第 14 天的继代 5)。
[0038] 图12展示与从成脂分化培养基（MDM)中生长的⑶31-细胞回收的RNA相比， 从CD31+和CD56+细胞中回收的RNA显著较少（反映较低数量的细胞），不论存在或不存 在罗格列酮或BMP7 (+/-cmpd)。比较⑶31-样品相比于⑶31+和⑶56+样品中的暗色条 (MDM+/_cmpd)。
[0039] 图13展示⑶31-细胞分化成脂肪细胞并且表达UCP1。⑶31-细胞暴露于罗格列 酮或BMP7强劲地增加细胞的分化和UCP1的表达。
[0040] 图14展示cAMP和β -AR激动剂与PPAR γ激动剂具有对于UCPlmRNA表达的协同 效果。RDM =基本分化培养基+罗格列酮，iso =(-)-异丙肾上腺素。
[0041] 图15展示如与未分化的BAT祖细胞相比，分化褐色脂肪细胞具有显著增加水平的 PPAR γ 2mRNA。RDM =基本分化培养基+罗格列酮，iso =(-)-异丙肾上腺素。
[0042] 图16展示⑶31-细胞的呼吸。与未分化细胞（EGM2,白色条）比较，分化成褐色 脂肪细胞的CD31-细胞（灰色条）具有较高水平的线粒体解偶联，或质子泄漏（状态4呼 吸），以及最大（解偶联）呼吸（状态3u)。
[0043] 图17展示通过荧光免疫组织化学对于⑶31-细胞中的UCP1所进行的定量。
[0044] 图18展示通过多重实时PCR，未分化（EGM2)和分化（罗格列酮或BMP7)⑶31-细 胞中的UCP1 (图18A，黑色条）、FABP4(图18B，灰色条）和亲环蛋白A mRNA的定量。
[0045] 详述
[0046] 本公开提供识别和分离各种组织中的BAT祖细胞的方法，在一些实施方案中，所 述方法包括识别人骨骼肌中的常见褐色脂肪细胞祖细胞并且从人骨骼肌样品中分离这类 细胞。在一些实施方案中，细胞分选可通过细胞表面标志物如一个或多个群集分化/指定 (〃⑶〃）分子⑶31、⑶34、⑶45、⑶56和⑶146的免疫组织化学分析来完成。⑶31和⑶34可 用于识别内皮细胞。造血细胞和生肌祖细胞可分别基于其细胞表面上的CD45和CD56的识 别来分选。CD146可用于识别周细胞。在一方面，CD34的表达将细胞识别为褐色脂肪细胞 的祖细胞。在另一个方面，CD34+细胞亚群代表迄今为止已知的最纯人褐色脂肪细胞祖细 胞。
[0047] 流式细胞术、荧光激活细胞分选（"FACS")和在本领域中已知的其它细胞分选技 术可用于分选从各种组织获得的细胞并且将BAT祖细胞与其它细胞分离。在本领域中已知 的其它技术之中，多色FACS可用于识别⑶31-⑶34+内皮细胞。另外，⑶146+周细胞、⑶45+ 造血细胞和/或CD56+生肌祖细胞中的一种或多种可分离并且移除。逆转录酶聚合酶链 反应（"RT-PCR")分析可用于证实⑶34+和⑶146+细胞群体中不存在造血细胞和生肌祖细 胞。
[0048] 申请人:意外地发现祖细胞群体存在于骨骼肌中，并且在一些实施方案中，此群体 发现于骨骼肌但是未发现于白色脂肪组织中，并且在一些实施方案中，仅发现于骨骼肌中 (即，未发现于其它组织中）。骨骼肌可为人或任何动物的骨骼肌，并且祖细胞群体可分散 于骨骼肌中或集中于不连续区域。在一些实施方案中，BAT祖细胞可发现于肌纤维之间。骨 骼肌BAT祖细胞可为固定群体或可在骨骼肌或其它组织内以及不同组织之间和之中移动。 进一步，BAT祖细胞可发现于胎儿、青少年和成人骨骼肌中。
[0049] 本发明教导提供从各种组织中分离的BAT祖细胞。举例来说，提供从人骨骼肌中 分离的BAT祖细胞。在一些实施方案中，BAT祖细胞发现于骨骼肌中但是未发现于白色脂肪 组织，和/或仅发现于骨骼肌中。一些BAT祖细胞可表达UCP1、线粒体转录因子A (mtTFA) 和/或PPAR γ辅助活化剂-1 a (PGC-1 α )以及一种或多种相应mRNA。本公开提供检测成 人骨骼肌中的BAT祖细胞和/或UCPlmRNA的方法。虽然以前关于成人体内UCP1表达的研 究集中于白色脂肪组织，但是 申请人:公开了具有UCP1表达的高潜力的褐色脂肪祖细胞在 人骨骼肌中的存在和分离。在一些实施方案中，骨骼肌中的BAT祖细胞库提供调节能量耗 散的机制以治疗代谢疾病如肥胖症、糖尿病等。
[0050] 存在于骨骼肌中的祖细胞群体的至少一部分能够分化成真正的褐色脂肪细胞，并 且在一些实施方案中，存在于骨骼肌中的祖细胞群体的一部分能够在体外分化成真正的褐 色脂肪细胞。本公开提供扩增BAT祖细胞培养物的方法和使BAT祖细胞分化成真正的BAT 细胞的方法，包括在成脂培养基中使以前分选的细胞分化的方法。在一些实施方案中，分选 的祖细胞分化成褐色脂肪细胞可使用维持白色脂肪细胞分化的条件或使用确定为促进祖 细胞分化成褐色脂肪细胞的试剂来执行。
