专利名称：一种同种脱细胞真皮基质制备方法
技术领域：
本发明属于医学生物材料技术领域，具体涉及一种同种脱细胞真皮基质制备方法。
背景技术：
脱细胞真皮基质是将动物皮或人尸体皮肤，经一系列物理、化学方法，去除表皮和真皮中的细胞成分，保留极低免疫原性的真皮基质成分而得，其最早作为一种真皮替代物用于烧伤、创伤引起的真皮缺损替代修复，但其后研究发现该产品除可用于烧、创伤创面外，还可用于粘膜的修补及软组织充填，如口腔粘膜缺损修补、牙龈萎缩修复、鼻中隔修补、 鼓膜穿孔修补及美容医学领域等。公告号为CN201350162Y，名称为一种脱细胞异体真皮基质组织补片的专利， 公开了一种以脱细胞异体真皮基质为基膜，将其浸入黄芪甲苷中药溶液，使基膜至少一侧有黄芪甲苷中药层，但该专利对脱细胞异体真皮基膜的制备方法未做详述；公告号为 CN100372511C，名称为一种脱细胞真皮基质，该专利采用哺乳动物皮肤，用氢氧化钠溶液反复处理，去除组织中细胞遗传物质DNA，再用去污剂去除细胞膜中的脂类物质，该方法虽可制得脱细胞真皮基质，但是其制备过程繁琐，不能有效去除细胞碎屑成分；公告号为 CN1268401C，名称为一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，该方法采用健康动物皮为原料， 应用复合酶皮胶原处理剂和碱等多种化学物质处理制得脱细胞真皮基质，但是该方法易导致多种化学物质残留，影响植入后纤维血管组织长入，而且制备操作过程复杂，所需时间长；公开号为CN1176725C，名称为微孔异体(种)无细胞真皮替代物，公开了将人尸体皮采用传统酶消化、去垢剂浸泡的方法来制备无细胞真皮基质，但是该方法细胞内物质去除不彻底，易引起免疫原性物质残留。当前学者认为同种脱细胞真皮基质免疫原性弱，可以在宿主体内长期存留并发生组织改建，而异种脱细胞真皮基质抗原性明显强于同种脱细胞真皮基质。现有脱细胞真皮基质专利制备过程繁琐、耗时长，细胞碎屑去除不彻底。异种脱细胞真皮基质有较强的免疫原性。
发明内容
本发明主要针对目前的脱细胞真皮基质制备方法存在制备过程繁琐、耗时长、细胞碎屑去除不彻底、化学物质残留多等不足，而提供一种方法简单、耗时短、细胞成分去除彻底、化学物质残留少且增加胶原纤维间隙，提高植入后血管化速度的同种脱细胞真皮基质制备方法。本发明一种同种脱细胞真皮基质制备方法包括以下步骤
1)取皮选用人尸体皮为皮源，取带有表皮层和真皮层的断层皮片；
2)脱表皮层将断层皮片放入高渗盐水溶液中，在35 40°C恒温摇床中震荡16 24 小时，取出皮片，揭去表皮层，得真皮基质；3)去细胞成分将真皮基质放入十二烷基硫酸钠无菌生理盐水溶液中，在室温下超声处理0. 5 1小时，破碎细胞，并去除真皮中的细胞成分，得脱细胞真皮基质；
4)清洗将脱细胞真皮基质，用无菌生理盐水清洗2 5次；
5)修饰空间结构将清洗后的脱细胞真皮基质，放入胰蛋白酶无菌生理盐水溶液中，超声清洗20 30分钟；
6)二次清洗将步骤(5)所得的脱细胞真皮基质，用无菌磷酸盐缓冲溶液清洗；
7)灭菌将二次清洗后的脱细胞真皮基质拉网、封装，钴-60γ射线辐照灭菌，制得同种脱细胞真皮基质。其中所述的高渗盐水溶液为浓度为0. 5 2mol/L的氯化钠溶液。所述的十二烷基硫酸钠溶液的浓度为2. 5 7. 5g/L。所述的胰蛋白酶溶液的浓度为1. 0 2. 5g/L。所述的钴-60 γ射线辐照灭菌剂量为15 20kGy。为进一步表明本发明方法制备的同种脱细胞真皮基质的效果，本发明对同种(人) 脱细胞真皮基质和拉网辐照后的脱细胞真皮基质进行了图片对比、并对人皮肤组织学结构光镜(100倍)和同种(人)脱细胞真皮基质组织学结构的光镜(100倍)观察，结果表明，本方法所制备的脱细胞真皮基质完全去除了表皮和真皮中细胞成分，保留完整胶原支架结构； 本发明还对人皮肤和同种(人)脱细胞真皮基质进行了基底膜光镜观察(PAS染色，200倍)， 结果表明本发明制备的脱细胞真皮基质中含有丰富的中性黏多糖，PAS染色呈阳性反应，未破坏其基底膜结构；同时本发明还对人皮肤和同种(人)脱细胞真皮基质进行弹性纤维光镜 (Verhoeff' s染色，200倍)观察，结果表明脱细胞真皮基质内部弹性纤维结构保存完好。本发明与现有技术相比具有以下有益效果
