一种骨骼肌脱细胞基质生物补片及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及生物医学工程【技术领域】，公开了一种骨骼肌脱细胞基质生物补片及其制备方法，该制备方法包含以下步骤：(1)前期处理：取已死亡动物的腹直肌肌肉组织，冲洗除去表面的血凝块，无菌条件下剔除表面脂肪组织和筋膜组织后冲洗；(2)脱细胞处理：反复冻融，漂洗，浸入烷基糖苷溶液中，常温振荡12～24小时；将烷基糖苷废液倒掉，冲洗；加入含DNA酶和RNA酶的盐溶液中，37℃下振荡24～36小时，将组织取出冲洗；(3)冻干和消毒，即制得骨骼肌脱细胞基质生物补片。所制得的生物补片在彻底除去组织表面和内部的细胞的基础上，更好地保留了骨骼肌的三维框架微结构，适用于作为生物修复材料广泛应用于生物医学工程领域。
【专利说明】一种骨骼肌脱细胞基质生物补片及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学工程【技术领域】，特别涉及一种生物补片及其制备方法。
【背景技术】
[0002]脱细胞基质生物补片作为常用的生物修复材料，来源于牛、猪、马、人等哺乳动物的小肠粘膜下层、皮肤、膀胱、心包等这些富含胶原的组织。经过脱细胞技术处理后，保留有正常细胞外基质的三维立体结构。生物补片植入到缺损处，能起到很好的支架作用，填补受损部位的缺失组织，并在该材料的诱导下，促进宿主细胞在其三维结构上生长并分泌细胞外基质，形成自身组织并完成在缺损部位的修复重建，完成器官组织再生的过程。生物补片凭借其具有的完全可降解性、较好的生物相容性及促进宿主组织长入等优点，越来越受到医学研究者的关注。
[0003]脱细胞基质补片主要由胶原、糖蛋白、弹性纤维、粘多糖、生长因子构成。胶原成分占细胞外基质干重的90%;肝素、硫酸肝素、软骨素A和B、透明质酸等粘多糖结合有生长因子和细胞因子成分，他们促进细胞外基质保留水分并维持凝胶状形态；VEGF和TGF-β等生长因子虽然总量不多，但它们在调节细胞迁移、增殖和分化方面具有重要作用。这些脱细胞基质支架植入人体或动物体内后容易降解，降解后形成单肽类结构物质，对宿主组织和细胞具有趋化性和促进其增殖分化等作用。尽管这些生物补片有的取自异体组织，但由于去除了引起宿主免疫排斥反应的成分，只保留有同源性的细胞外基质成分，故组织相容性较好，移植后很少产生排斥反应。
[0004]除此之外，ECM还具有传递信号分子的作用，这种信号分子的传递作用表现在ECM支架的降解过程中。ECM支架除了具有很多生物结构大分子外还含有大量生长因子等活性成分。同时，在伴随支架降解过程中会释放一些可溶性的单肽片段，相应支架的结构会发生改变，抑制ECM支架降解的肽类会被合成和释放，并启动化学交联过程，从而调节宿主组织对ECM支架的重塑步骤。
[0005]骨骼肌脱细胞基质生物补片来源于肌肉组织，肌肉组织主要由肌细胞和肌细胞分泌的细胞外基质组成。其中骨骼肌细胞外基质不仅具备像其他组织来源的细胞外基质的生物活性成分和结构，而且由于骨骼肌组织拥有良好的收缩性和丰富的毛细血管，其细胞外基质成分中I，IV等胶原和生长因子等活性成分含量非常高。因此骨骼肌脱细胞基质补片是一种具有很好应用前景的生物支架。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种骨骼肌脱细胞基质生物补片及其制备方法，按照该方法制得的骨骼肌脱细胞基质生物补片在彻底除去存在于组织表面和内部的细胞的基础上，更好地保留骨骼肌的三维框架微结构。
[0007]为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供的骨骼肌脱细胞基质的制备方法，包含以下步骤:
[0008](1)前期处理:取已死亡动物的腹直肌肌肉组织，冲洗除去表面的血凝块，在无菌条件下剔除表面的脂肪组织和筋膜组织，再次冲洗；