[0051] 一些实施方案利用UCPl、FABP4(aP2)、PPARy2、线粒体转录因子A(mtTFA)和/或 PPAR γ辅助活化剂-1 a (PGC-1 α )以及一种或多种相应mRNA的存在来识别开始至少部分 地分化的BAT祖细胞。高代谢率或高水平解偶联呼吸、葡萄糖利用、脂肪酸氧化或前述特性 彼此或与其它特性的组合可用于识别开始至少部分地分化的BAT祖细胞。出于本公开目 的，开始至少部分地分化成褐色脂肪细胞的BAT祖细胞被称为"分化的褐色脂肪细胞"。
[0052] 举例来说，确定为表达⑶34标志物的细胞（即⑶34+细胞）可分化成褐色脂肪细 胞，通过在含有0. 86 μ Μ胰岛素、10 μ g/ml转铁蛋白、0. 2nM三碘甲腺原氨酸、1 μ Μ罗格列 酮、100 μ M3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1 μ Μ地塞米松和1 %青霉素-链霉素的DMEM-汉氏 F-12培养基中培养。其它试剂也可用于促进祖细胞分化成褐色脂肪细胞。在一些实施方案 中，根据本公开教导来识别的试剂用于促进祖细胞分化成褐色脂肪细胞。在一些实施方案 中，分化的褐色脂肪细胞展现高水平UCP1表达、高水平解偶联呼吸和/或高代谢率。
[0053] 在另一个实例中，与⑶34+细胞（即，包括⑶34+⑶31-细胞和⑶34+⑶31+细胞） 相比，表达⑶34标志物但是大致上不含⑶31标志物的细胞（即，⑶34+⑶31-细胞）可代 表更纯ΒΑΤ祖细胞群体。在某些实施方案中，不含有PPARY激动剂（例如，罗格列酮）的 成脂分化培养基，称为基本分化培养基（MDM)，证明足以诱导至少一定比例脂肪细胞祖细 胞的分化。MDM的组成为：DMEM/汉氏F-1250/50混合物（3. 151g/l，17. 5mM右旋葡萄糖， 3. 651g/l 左旋谷酰胺）（Cellgro#10-090-CV)、5 μ g/ml (0· 86 μ M)胰岛素、10 μ g/ml 转铁蛋 白、0. 2nM3, 3'，5-三碘-L-甲状腺素、100 μ M3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1 μ Μ地塞米松、1 % 青霉素-链霉素。
[0054] 本公开提供增加 ΒΑΤ祖细胞、分化褐色脂肪细胞或两者中的UCPlmRNA表达的方 法。举例来说，试剂如细胞渗透cAMP衍生物和过氧化物酶体增殖物活化受体-γ (PPAR γ ) 激动剂可用于增加 BAT祖细胞、分化褐色脂肪细胞或两者中的UCPlmRNA表达。增强的UCP1 表达可通过在本领域中已知的方法来确定，包括通过定量RT-PCR来测量UCPlmRNA。用于 UCPlmRNA的RT-PCR分析中的示例性引物以SEQ ID N0:1-4和11-12形式来提供。
[0055] 与未暴露于成脂培养基的BAT祖细胞相比，暴露于成脂培养基的BAT祖细胞可含 有较高水平UCPImRNA。亲环蛋白mRNA水平可充当评估细胞中的UCPImRNA丰度的归一化值 (反映细胞数量或RNA总量）。在一些实施方案中，未暴露于成脂培养基的BAT祖细胞中的 UCPlmRNA水平使用RT-PCR不可检测到，而分化褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平可检测到 并且可相对于亲环蛋白mRNA水平来归一化。作为UCP1表达的比较测量，分化褐色脂肪细 胞中的UCPlmRNA水平可与培养小鼠褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平相比较。本公开提供 培养小鼠褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平约25 %的分化褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA水 平，而在其它实施方案中，UCPlmRNA水平是培养小鼠褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平的约 25 ± 10 %或约15 %至约30 %。本公开涵盖培养小鼠褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平约5 % 至约100%范围内的分化褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平。在一些实施方案中，UCPlmRNA 水平可超过培养小鼠褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平的100%。