1)本发明在脱细胞真皮基质制备过程中采用一定超声条件破碎细胞及超声清洗的方法，使制备的脱细胞真皮基质细胞成分去除彻底，并保留了完整胶原支架结构，降低其免疫原性；
2)本发明用胰蛋白酶溶液和一定的超声条件结合，修饰其空间结构，增加脱细胞真皮基质胶原纤维间隙，提高其植入后血管化速度；
3)本发明方法制备的脱细胞真皮基质中含有丰富的中性黏多糖，且其内部弹性纤维结构保存完好，PAS染色呈阳性反应，未破坏其基底膜结构，
4)本发明制备方法简单、耗时短。
图1为同种(人)脱细胞真皮基质图2为拉网、辐照的同种(人)脱细胞真皮基质图3为人正常皮肤组织学结构光学纤维镜观察(HEX 100)图4为同种(人)脱细胞真皮基质组织学结构光学显微镜观察(HEX 100)图5人正常皮肤基底膜光学纤维镜观察(PASX 200)图6为同种(人)脱细胞真皮基质基底膜光学纤维镜观察(PASX200)图7人正常皮肤弹性纤维光学纤维镜观察(Verhoeff ’ sX200)图8为同种(人)脱细胞真皮基质弹性纤维光学纤维镜观察(Verhoeff ’ sX200)图。
具体实施例方式实施例1
一种同种(人)脱细胞真皮基质制备方法包括以下步骤
1)取皮取捐献的健康人新鲜尸体皮，用鼓式取皮机取厚度为0.6mm的断层皮片；
2)脱表皮层将断层皮片裁剪为5cmX5cm IOcmX IOcm大小，放入浓度为0. 5mol/L 的氯化钠溶液中，在35°C恒温摇床中震荡16小时，取出皮片，揭去表皮层，得真皮基质；
3)去细胞成分将真皮基质放入浓度为2.5g/L的十二烷基硫酸钠无菌生理盐水溶液中，在室温下使用输出功率为250 500W，频率为20 26. 5KHz的超声仪超声处理0. 5小时，破碎细胞，并去除真皮中的细胞成分，得脱细胞真皮基质；
4)清洗将脱细胞真皮基质，用无菌生理盐水清洗2次；
5)修饰空间结构将清洗后的脱细胞真皮基质，放入浓度为1.Og/L的胰蛋白酶无菌生理盐水溶液中，使用输出功率为250 500W，频率为20 26. 5KHz的超声仪超声清洗20分钟，进一步去除细胞碎片，增加脱细胞真皮基质胶原纤维间隙，修饰其空间结构；
6)二次清洗将步骤(5)所得的脱细胞真皮基质，用无菌磷酸盐缓冲溶液清洗；
7)灭菌将二次清洗后的脱细胞真皮基质拉网、封装，用钴-60γ射线在15kGy辐照灭菌，制得同种脱细胞真皮基质产品。图1为本实施例制备的同种(人)脱细胞真皮基质图；图2为拉网辐照后的脱细胞真皮基质图；图3为人皮肤组织学结构光镜(100倍)观察图，图4为同种(人)脱细胞真皮基质组织学结构的光镜(100倍)观察图，结果表明，本方法所制备的脱细胞真皮基质完全去除了表皮和真皮中细胞成分，保留完整胶原支架结构；图5人皮肤基底膜光镜观察(PAS染色，200倍)图，图6为同种(人)脱细胞真皮基质基底膜光镜(PAS染色，200倍)观察图，结果表明本实施例皮肤基底膜因含有丰富的中性黏多糖，PAS染色呈阳性反应，无细胞真皮基质制备过程，未破坏其基底膜结构；图7为人皮肤弹性纤维光镜(Verhoeff ’ s染色，200倍) 观察图，图8为同种(人)脱细胞真皮基质弹性纤维光镜(Verhoeff ’ s染色，200倍)观察图， 结果表明脱细胞真皮基质内部弹性纤维结构保存完好。实施例2
一种同种(人)脱细胞真皮基质制备方法包括以下步骤
1)取皮取捐献的健康人新鲜尸体皮，用电动取皮刀取厚度为0.4mm的断层皮片；
2)脱表皮层将断层皮片裁剪为5cmX5cm IOcmX IOcm大小，放入浓度为lmol/L的氯化钠溶液中，在38°C恒温摇床中震荡20小时，取出皮片，揭去表皮层，得真皮基质；
3)去细胞成分将真皮基质放入浓度为5.Og/L的十二烷基硫酸钠无菌生理盐水溶液中，在室温下使用输出功率为250 500W，频率为20 26. 5KHz的超声仪超声处理0. 8小时，破碎细胞，并去除真皮中的细胞成分，得脱细胞真皮基质；
4)清洗将脱细胞真皮基质，用无菌生理盐水清洗3次；