[0009](2)脱细胞处理:将上述经过前期处理后的腹直肌组织进行反复冻融，然后漂洗，浸入到质量浓度为1?10%的烷基糖苷溶液中，常温下振荡12?24小时；将烷基糖苷废液倒掉，冲洗；再加入含DNA酶和RNA酶的MgCl2溶液中，在37°C下振荡24?36小时，将组织取出，冲洗；
[0010](3)冻干和消毒:将上述经过脱细胞处理后的腹直肌组织进行冻干处理，然后以Y射线辐射灭菌，即制得骨骼肌脱细胞基质生物补片。
[0011]本发明的实施方式提供了一种骨骼肌脱细胞基质生物补片的制备方法。相对于现有技术中的骨骼肌脱细胞基质制备方法，本发明的实施方式所提供的方法简单、有效、成本低，在彻底除去存在于组织表面和内部的细胞的基础上，更好地保留有骨骼肌的三维框架微结构，具有较好的力学性能和生物活性。
[0012]现有技术文献中报道的脱细胞基质的制备方法主要有:酶消化法、醇类溶液法和化学洗涤剂法等，在制备过程中多是结合使用。以上几种方法要达到脱细胞彻底的效果，必然或多或少会破坏基质内部的支架结构，引起基质内部活性蛋白变性，从而在一定程度上影响制备得到的脱细胞基质材料的力学性能和生物活性。本发明的实施方式在保证脱细胞效果的基础上，为了减少制备方法对支架内部结构和活性的影响，采用了烷基糖苷进行脱细胞处理。烷基糖苷是由可再生资源天然脂肪醇和葡萄糖合成的，是一种性能较全面的新型非离子表面活性剂，无毒，且易于生物降解，对人体无害，性能温和，对细胞外基质的超微结构和活性蛋白几乎没有损伤。同时烷基糖苷还具有高表面活性、良好的生态安全性和相溶性。为了进一步加强烷基糖苷脱细胞效果，本发明的实施方式还结合了冻融方法和核酸酶溶液共同处理腹壁骨骼肌。经体外试验表明，本发明的方法在保证脱细胞效果的同时具备有良好的力学性能和生物活性成分，证实本发明的实施方式所提供的方法在骨骼肌脱细胞基质材料的制备中有重要的应用意义。
[0013]优选地，本发明的实施方式中，步骤(1)取已死亡动物的腹直肌肌肉组织时，供体动物优为新鲜健康牛或猪，取材时间为动物死亡后30分钟内。组织和器官的细胞外基质提供了细胞发挥功能和维持表型的微环境，这种微环境的结构和成分在不同组织器官具有一定的差异，因此同源性脱细胞基质材料修复相应组织的效果较好。肌肉脱细胞基质来源的成分对于促进成肌细胞增殖和分化具有重要的影响，因此本发明的实施方式采用死亡动物的腹直肌肌肉组织作为制备脱细胞基质生物补片的材料来源，可使最终制备得到的生物补片更好地适应于对肌肉缺失的生物修复。
[0014]优选地，本发明的实施方式中，步骤(1)中的两次冲洗操作所采用的冲洗液为含有链霉素和青霉素的去离子水或PBS缓冲液；所述青霉素在所述冲洗液中的浓度为100 μ g/ml、所述链霉素在所述冲洗液中的浓度为100yg/ml。采用含有链霉素和青霉素双抗的去离子水或PBS缓冲液作为冲洗液，对动物的腹直肌肌肉组织材料进行冲洗，可达到抑制细菌和真菌生长的作用。
[0015]优选地，本发明的实施方式中，步骤(2)中反复冻融的方法为:将所述腹直肌组织置于-80°C冰箱3?6小时，然后取出放在37°C水浴箱中30?60分钟左右，冻融的次数为3次。上述步骤(2)中对腹直肌组织进行反复冻融的作用为:冻融方法可以有效地使组织和器官中的细胞裂解，单次冻融可以减少免疫排斥反应，反复冻融多用于脱细胞处理。冻融处理最大的优点是对组织的机械性能影响不大，因为其不会减少细胞外基质胶原纤维的含量。
[0016]优选地，本发明的实施方式中，步骤(2)中所采用的MgCl2溶液的浓度为0.05mol/L，，所述18(:12溶液中含DNA酶的浓度为100?200μ g/ml，含RNA酶的浓度为100?200 μ g/ml。在烷基糖苷处理后，采用含有核酸酶和脱氧核酸酶的MgCl2溶液继续对腹直肌进行处理，裂解核酸的序列，可以清除细胞内残留的核酸物质。