[0056] 与相同种类或相同个体成人骨骼肌活检中的细胞相比，分化褐色脂肪细胞可含有 显著较高水平的UCPlmRNA。另外，分化褐色脂肪细胞中的UCP1蛋白质的数量可与相同种 类或相同个体胎儿BAT中的UCP1蛋白质的数量近似相等。本公开涵盖人分化褐色脂肪细 胞中的UCPlmRNA水平与体内人褐色脂肪细胞的UCPlmRNA水平近似相等。在一些实施方案 中，人分化褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA水平可在体内人褐色脂肪细胞的UCPlmRNA水平的 约1%直至比其大许多倍的范围内。
[0057] 本公开提供增加 BAT祖细胞、分化褐色脂肪细胞或两者中的UCPlmRNA水平的方 法。在一些实施方案中，所述方法提供选择性增加 BAT祖细胞、分化褐色脂肪细胞或两者 中的UCPlmRNA水平。PPARY激动剂可刺激骨骼肌和分化褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA产 生。举例来说，在一些实施方案中，PPARY激动剂罗格列酮选择性刺激骨骼肌或分化褐色 脂肪细胞中的UCPlmRNA产生。细胞渗透cAMP衍生物可刺激均骨骼肌和分化褐色脂肪细胞 中的UCPlmRNA产生。举例来说，在一些实施方案中，细胞渗透cAMP衍生物8-溴-cAMP选 择性刺激骨骼肌或分化褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA产生，而在一些实施方案中，细胞渗透 cAMP衍生物（4-氯苯基硫代）-cAMP选择性刺激骨骼肌或分化褐色脂肪细胞中的UCPlmRNA 产生。举例来说，在一些实施方案中，PPARy激动剂罗格列酮和细胞渗透cAMP类似物二丁 酰-cAMP或β-AR激动剂（-)-异丙肾上腺素的组合可另外选择性刺激骨骼肌或分化褐色 脂肪细胞中的UCPlmRNA产生（图14)。
[0058] 线粒体转录因子A( "mtTFA"）和过氧化物酶体增殖物活化受体辅助活化 剂-la ("PGC-la "）涉及控制线粒体发生。分化褐色脂肪细胞可含有大量mtTFA、PGC_la 或两者。本公开提供如与未分化的BAT祖细胞相比，具有显著增加水平的mtTFA mRNA、 PGC-1 a mRNA或两者的分化褐色脂肪细胞。线粒体标志物细胞色素氧化酶IV(COXIV)涉及 线粒体呼吸链。本公开提供如与未分化的BAT祖细胞相比具有显著增加水平的COX IV mRNA 的分化褐色脂肪细胞。脂肪酸结合蛋白-4( "FABP4"或"aP2"）和过氧化物酶体增殖物活 化受体-Y2( "PPARY 2"）基因只表达于脂肪细胞（褐色和白色）中。分化褐色脂肪细胞 可含有大量FABP4、PPAR γ 2或两者。本公开提供如与未分化的BAT祖细胞相比具有显著增 加水平的FABP4mRNA、PPAR γ 2mRNA或两者的分化褐色脂肪细胞。举例来说，图15展示在由 RDM诱导的分化后，RDM+cAMP或RDM+iso、PPAR γ 2mRNA水平分别增加10. 4倍、9. 2倍和6. 8 倍。
[0059] 根据一些实施方案的分化褐色脂肪细胞具有高水平的解偶联呼吸和/或高代谢 率。当质子跨越线粒体内膜泄漏而非穿过三磷酸腺苷合成酶（"ATP合成酶"）酶以驱动三 磷酸腺苷（"ATP"）的产生时，可发生解偶联呼吸。在跨越膜的质子电化学梯度中通过质 子运动释放的能量以热量形式耗散，而不是在制造 ATP的过程中耗散。解偶联呼吸可随着 细胞呼吸的部分（例如，氧消耗）的变化来测量，其独立于通过ATP合成酶的ATP形成而发 生。举例来说，在阻断ATP合成酶功能的寡霉素的存在下，氧化磷酸化的电子传递链中的氧 消耗提供解偶联呼吸的度量。
[0060] 本公开提供如与未分化的BAT祖细胞相比，具有显著增加水平的解偶联呼吸的分 化褐色脂肪细胞。在一些实施方案中，本公开提供具有总呼吸的约50%的解偶联呼吸水平 的分化褐色脂肪细胞。一些实施方案展现总呼吸的约20%至约50%范围内的水平的解偶 联呼吸。使用成人白色脂肪细胞中的解偶联呼吸水平作为比较标准，一些实施方案展现比 成人白色脂肪细胞大约1. 5至约3. 5倍范围内的解偶联呼吸。在一些实施方案中，解偶联 呼吸水平比成人白色脂肪细胞大约2. 5倍。本公开尤其提供分化褐色脂肪细胞，这些细胞 经过配备可经由氧化磷酸化的解偶联来代谢葡萄糖、氧化脂肪酸，并且以热量形式来耗散 能量。