5)修饰空间结构将清洗后的脱细胞真皮基质，放入浓度为1.5g/L的胰蛋白酶无菌生理盐水溶液中，使用输出功率为250 500W，频率为20 26. 5KHz的超声仪超声清洗25分钟，进一步去除细胞碎片，增加脱细胞真皮基质胶原纤维间隙，修饰其空间结构；
6)二次清洗将步骤(5)所得的脱细胞真皮基质，用无菌磷酸盐缓冲溶液清洗；
7)灭菌将二次清洗后的脱细胞真皮基质拉网、封装，用钴-60γ射线在15kGy辐照灭菌，制得同种脱细胞真皮基质产品。
实施例3
一种同种(人)脱细胞真皮基质制备方法包括以下步骤
1)取皮取捐献的健康人新鲜尸体皮，用鼓式取皮机取厚度为0.8mm的断层皮片；
2)脱表皮层将断层皮片裁剪为5cmX5cm IOcmX IOcm大小，放入浓度为0. 5mol/L 的氯化钠溶液中，在40°C恒温摇床中震荡24小时，取出皮片，揭去表皮层，得真皮基质；
3)去细胞成分将真皮基质放入浓度为7.5g/L的十二烷基硫酸钠无菌生理盐水溶液中，在室温下使用输出功率为250 500W，频率为20 26. 5KHz的超声仪超声处理0. 5小时，破碎细胞，并去除真皮中的细胞成分，得脱细胞真皮基质；
4)清洗将脱细胞真皮基质，用无菌生理盐水清洗5次；
5)修饰空间结构将清洗后的脱细胞真皮基质，放入浓度为2.5g/L的胰蛋白酶无菌生理盐水溶液中，使用输出功率为250 500W，频率为20 26. 5KHz的超声仪超声清洗30分钟，进一步去除细胞碎片，增加脱细胞真皮基质胶原纤维间隙，修饰其空间结构；
6)二次清洗将步骤(5)所得的脱细胞真皮基质，用无菌磷酸盐缓冲溶液清洗；
7)灭菌将二次清洗后的脱细胞真皮基质拉网、封装，用钴-60γ射线在20kGy辐照灭菌，制得同种脱细胞真皮基质产品。
权利要求
1.一种同种脱细胞真皮基质制备方法，其特征是包括以下步骤1)取皮选用人尸体皮为皮源，取带有表皮层和真皮层的断层皮片；2)脱表皮层将断层皮片放入高渗盐水溶液中，在35 40°C恒温摇床中震荡16 24 小时，取出皮片，揭去表皮层，得真皮基质；3)去细胞成分将真皮基质放入十二烷基硫酸钠无菌生理盐水溶液中，在室温下超声处理0. 5 1小时，破碎细胞，并去除真皮中的细胞成分，得脱细胞真皮基质；4)清洗将脱细胞真皮基质，用无菌生理盐水清洗2 5次；5)修饰空间结构将清洗后的脱细胞真皮基质，放入胰蛋白酶无菌生理盐水溶液中，超声清洗20 30分钟；6)二次清洗将步骤(5)所得的脱细胞真皮基质，用无菌磷酸盐缓冲溶液清洗；7)灭菌将二次清洗后的脱细胞真皮基质拉网、封装，钴-60γ射线辐照灭菌，制得同种脱细胞真皮基质。
2.根据权利要求1所述的一种同种脱细胞真皮基质制备方法，其特征是所述的高渗盐水溶液为浓度为0. 5 2mol/L的氯化钠溶液。
3.根据权利要求1所述的一种同种脱细胞真皮基质制备方法，其特征是所述的十二烷基硫酸钠溶液的浓度为2. 5 7. 5g/L。
4.根据权利要求1所述的一种同种脱细胞真皮基质制备方法，其特征是所述的胰蛋白酶溶液的浓度为1. 0 2. 5g/L。
5.根据权利要求1所述的一种同种脱细胞真皮基质制备方法，其特征是所述的钴-60 Y射线辐照灭菌剂量为15 20kGy。
全文摘要
本发明属于医学生物材料技术领域，具体涉及一种同种脱细胞真皮基质制备方法。本发明主要解决目前的脱细胞真皮基质制备方法存在制备过程繁琐、耗时长、细胞碎屑去除不彻底、化学物质残留多等不足。本发明一种同种脱细胞真皮基质制备方法包括以下步骤1)取皮；2)脱表皮层将断层皮片放入高渗盐水溶液中震荡，揭去表皮层得真皮基质；3)去细胞成分将真皮基质放入十二烷基硫酸钠无菌生理盐水溶液中超声处理破碎细胞，得脱细胞真皮基质；4)清洗；5)修饰空间结构将清洗后的脱细胞真皮基质放入胰蛋白酶无菌生理盐水溶液中超声清洗；6)二次清洗；7)灭菌。本发明具有方法简单、耗时短、细胞成分去除彻底、提高植入后血管化速度等优点。
文档编号A61L27/36GK102218162SQ20111013451
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月24日 优先权日2011年5月24日
发明者李宝兴, 李宝明, 马绍英 申请人:山西奥瑞生物材料有限公司