[0017]优选地，本发明的实施方式中，步骤(3)中，冻干处理的方法为:置于-60?_50°C真空冷冻干燥机进行冻干处理18?24小时。通过该冻干处理步骤，使得残留在补片内的水分去掉，便于将制得的生物补片更好地保存。
[0018]本发明的实施方式也提供根据上述方法制备得到的骨骼肌脱细胞基质生物补片。该骨骼肌脱细胞基质生物补片由于在彻底除去存在于组织表面和内部的细胞的基础上，保留有骨骼肌的三维框架微结构，因而具有较好的力学性能和生物活性，适用于作为生物修复材料广泛应用于生物医学工程领域，尤其是作为骨骼肌缺损的修复材料。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是实施例3中的HE染色结果对比示意图:
[0020]其中，1A为实施例1制得的生物补片的HE染色结果图、IB为实施例2制得的生物补片的HE染色结果图、1C为正常骨骼肌的HE染色结果图；
[0021]图2是实施例3中的残留DNA测定试验的数据图；
[0022]图3是实施例3中的组织结构成分检测结果对比示意图:
[0023]其中，3A为实施例1制得的生物补片的Masson染色结果图、3B为实施例2制得的生物补片的Masson染色结果图、
[0024]3C为实施例1制得的生物补片的PAS染色结果图、3D为实施例2制得的生物补片的PAS染色结果图、
[0025]3E为实施例1制得的生物补片的I型胶原免疫组化染色结果图、3F为实施例2制得的生物补片的I型胶原免疫组化染色结果图、
[0026]3G为实施例1制得的生物补片的纤连蛋白免疫组化染色结果图、3H为实施例2制得的生物补片的纤连蛋白免疫组化染色结果图；
[0027]图4是实施例3中的Elisa定量检测活性蛋白含量试验的结果示意图:
[0028]其中，4A为总蛋白含量检测结果图、4B为VEGF蛋白含量检测结果图、4C为IGF-1蛋白含量检测结果图；
[0029]图5是实施例3中的扫描电镜超微结构示意图:
[0030]其中，5A为实施例1制得的生物补片的扫描电镜图、5B为实施例2制得的生物补片的扫描电镜图。
【具体实施方式】
[0031]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。
[0032]实施例1猪源性骨骼肌脱细胞基质支架的制备
[0033]本实施例涉及猪源性骨骼肌脱细胞基质生物补片的制备实例:(1)前期处理:从死亡的供体猪的体内取出腹直肌，使用0?8°C的去离子水或者ph值为7.4左右的缓冲盐溶液(PBS)反复冲洗以除去表面的血凝块，无菌条件下剔除表面脂肪组织，筋膜组织后，剪成2X 2cm2大小片状，继续用去离子水或者ph值为7.4左右的缓冲盐溶液(PBS)进行冲洗。上述两次冲洗步骤所使用的去离子水或者缓冲盐溶液中含有青霉素100 μ g/ml和链霉素100 μ g/ml.(2)脱细胞处理:本部分将冻融法，烷基糖苷和核酸酶溶液相结合进行脱细胞处理，步骤如下，将上述腹直肌组织置于_80°C冰箱4h，然后取出放在37°C水浴箱中30min，如此反复冻融3次。无菌去离子水漂洗30min后，将其浸入到1%烷基糖苷溶液(APG0810)中，常温下置于摇床中以lOOrpm/min的速度振荡12h。将烷基糖苷废液倒掉，去离子水冲洗30min, PBS 溶液冲洗 2 次，每次 30min。然后加入 150 μ g/ml Dnase 和 100 μ g/mlRnase 的
0.05M MgCl2溶液中，以100rpm/min的速度在37°C摇床中振荡24h。最后将组织取出，PBS冲洗2次，每次30min，去离子水冲洗2次，每次30min。(3)冻干和消毒:将脱细胞后的腹直肌组织置于-50°C真空冷冻干燥机行冻干处理18h，然后γ射线辐射灭菌，无菌环境下保存于-80°C冰箱备用。
[0034]实施例2对比制备实验例(Badylak制备方法)