[0061] 本公开提供在体外和体内促进BAT祖细胞分化成褐色脂肪细胞的条件和试剂（例 如，化合物、蛋白质、生物材料等）。在一些实施方案中，分化促进试剂为：PPARY活化剂、 调节剂或抑制剂（例如，罗格列酮）、PPARa活化剂或调节剂（例如，氯贝丁酯、GW9578)、 PPARS活化剂或调节剂（例如，GW501516或GW0742)、双重PPARa和PPARS活化剂或 调节剂、泛_PPAR( a、δ、γ )活化剂或调节剂（例如，GW4148)、TOE1抑制剂（例如，长春 西汀或IBMX)、TOE3抑制剂（例如，氰胍佐旦或IBMX)、TOE4抑制剂（例如，咯利普兰或 IBMX)、PDE7 抑制剂（例如，BMS586353 或 BRL50481 或 IBMX)、前列腺素 J2、9 a，11 β -前列 腺素 F2、9 β，11 a -前列腺素 F2、由垂体腺苷酸环化酶活化多肽（ADCYAP1或PACAP)基因 衍生的肽（PACAP 前肽、PACAP 相关肽、PACAP-38 或 PACAP-27)、二丁酰-cGMP、8-溴-cGMP、 NRIP1(RIP140)抑制剂、PTEN抑制剂（例如，双过氧（联吡啶）氧代钒酸钾或双过氧（5-羟 基吡啶-2-羧基）氧代钒酸二钾）、a 1-肾上腺素能完全或部分激动剂（例如，苯福林 或西拉唑啉）、a 2-肾上腺素能拮抗剂（例如，育亨宾）、RXRa活化剂或调节剂（例如， LGD1069(Targretin)或9-顺式维A酸）、PGC-la活化剂、PGC-Ιβ抑制剂或活化剂、脂肪 连接蛋白或脂肪连接蛋白受体AdipoRl和/或Adip 〇R2的活化剂、N0S抑制剂或活化剂（例 如，1400W、2-乙基-2-异硫脲或NG-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME)或腺苷）、Rho激酶-ROCK 抑制剂（例如，法舒地尔、HA1077)、BDNF、单胺氧化酶（MAO)A抑制剂和/或MAO B抑制剂 (例如，异卡波肼、吗氯贝胺、司立吉林）、SRC的活化剂、EGFR的抑制剂（例如，RG-14620、厄 洛替尼或ZD1839-吉非替尼或Argos蛋白质）、FAAH的抑制剂（例如，URB597)、MAPK1 (例 如，TO98059)或2 (例如，PD98059)或4或5或7或8 (例如，PD98059)的抑制剂、CDK9的 抑制剂（例如，1，5, 6, 7-四氢-2-(4-吡啶基）-4H-吡咯并[3, 2-c]吡啶-4-酮盐酸盐）、 TGR5激动剂（例如，齐墩果酸）、AMPK活化剂（例如，AICAR)、BMP-7、mT0R抑制剂（例如，雷 帕霉素）、腺苷酸环化酶活化剂（例如，毛喉素）、福莫特罗、沙丁胺醇、安非他酮、REV-5901、 24 (S)-羟基胆固醇、1，25-二羟维生素 D3、24, 25-二羟维生素 D3、前列腺素 J2、15d-前列腺 素 J2、9a, 11β-前列腺素 F2、9P, 11a-前列腺素 F2、二十碳三烯酸（20:3n-9)、二十二碳 六烯酸（22:6n-3)、二十二碳三烯酸（22:3n-3)、二十二碳五烯酸、溶血磷脂酸、米酵菌酸、 3-溴-7-硝基吲唑、孕烯醇酮16a腈、地棘蛙素、C0X-2抑制剂（例如，NS-398)，或任何前述 试剂的组合。
[0062] 在一些实施方案中，受试者包括人受试者用罗格列酮的治疗导致受试者骨骼肌中 的UCPlmRNA产量增加。在一些实施方案中，受试者用罗格列酮治疗可诱导骨骼肌中的褐色 脂肪细胞出现或分化、增强骨骼肌中的现有褐色脂肪细胞中的UCP1基因的表达，或两者。 举例来说，在一些实施方案中，骨骼肌中的褐色脂肪细胞的出现或分化可在患有代谢疾病 的受试者中诱导。褐色脂肪细胞可提供具有高线粒体和细胞呼吸和脂肪酸氧化率的葡萄糖 接收器（glucose sink)，以热量形式耗散能量（解偶联氧化磷酸化）。受试者代谢率可增 强，并且可诱导体重降低。诱导褐色脂肪细胞的出现或分化还可产生胰岛素敏感性、血糖稳 态和心血管疾病风险因素的改善。褐色脂肪细胞可进一步分泌有助于增加胰岛素敏感性和 改善血糖稳态或心血管健康的因子。
[0063] 本公开还提供允许识别试剂（例如，化合物、蛋白质、生物材料等）的测定，这些试 剂促进BAT祖细胞分化成褐色脂肪细胞和/或诱导UCP1基因在体外、体内或两者下的表 达。这类试剂可通过筛选化合物、蛋白质、生物材料等来识别。举例来说，在一些实施方案 中，分离的CD34+细胞可用于针对诱导UCP1基因表达和/或CD34+细胞分化成褐色脂肪细 胞的能力来对试剂进行筛选。用这种方式识别的试剂可用于各种研究、诊断和治疗用途，包 括例如治疗代谢疾病如肥胖症、2型糖尿病、胰岛素抵抗、血脂异常等。在一些实施方案中， 通过根据本公开的测定来识别的试剂加以优化以改善其物理化学和/或药代动力学性质。
[0064]在体外和体内的 BAT 祖细胞中的 UCPl、FABP4(aP2)、PPAR γ 2、mtTFA、PGC_l α 和 / 或COX IV的表达可根据本公开提供的方法来增强。在一些实施方案中，暴露于成脂培养基 可用于刺激 BAT 祖细胞中的 UCP1、FABP4 (aP2)、PPAR γ 2、mtTFA、PGC-1 α 和 / 或 COX IV 的 表达增加。试剂如PPARY活化剂、调节剂或抑制剂（例如，罗格列酮）、PPARa活化剂或调 节剂（例如，氯贝丁酯、GW9578)、PPARS活化剂或调节剂（例如，GW501516或GW0742)、双重 PPARa和PPAR δ活化剂或调节剂、泛-PPAR( a、δ、Y )活化剂或调节剂（例如，GW4148)、 TOE1抑制剂（例如，长春西汀或ΙΒΜΧ)、TOE3抑制剂（例如，氰胍佐旦或ΙΒΜΧ)、TOE4抑制 剂（例如，咯利普兰或IBMX)、TOE7抑制剂（例如，BMS586353或BRL50481或IBMX)、前列 腺素 J2、9 a，11 β -前列腺素 F2、9 β，11 a -前列腺素 F2、由垂体腺苷酸环化酶活化多肽 (ADCYAP1 或 PACAP)基因衍生的肽（PACAP 前肽、PACAP 相关肽、PACAP-38 或 PACAP-27)、 NRIP1(RIP140)抑制剂、PTEN抑制剂（例如，双过氧（联吡啶）氧代钒酸钾或双过氧（5-羟 基吡啶-2-羧基）氧代钒酸二钾）、a 1-肾上腺素能完全或部分激动剂（例如，苯福林 或西拉唑啉）、a 2-肾上腺素能拮抗剂（例如，育亨宾）、RXRa活化剂或调节剂（例如， LGD1069(Targretin)或9-顺式维A酸）、PGC-la活化剂、PGC-Ιβ抑制剂或活化剂、脂肪 连接蛋白或脂肪连接蛋白受体AdipoRl和/或Adip 〇R2的活化剂、N0S抑制剂或活化剂（例 如，1400W、2-乙基-2-异硫脲或NG-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME)或腺苷）、Rho激酶-ROCK 抑制剂（例如，法舒地尔、HA1077)、BDNF、单胺氧化酶（MAO)A抑制剂和/或MAO B抑制剂 (例如，异卡波肼、吗氯贝胺、司立吉林）、SRC的活化剂、EGFR的抑制剂（例如，RG-14620、厄 洛替尼或ZD1839-吉非替尼或Argos蛋白质）、FAAH的抑制剂（例如，URB597)、MAPK1 (例 如，TO98059)或2 (例如，PD98059)或4或5或7或8 (例如，PD98059)的抑制剂、CDK9的 抑制剂（例如，1，5, 6, 7-四氢-2-(4-吡啶基）-4H-吡咯并[3, 2-c]吡啶-4-酮盐酸盐）、 TGR5激动剂（例如，齐墩果酸）、AMPK活化剂（例如，AICAR)、BMP-7、mT0R抑制剂（例如，雷 帕霉素）、腺苷酸环化酶活化剂（例如，毛喉素）、福莫特罗、沙丁胺醇、安非他酮、REV-5901、 24 (S)-羟基胆固醇、1，25-二羟维生素 D3、24, 25-二羟维生素 D3、前列腺素 J2、15d-前列腺 素 J2、9a, 11β-前列腺素 F2、9P, 11a-前列腺素 F2、二十碳三烯酸（20:3n-9)、二十二碳 六烯酸（22:6n-3)、二十二碳三烯酸（22:3n-3)、二十二碳五烯酸、溶血磷脂酸、米酵菌酸、 3-溴-7-硝基吲唑、孕烯醇酮16a腈、地棘蛙素、C0X-2抑制剂（例如，NS-398)或其组合也 可用于刺激 BAT 祖细胞中的 UCP1、FABP4 (aP2)、PPAR γ 2、mtTFA、PGC-1 α 和 / 或 COX IV 表 达增加。 实施例
[0065] 本发明教导的方面可进一步鉴于以下实施例来了解，这些实施例不应被视为以任 何方式限制本发明教导的范围。
[0066] 实施例1 :肌肉血管细胞的分诜和分化。