[0035]根据Badylak提供的标准骨骼肌脱细胞基质制备方法制备脱细胞基质生物补片:前期处理和冻干消毒步骤与本发明实施例1相同，脱细胞处理步骤如下:将胰酶，洗涤剂，醇类和螯合剂相结合进行脱细胞处理。首先将经过前期处理后的腹直肌组织在配有0.2%胰蛋白酶/0.2% EDTA的烧瓶中，烧瓶放入37°C恒温振荡箱2?4h，然后将烧瓶里废液弃掉，去离子水冲洗30min，PBS冲洗2次，每次30min。加入2%脱氧胆酸钠溶液，常温下振荡箱5?7h，将废液弃掉，去离子水冲洗30min，PBS冲洗2次，每次30min。加入新鲜2%脱氧胆酸钠溶液，继续常温下振荡箱14?16min,废液弃掉，加入1% TritonX-ΙΟΟΙ?3h,去离子水冲洗30min后，加入0.1 %过氧乙酸/4%乙醇溶液2h，PBS冲洗2次，每次30min，去离子水冲洗2次，每次30min后，将其行冻干和消毒，最后保存在_80°C冰箱备用。
[0036]实施例3体外试验测定结果对比
[0037]将上述实施例1和实施例2两种制备方案得到的骨骼肌脱细胞基质生物补片进行体外试验测定比较，证实本发明得到的骨骼肌脱细胞基质材料生物活性较好，结果如下:
[0038](1)脱细胞程度测定:两种支架材料经石蜡包埋后切片行苏木素-伊红染色(HE染色)，证实无明显细胞核残留，正常骨骼肌HE染色后细胞核有表达(图1A显示实施例1制备的生物补片无明显细胞核残留，图1B显示实施例2制备的生物补片无明显细胞核残留，图1C示正常骨骼肌的细胞核)。结合PicoGreen assay试剂盒进行残留DNA测定发现(图2显示残留DNA测定结果)，本发明实施例1制备得到的骨骼肌脱细胞基质生物补片中DNA含量为68.59± 10.lng/mg,实施例2制备得到的骨骼肌脱细胞基质生物补片中DNA含量为81.35±8.5ng/mg，两者之间无统计学差异，正常骨骼肌DNA含量为838.7±57.94ng/mg，相对于脱细胞基质差异具有统计学意义。
[0039](2)组织结构成分:通过马森染色(Masson染色)发现，实施例1制备得到的骨骼肌脱细胞基质生物补片(图3A)和实施例2制备得到的脱细胞基质生物补片(图3B)中的胶原纤维排列整齐，呈波浪状平行排列，无明显断裂。PAS染色主要用来检测组织中的糖类成分，实施例1制备得到的骨骼肌脱细胞基质生物补片(图3C)和实施例2制备得到的脱细胞基质生物补片(图3D)中的糖类成分也被保留下来。为了进一步验证脱细胞处理后的细胞外基质成分是否改变，我们选择细胞外基质中表达比较广泛的两类蛋白，I型胶原(图3E显示实施例1制备得到的骨骼肌脱细胞基质生物补片、图3F显示实施例2制备得到的骨骼肌脱细胞基质生物补片)和纤连蛋白(图3G显示实施例1制备得到的骨骼肌脱细胞基质生物补片、图3H显示实施例2制备得到的脱细胞基质生物补片)，进行免疫组化染色检测，发现它们同样在两类骨骼肌脱细胞基质生物补片上有阳性表达。
[0040](3)生长因子和活性蛋白含量:Elisa定量检测(图4A)发现:尽管实施例1制备得到的脱细胞基质生物补片中总蛋白含量要比实施例2制备得到的生物补片中总蛋白含量高(33.89±4.139mg/g vs 27.27±2.096mg/g)，但两者之间差异无统计学意义，其中VEGF蛋白含量(图4B)和IGF-1蛋白含量(图4C)也是实施例1所制得的脱细胞基质生物补片中较高，VEGF蛋白在实施例1制备的补片中含量为1.228±0.04571ng/mg，在实施例2制得的补片中含量为0.7806±0.01773ng/mg, VEGF蛋白含量之间的差异有统计学意义；IGF-1蛋白在实施例1制备的补片中含量为47.23±9.495ng/mg，在实施例2制得的生物补片中含量为18.78±4.625ng/mg, IGF-1蛋白含量之间的差异有统计学意义。
[0041](4)超微结构:扫描电镜(SEM)显示实施例1制备得到的骨骼肌脱细胞基质生物补片(图5A)和实施例2制备得到的骨骼肌脱细胞基质(图5B)均保留了天然骨骼肌细胞外基质排列的周期性条索状肌膜微结构，其中看不到无明显的细胞成分。