[0067] 在胎儿骨骼肌中，通过免疫组织化学发现⑶34和⑶146分别表达于内皮细胞和周 细胞的表面，但是⑶34也由分散于肌原纤维间空间中的细胞来表达。已经发现⑶146+周 细胞包围⑶34+内皮细胞。在成人骨骼肌中观察到⑶34+和⑶146+细胞的类似分布。 [0068] 来自七个独立胎儿肌肉（妊娠16-24周）的血管细胞使用多色荧光活化细胞分 选（FACS)来分选。如同生肌祖细胞（⑶56+) -样，首先将造血（⑶45+)细胞选出。然后， 分选内皮细胞（CD34+/CD146-)和周细胞（CD34-/CD146+)。其后将 CD34+/CD146-/CD45-/ ⑶56-指定为⑶34+细胞，并且⑶34-/⑶146+/⑶45-/⑶56-指定为⑶146+细胞。图1A展示 CD34+/CD146-和 CD34-/CD146+ 细胞纯化。分离的细胞用 PE-抗-CD34、FITC-抗-CD146、 PE-Cy7-抗-CD56和APC-Cy7-抗-CD45抗体染色并且在FACS Aria细胞分选仪上运作。在 排除⑶45+和⑶56+细胞（左图）之后，将⑶34+或⑶146+门控内部的细胞分离。⑶34+ 细胞达起始胎儿肌细胞群体的8+1 %。
[0069] 图 1B 展示对于 CD34+/CD146-/CD45-/CD56-(CD34)、CD34-/CD146+/CD45-/ ⑶56-(⑶146)和总未分选的细胞的RT-PCR分析。肌动蛋白mRNA作为对照来测量。⑶34+ 细胞显示未受可检测的⑶45+造血或⑶56+生肌细胞污染。
[0070] 分选细胞在EGM2培养基中生长4-6天，并且在成脂培养基中生长8-12天，如在材 料和方法中所描述。这些条件维持WAT原代培养物中的白色脂肪细胞分化。图2展示原代 培养物（PC)中的CD34+(图2A)和CD146+(图2B、图2C)细胞和在培养物中扩增直至继代 3(P3)的CD34+(图2D)细胞。实质上所有分选胎儿肌肉CD34+细胞分化成脂肪细胞样多腔 细胞（图2A、2D)。显著地，在细胞培养物中，多腔结构由白色和褐色脂肪细胞共有。相比之 下，胎儿肌肉CD146+细胞在如上所述条件下成长非常缓慢。其未达到细胞融合并且展示周 细胞样外观，特征在于大尺寸、扩展开的形状和不规则边界（图2B和2C)。可检测到偶然的 多腔细胞（图2C)在如上所述的条件下在培养物中扩增直至3继代（4周）的CD34+细胞 的形态类似于在原代培养物中观察到的形态，但是成熟脂肪细胞的尺寸较小（图2D)。
[0071] 在某些实施方案中，⑶45+细胞和/或⑶56+细胞可保持于⑶34+/⑶146-群体 中；也就是说，在不首先选出⑶45+细胞和⑶56+细胞中的至少一个的情况下分选⑶34+/ ⑶146-细胞。已经观察到⑶45+和⑶56+群体可相对较小（例如，每个群体小于来自肌肉 的总间质血管细胞的5%、小于4%、小于3%、小于2%或小于1% )。因此，可分离相对纯 褐色脂肪细胞祖细胞群体而不需要选出⑶45+和⑶56+群体中的至少一个。此外，⑶45+ 细胞是造血祖细胞并且在成脂培养基中不显著生长或分化。CD56+细胞是肌肉前体并且在 成脂培养基中不显著生长或分化。因此，CD45+细胞和/或CD56+细胞的存在不显著影响 CD34+细胞的增殖和/或分化。
[0072] 实施例2 :培养CD34+细朐中的UCP1表汰。
[0073] 胎儿肌肉CD34+细胞的显著脂肪细胞样分化是进一步表征的诱因。引人关注的 是，定量RT-PCR显示这些细胞中的较高水平UCPlmRNA。图2E展示原代培养物（PC)或扩 增直至继代3(P3)中的⑶34+细胞中的UCP1 (空列）和瘦蛋白（灰色列）mRNA表达的定 量RT-PCR确定。相对于亲环蛋白A归一化的平均UCPlmRNA水平是1797±510任意单位 (即，使用相应亲环蛋白A值来归一化的任意值土 s. e. m. ;n = 4-7)，对应于相对于测定中 的25ng cDNA，周期阈值（Ct)为22。
[0074] 出于比较，培养物中分化的小鼠褐色脂肪细胞中的相对于亲环蛋白A归一化的平 均UCPlmRNA水平是7715±2649 (η = 10)任意单位。因此，人⑶34+细胞中的UCPlmRNA水 平达小鼠褐色脂肪细胞培养物中的UCPlmRNA水平的几乎四分之一。人胎儿BAT不用作定 量RT-PCR分析的阳性对照，因为由于终止妊娠之后过去的时间，RNA降解风险较高。将克隆 扩增子并且测序，并且发现与人UCP1100%相同。在扩增直至继代3的胎儿肌肉⑶34+细胞 中，仍然观察到原代培养细胞中所检测的UCPlmRNA表达水平43 %的高UCPlmRNA表达。在 未分化胎儿肌肉CD34+细胞中或在原代培养物的CD146+细胞中，未检测到UCPlmRNA表达。 在原代培养和扩增细胞中，瘦蛋白mRNA水平分别是9. 9 ±5. 5和71 ±52任意单位（图2E)。
[0075] 实施例3 :⑶34+细朐的额外表型。
[0076] 为了更好地表征培养物中扩增的胎儿肌肉⑶34+细胞的基因表达模式，执行基因 芯片分析。具有显著检测P值（P〈〇. 01)的若干代表基因 mRNA的表达水平展示于表1并 且与人肌肉活检中的那些表达水平比较。选择以下蛋白质mRNA :UCP1作为参考基因，涉及 控制生热作用和线粒体发生的线粒体转录因子A (mtTFA)和过氧化物酶体增殖物活化受体 (PPAR γ )和PPAR γ辅助活化剂-1 a (PGC-1 α )、线粒体呼吸链琥珀酸脱氢酶（SDH)和细胞 色素氧化酶IV (COX IV)、脂肪酸降解途径的酶、肉碱棕榈酰转移酶IB (CPT1B)、酰基-辅酶A 脱氢酶长链（ACAD)和C-4至C-12直链（ACADM)，和骨骼肌标志物肌细胞生成素、生肌因子 5 (Myf5)和生肌分化1 (MyoDl)。在BAT中高度表达并且可充当UCP1活性[16]抑制因子的 Cidea选择为BAT标志物。这些基因的GenBank登记号展示于补充数据中。
[0077] 表 1
[0078]

【权利要求】
1. 一种褐色脂肪组织（BAT)祖细胞， 其中所述BAT祖细胞从人骨骼肌中分离并且能够分化成褐色脂肪细胞， 其中所述BAT祖细胞表达与内皮细胞相关的第一细胞表面标志物，所述第一细胞表面 标志物在基于抗体的测定中使用第一抗体可检测到；并且 其中所述BAT祖细胞大致上不含与内皮细胞相关的第二细胞表面标志物，所述第二细 胞表面标志物在所述基于抗体的测定中使用第二抗体大致上不可检测到。
2. 如权利要求1所述的BAT祖细胞，其进一步包括以下各项中的至少一个： 其中所述BAT祖细胞大致上不含与造血细胞相关的第三细胞表面标志物，所述第三细 胞表面标志物在所述基于抗体的测定中使用第三抗体大致上不可检测到； 其中所述BAT祖细胞大致上不含与生肌细胞相关的第四细胞表面标志物，所述第四细 胞表面标志物在所述基于抗体的测定中使用第四抗体大致上不可检测到；和/或 其中所述BAT祖细胞大致上不含与周细胞相关的第五细胞表面标志物，所述第五细胞 表面标志物在所述基于抗体的测定中使用第五抗体大致上不可检测到。
3. 如权利要求1或2所述的BAT祖细胞，其中所述第一细胞表面标志物是CD34并且所 述第一抗体是抗-⑶34抗体。
4. 如权利要求1至3中任一项所述的BAT祖细胞，其中所述第二细胞表面标志物是 ⑶31并且所述第二抗体是抗-⑶31抗体。
5. 如权利要求2至4中任一项所述的BAT祖细胞，其中所述第三细胞表面标志物是 ⑶45并且所述第三抗体是抗-⑶45抗体。
6. 如权利要求2至5中任一项所述的BAT祖细胞，其中所述第四细胞表面标志物是 ⑶56并且所述第四抗体是抗-⑶56抗体。
7. 如权利要求2至6中任一项所述的BAT祖细胞，其中所述第五细胞表面标志物是 ⑶146并且所述第五抗体是抗-⑶146抗体。
8. 如权利要求1至7中任一项所述的BAT祖细胞，其中所述BAT祖细胞在增殖培养基 中增殖。
9. 如权利要求8所述的BAT祖细胞，其中所述增殖培养基包括骨形态形成性蛋白 质-7(BMP7)。
10. 如权利要求1至9中任一项所述的BAT祖细胞，其中所述BAT祖细胞在分化培养基 中分化成褐色脂肪细胞。
11. 如权利要求10所述的BAT祖细胞，其中所述分化培养基是基本分化培养基（MDM)。
12. 如权利要求10所述的BAT祖细胞，其中所述分化培养基包括过氧化物酶体增殖物 活化受体Y (PPARY)激动剂。
13. -种从骨骼肌中分离的细胞群体，其包括至少一种如权利要求1至12中任一项所 述的BAT祖细胞。
14. 一种用于识别BAT祖细胞的方法，其包括： 提供从骨骼肌分离的细胞群体； 使所述细胞群体与分别对于第一和第二细胞表面标志物具有特异性的第一和第二抗 体接触，其中所述第一和第二细胞表面标志物各自与内皮细胞相关；并且 在基于抗体的测定中确定表达第一细胞表面标志物并且大致上不含第二细胞表面标 志物的BAT祖细胞。
15. 如权利要求14所述的方法，其中所述第一细胞表面标志物是CD34并且所述第一抗 体是抗-⑶34抗体。
16. 如权利要求14或15所述的方法，其中所述第二细胞表面标志物是CD31并且所述 第二抗体是抗-CD31抗体。
17. 如权利要求14至16中任一项所述的方法，其进一步包括以下各项中的至少一个： 使所述细胞群体与对于与造血细胞相关的第三细胞表面标志物具有特异性的第三抗 体接触，所述第三细胞表面标志物在所述基于抗体的测定中使用所述第三抗体大致上不可 检测到； 使所述细胞群体与对于与生肌细胞相关的第四细胞表面标志物具有特异性的第四抗 体接触，所述第四细胞表面标志物在所述基于抗体的测定中使用所述第四抗体大致上不可 检测到；和/或 使所述细胞群体与对于与周细胞相关的第五细胞表面标志物具有特异性的第五抗体 接触，所述第五细胞表面标志物在所述基于抗体的测定中使用所述第五抗体大致上不可检 测到。