[0042]综上所述，本发明提供的改良方法简单，原料来源成本低，所用试剂无毒，对细胞外基质活性成分影响小，有较好的力学性能和生物活性，并能有效的去除组织内部的细胞成分，是一种具有良好应用前景的骨骼肌脱细胞基质支架材料。
[0043]本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
【权利要求】
1.一种骨骼肌脱细胞基质生物补片的制备方法，其特征在于，包含以下步骤: (1)前期处理:取已死亡动物的腹直肌肌肉组织，冲洗除去表面的血凝块，在无菌条件下剔除表面的脂肪组织和筋膜组织，再次冲洗； (2)脱细胞处理:将上述经过前期处理后的腹直肌肌肉组织进行反复冻融，然后漂洗，浸入到质量浓度为1?10%的烷基糖苷溶液中，常温下振荡12?24小时；将烷基糖苷废液倒掉，冲洗；再加入含0嫩酶和謂\酶的1甙12溶液中，在371下振荡24?36小时，将组织取出，冲洗； (3)冻干和消毒:将上述经过脱细胞处理后的腹直肌肌肉组织进行冻干处理，然后以V射线辐射灭菌，即制得骨骼肌脱细胞基质生物补片。
2.根据权利要求1所述的骨骼肌脱细胞基质生物补片的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中取已死亡动物的腹直肌肌肉组织时，供体动物为牛或猪，取材时间为动物死亡后30分钟内。
3.根据权利要求1所述的骨骼肌脱细胞基质生物补片的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的两次冲洗操作所采用的冲洗液为含有链霉素和青霉素的去离子水或？83缓冲液；所述青霉素在所述冲洗液中的浓度为1009 8加1、所述链霉素在所述冲洗液中的浓度为 100 9 。
4.根据权利要求1所述的骨骼肌脱细胞基质生物补片的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中反复冻融的方法为:将所述腹直肌肌肉组织置于-801冰箱3?6小时，然后取出放在371水浴箱中30?60分钟。
5.根据权利要求1所述的骨骼肌脱细胞基质生物补片的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中反复冻融的次数为3次。
6.根据权利要求1所述的骨骼肌脱细胞基质生物补片的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的两次振荡操作均在摇床中进行，摇床的转速为100?15011)111/111111。
7.根据权利要求1所述的骨骼肌脱细胞基质生物补片的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的1甙12溶液的浓度为0.0511101/1。
8.根据权利要求1所述的骨骼肌脱细胞基质生物补片的制备方法，其特征在于，所述1^12溶液中含0嫩酶的浓度为100?200 ^ 8加1，含觀八酶的浓度为100?200 ^ 8加1。
9.根据权利要求1所述的骨骼肌脱细胞基质生物补片的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中冻干处理的方法为:置于-60?-501真空冷冻干燥机进行冻干18?24小时。
10.一种骨骼肌脱细胞基质生物补片，所述骨骼肌脱细胞基质生物补片根据权利要求1至9中任一项所述的方法制备得到。
【文档编号】A61L27/36GK104383601SQ201410604161
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】顾岩, 杨志, 杨建军, 宋致成, 聂鑫, 王恵春, 刘正尼 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院