18. 如权利要求17所述的方法，其中所述第三细胞表面标志物是CD45并且所述第三抗 体是抗-⑶45抗体。
19. 如权利要求17或18所述的方法，其中所述第四细胞表面标志物是CD56并且所述 第四抗体是抗-CD56抗体。
20. 如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述第五细胞表面标志物是CD146 并且所述第五抗体是抗-⑶146抗体。
21. 如权利要求14至20中任一项所述的方法，其进一步包括通过选择表达所述第一细 胞表面标志物并且不表达所述第二细胞表面标志物的细胞来分离所述细胞群体。
22. 如权利要求14至21中任一项所述的方法，其进一步包括通过选择表达所述第一细 胞表面标志物并且不表达第二细胞表面标志物，以及第三、第四和第五细胞表面标志物中 的至少一个细胞表面标志物的细胞来分离所述细胞群体。
23. 如权利要求22所述的方法，其中所述选择包括选择表达⑶34并且不表达⑶31、 CD45、CD56 或 CD146 的细胞。
24. 如权利要求14至23中任一项所述的方法，其进一步包括分离所述BAT祖细胞。
25. 如权利要求14至24中任一项所述的方法，其进一步包括在增殖培养基中培养所述 BAT祖细胞，从而离体扩增BAT祖细胞。
26. -种用于诱导BAT祖细胞分化成褐色脂肪细胞的方法，其包括： 提供如权利要求1至13中任一项所述的BAT祖细胞； 使所述BAT祖细胞暴露于分化培养基；并且 在所述分化培养基中培养所述BAT祖细胞以诱导所述BAT祖细胞分化成褐色脂肪细 胞。
27. 如权利要求26所述的方法，其中所述分化培养基是基本分化培养基（MDM)。
28. 如权利要求26或27所述的方法，其中所述分化培养基包括过氧化物酶体增殖物活 化受体Y (PPARY)激动剂。
29. 如权利要求26至28中任一项所述的方法，其进一步包括使所述BAT祖细胞暴露于 增殖培养基。
30. 如权利要求29所述的方法，其中所述增殖培养基包括骨形态形成性蛋白 质-7(BMP7)。
31. 用于治疗个体的代谢疾病或病状的BAT祖细胞， 其中： 所述BAT祖细胞从所述个体或供体的骨骼肌中获得； 所述BAT祖细胞通过在培养基中培养来繁殖；并且 将所述培养的细胞移植至所述个体。
32. 如权利要求31所述的BAT祖细胞，其中经由在分化培养基中离体培养来诱导所述 BAT祖细胞分化成褐色脂肪细胞。
33. 如权利要求31或32所述的BAT祖细胞，其中所述代谢疾病是肥胖症、超重、葡萄糖 耐量受损、胰岛素抵抗、2型糖尿病、血脂异常、高血压、心血管疾病、代谢综合征、帕-魏二 氏综合症或1型糖尿病。
34. -种用于识别诱导BAT祖细胞分化成褐色脂肪细胞的试剂的方法，其包括： 提供如权利要求1至13中任一项所述的BAT祖细胞； 使所述BAT祖细胞与试剂接触； 确定是否所述BAT祖细胞表现出分化成褐色脂肪细胞的指标。
35. 如权利要求34所述的方法，其中所述分化指标可为以下各项中的一个或多个的增 加：UCP1蛋白质或mRNA的表达、FABP4(aP2)蛋白质或mRNA的表达、PPARY2蛋白质或mRNA 的表达、mtTFA蛋白质或mRNA的表达、PGC-1 α蛋白质或mRNA的表达、解偶联呼吸、呼吸率、 代谢率、葡萄糖利用率、脂肪酸氧化率和其组合。
36. -种用于识别诱导UCP1的表达或活性水平的试剂的方法，其包括： 提供如权利要求1至13中任一项所述的BAT祖细胞； 使所述BAT祖细胞与试剂接触； 确定是否所述BAT祖细胞表现出UCP1表达或活性的增加。
37. -种使用如权利要求34至36中任一项所述的方法来识别的试剂，其用于制造治疗 患者的代谢疾病的药物。
38. -种使用如权利要求34至36中任一项所述的方法来识别的试剂，其用于制造治疗 或预防患者的体温过低的药物。
【文档编号】G01N33/48GK104066836SQ201280055539
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2012年11月9日 优先权日:2011年11月10日
【发明者】奥利弗·D·博斯, 米哈埃拉·克里桑, 让-保罗·贾科比诺 申请人:释放能量医药股份有限公司, 奥利弗·D·博斯, 米哈埃拉·克里桑, 让-保罗·贾科比诺